[柑橘黄酮中总黄酮及橙皮苷的含量测定] 总黄酮和黄酮的区别.docx

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1、柑橘黄酮中总黄酮及橙皮苷的含量测定 总黄酮和黄酮的区别 摘要：目的：建立柑橘黄酮中总黄酮及橙皮苷的含量测定方法。方法：采纳分光光度法，以芦丁为比照品，测定总黄酮的含量，检测波长为500nm。采纳高效液相色谱法测定橙皮苷的含量，色谱柱：Agilent ZORBAX c。(150ram x4.6mm,5um)；乙腈0.1磷酸(22：78)为流淌相，检测波长为284nm，流速1mlmin。结果：分光光度法测定柑橘总黄酮在8.04848.288mgL(r=O.9999)的浓度范围内线性关系良好，加样回收率为101.9。ItPLC法测定橙皮苷在0.016080.402gL(r=1.0000)范围内线性关

2、系良好，加样回收率为101.6。结论：两种方法均精确、重现性好。适用于柑橘黄酮的质量限制。 关键词：柑橘黄酮；橙皮苷；紫外分光光度法；高效液相色谱法 中图分类号：R284 文献标识码：A文章编号：16737717(2008)01004402 柑橘是芸香科柑橘属植物的成熟果实，其干燥果皮是药材陈皮，具有理气健脾、燥湿化痰作用。柑橘在我国有特别丰富的资源，簇新柑橘皮中含有丰富的黄酮类物质成分，药理学探讨表明黄酮成分是其有效活性成分。具有抗炎、抗氧化、抗过敏作用以及降低血液和肝脏中胆固醇的作用。柑橘黄酮(Citrus Flavonoids，cf)中主要成分橙皮苷(hesperidin)属二氢黄酮苷化

3、合物，具有防止心脑血管疾病的作用，临床上用于防治支气管炎。本文通过用分光光度法及HPLC法测定大孔树脂法提取的柑橘黄酮中总黄酮及橙皮苷的含量，为柑橘黄酮的质量限制供应试验依据。 1材料与仪器 UV260紫外可见分光光度仪(日本Shimadzu)；LC2010AHT(日本，$hlmadzu)；LCSolution工作站；柑橘黄酮(citrus Flavonoids，cf)由金华贝康生物科技开发有限公司供应(大孔树脂吸附法提取)；芦丁比照品(中国药品生物制品鉴定所，00809705)；橙皮苷(hespeadin)比照品(中国药品生物制品鉴定所，110721200512)；甲醇、乙腈为色谱纯，其它试

4、剂均为分析纯。 2方法与结果 2.1总黄酮的含量测定 2.1.1比照品溶液的制备称取在120干燥至恒重的芦丁比照品50.3mg，置25mL容量瓶中，加甲醇适量，振摇溶解后，定容至刻度，摇匀。精密量取10mL，置100mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。 2.1.2标准曲线制备精密量取比照溶液1.0、2.O、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置25mL量瓶中，各加水至6mL，加5亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6min，加10硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL(4.3g100ral)，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，在500nm波特长测定吸光度

5、，以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为A=10.89534C1.410，r=0.9999，在8.04848.288mgL的浓度范围内线性关系良好。 2.1.3加样回收率试验称取cf细粉0.1052g置50mL量瓶中，加甲醇约25mL，超声3rain，加甲醇稀释至刻度，摇匀，吸取2.0mL至25mL的容量瓶中，共9份，按低、中、高浓度分别加入2.1.1项下的比照品溶液2.0、2.5、3.0mL.按2.1.2项下自“加水至6mL起”同法处理。计算加样回收率，平均加样回收率为101.9(n=6，RSD为0.4)。 2.1.4精密度试验取比照品溶液及样品溶液，于500nm处

6、，以相应试剂为空白，测定汲取度A，每隔15rain测1次，连续测定1h，结果显示RSD为0.2。表明显色后在1h内保持稳定。 2.1.5柑橘黄酮中总黄酮含量的测定精密称取cf细粉0.1g，置50mL量瓶中，加甲醇约25mL，超声3mln，加甲醇稀释至刻度，摇匀，吸取4.0mL至25mL的容量瓶中，按2.1.3项下处理，得到的cf样品液，于500nm处测定汲取度A，计算总黄酮含量，平均含量为12.3(n=3，RSD为0.1)。 2.2橙皮苷的含量测定 2.2.1色谱条件与系统适用性考察色谱柱：AglientZORBAX C zs(150ram4.6mm，5um)；乙腈0.1磷酸(22：78)为流

7、淌相，检测波长为284nm，柱温35，流速lmLmin，进样量：10ul。橙皮苷与其它峰的分别度不得低于1.5。结果见图1。 2.2.2标准曲线的制备精密吸取浓度为0.804L的橙皮苷比照品贮备液1.0、2.0、5.0、12.5mL，分别置25mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，以及比照品贮备液，共5个浓度，于上述色谱条件下进样分析，外标法定量，记录色谱图，以峰面积A为纵坐标，以浓度c(gL)为横坐标，进行回来得回来方程A=1.78310c62.74，r=1.0000，在0.016080.402gL的浓度范围内线性关系良好。 2.2.3样品溶液配制精密称取Cf细粉0.1g，置50mL容量瓶中，加

8、甲醇约25mL，超声3min溶解，放冷后，用甲醇定容至刻度，摇匀，以孔径0.45p,in微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。 2.2.4精密度试验取橙皮苷比照品溶液在上述色谱条件下连续进样6次，其峰面积的ILSD为0.8。 2.2.5稳定性试验取比照品溶液及同一供试品溶液，于0、1、2、4、6、8h分别进样测定峰面积，RSD分别为1.2和1.5。表明室温下保存的比照品溶液及样品溶液在8h内稳定性良好。 2.2.6加样回收率试验称取已知橙皮苷含量的cf细粉25mg，精密称定6份，分别置10mL容量瓶中，分别加入橙皮苷比照品溶液(0.2573gL)4.5、5.5、6.5mL，按2.2.3项下供试品溶液制

9、备方法配制，同法测定，计算得平均回收率为101.6(n=6，ILSD为1.2)。结果见表l。从表1可见，该方法回收率满意测定要求。 2.2.7样品处理方法考察精密称取cf细粉0.1g。置50mL量瓶中，加入甲醇约25mL，超声2、3、5rain助溶，考察不同超声时间对待测成分溶解的影响，放冷后用甲醇定容，摇匀，以0.45um微孔滤膜过滤，于色谱条件下进样分析，记录色谱图，计算含量。结果表明，超声3min即可使待测成分完全溶解。 2.2.8柑橘黄酮中橙皮苷含量测定精密称取cf细粉0.1g，置50mL量瓶中，按2.2.3项下处理后按上述色谱条件，外标法定量，计算柑橘黄酮中橙皮苷平均含量为5.72(

10、n=6，RSD 1.3)。 3探讨 由于黄酮类成分均有2苯基色原酮为母核的结构，而芦丁也有此结构，因此以芦丁为比照测定柑橘黄酮中总黄酮的含量，显色条件及波长的选定均参考了文献6中总黄酮测定的条件。 HPLC法波长的选择参考了文献中橙皮苷的波长确定，流淌相的选择曾采纳甲醇一水一冰醋酸(38：58：4)，但橙皮苷与相邻峰达不到基线分别，后改为乙腈0.1磷酸(22：78)，两个样品峰能达到基线分别，分别度达到6.6。 由于样品本身是提取物，样品不需前处理及进一步纯化，方法简洁，而且用水提取样品与用甲醇提取样品的总黄酮含量结果一样。 保留时间为8.0rain的峰，由于检测条件有限，有待进一步确定成分。