基因克隆载体PPT课件.ppt

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1、关于基因克隆载体关于基因克隆载体第一张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月定义定义基因工程中携带外源基因进入受体细胞的基因工程中携带外源基因进入受体细胞的基因工程中携带外源基因进入受体细胞的基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具运载工具运载工具运载工具”。也称。也称。也称。也称DNADNADNADNA克隆克隆克隆克隆载体。载体。载体。载体。必备条件必备条件1 1 1 1、克隆位点、克隆位点、克隆位点、克隆位点(一个或多个一个或多个一个或多个一个或多个)2 2 2 2、能携带外源、能携带外源、能携带外源、能携带外源DNADNADNADNA片段进入受体细胞片段进入受体细胞片段进入受

2、体细胞片段进入受体细胞:能自我复制，或整入染色体随受体能自我复制，或整入染色体随受体能自我复制，或整入染色体随受体能自我复制，或整入染色体随受体细胞细胞细胞细胞DNADNADNADNA复制而复制。复制而复制。复制而复制。复制而复制。3 3 3 3、有选择克隆子的标记基因、有选择克隆子的标记基因、有选择克隆子的标记基因、有选择克隆子的标记基因4 4 4 4、安全性、安全性、安全性、安全性(不含损害受体的基因不含损害受体的基因不含损害受体的基因不含损害受体的基因,不任意转入别的不任意转入别的不任意转入别的不任意转入别的,尤其人的细胞尤其人的细胞尤其人的细胞尤其人的细胞)意义：意义：基因工程随载体系

3、统的建立而兴起，构建新载体一直是基础基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域。研究的优先领域。研究的优先领域。研究的优先领域。第二张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月按克隆载体的来源分：按克隆载体的来源分：按克隆载体的来源分：按克隆载体的来源分：质粒质粒病毒或噬菌体病毒或噬菌体病毒或噬菌体病毒或噬菌体质粒与病毒或噬菌体质粒与病毒或噬菌体质粒与病毒或噬菌体质粒与病毒或噬菌体DNADNA组成的组成的质粒与染色体质粒与染色体质粒与染色体质粒与染色体DNADNAD

4、NADNA片段组成的片段组成的片段组成的片段组成的按应用范围分：按应用范围分：表达型表达型 启动子探针型启动子探针型 cDNA cDNA 按应用对象分：按应用对象分：原核生物原核生物 植物植物 动物动物 分分 类类第三张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月.质粒克隆载体质粒克隆载体定义：定义：定义：定义：以质粒以质粒DNADNA为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、建立基因组文库和建立基因组文库和建立基因组文库和建立基因组文库和c D

5、NAc DNA基因文库。基因文库。基因文库。基因文库。一、质粒适于载体构建的性一、质粒适于载体构建的性一、质粒适于载体构建的性一、质粒适于载体构建的性质质质质、组成与构型、组成与构型、组成与构型、组成与构型是染色体外裸露的双链是染色体外裸露的双链是染色体外裸露的双链是染色体外裸露的双链DNADNADNADNA分子分子分子分子（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）第四张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月构型：构型：l-DNAl-DNAl-DNAl-DNAoc-DNAoc-DNAccc-DNAccc-DNA第五张，PPT共

6、一百四十七页，创作于2022年6月、分子大小：、分子大小：100102 kb、复制、复制特点：在宿主细胞内；特点：在宿主细胞内；单向；单向；质粒和宿主细胞双重遗传系统控制质粒和宿主细胞双重遗传系统控制第六张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月复制(Replication)质粒的复制起始和拷贝数是由质粒DNA序列控制的。质粒分子中为质粒复制所必需的最小区段称为基本复制子，它由两部分组成，一是复制原点(ori)，二是调节复制起始的基因（编码蛋白质或RNA)。第七张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值）复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体

7、数量之比值）复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值）复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值）（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定严紧控制型：严紧控制型：严紧控制型：严紧控制型：1数个拷贝；大质粒数个拷贝；大质粒数个拷贝；大质粒数个拷贝；大质粒松驰控制型：松驰控制型：1010个以上拷贝；小质粒。个以上拷贝；小质粒。经氯霉素处理，经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达拷贝数达拷贝数达拷贝数达3000个）。个）。第八

8、张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月、质粒的不亲合性、质粒的不亲合性、质粒的不亲合性、质粒的不亲合性n n亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒n n意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲

9、和性质粒，意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒最好不含内源性质粒最好不含内源性质粒最好不含内源性质粒、质粒迁移、质粒迁移、质粒迁移、质粒迁移（）接合质粒：（）接合质粒：（）接合质粒：（）接合质粒：含含含含tratratratra基因基因基因基因合成细胞表面物质（鞭毛）合成细胞表面物质（鞭毛）合成细胞表面物质（鞭毛）合成细胞表面物质（鞭毛）质粒质粒质粒质粒DNADNADNADNA入受体细胞入受体细胞入受体细胞入受体细胞含含含含tratratratra基因的质粒称为基因的质粒称为基因的质粒称为基因

10、的质粒称为接合质粒接合质粒接合质粒接合质粒。如。如。如。如F F F F、TiTiTiTi等等等等不含不含不含不含tratratratra基因的质粒称为基因的质粒称为基因的质粒称为基因的质粒称为非接合质粒非接合质粒非接合质粒非接合质粒。如。如。如。如ColE1ColE1ColE1ColE1、pPbSpPbSpPbSpPbS等等等等第九张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月（）迁移作用（）迁移作用不含不含不含不含tratra基因而含基因而含基因而含基因而含bombombombom（oriorioriori）位点的质粒，当宿主细胞存在）位点的质粒，当宿主细胞存在辅助质粒辅助质粒mobmob

11、基因基因产物时，即可打开产物时，即可打开oriorioriori位点，非结合质粒位点，非结合质粒借助借助接合质粒接合质粒tratra基因基因的产物而迁移入受体细胞。这种现象称的产物而迁移入受体细胞。这种现象称的产物而迁移入受体细胞。这种现象称的产物而迁移入受体细胞。这种现象称质质粒粒的的迁迁移移作作用用第十张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月、显性质粒和隐蔽质粒、显性质粒和隐蔽质粒、显性质粒和隐蔽质粒、显性质粒和隐蔽质粒n n宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表宿主因含某种质粒而呈现

12、出新的性状，称为显性（表达型）质粒。达型）质粒。达型）质粒。达型）质粒。n n显性质粒显性质粒质粒：质粒：含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素ApApApAp、氯霉素、氯霉素CmCmCmCm、卡那、卡那霉素霉素KmKm、四环素、四环素、四环素、四环素TcTcTcTc、链霉素、链霉素、链霉素、链霉素SmSmSmSm等药物的抗性基因，等药物的抗性基因，等药物的抗性基因，等药物的抗性基因，可作为选择标记。可作为选择标记。可作为选择标记。可作为选择标记。ColCol质粒质粒质粒质粒降解质粒降解质粒i i质粒质粒n n隐蔽质粒隐蔽质粒蓝藻内源质粒蓝藻内源质粒蓝藻内源质粒蓝藻内源质粒第

13、十一张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月二、二、二、二、理想质粒载体的必备条件理想质粒载体的必备条件理想质粒载体的必备条件理想质粒载体的必备条件、能进行有效复制、能进行有效复制、能进行有效复制、能进行有效复制复制起始位点（最好是多拷贝）复制起始位点（最好是多拷贝）复制起始位点（最好是多拷贝）复制起始位点（最好是多拷贝）、克隆位点、克隆位点、克隆位点、克隆位点组装组装组装组装MCSMCSMCSMCS连杆连杆连杆连杆、选择标记基因、选择标记基因、选择标记基因、选择标记基因抗性基因，抗性基因，抗性基因，抗性基因，Lac ZLac ZLac ZLac Z基因基因基因基因、分子尽可能小（转化率

14、高），、分子尽可能小（转化率高），、分子尽可能小（转化率高），、分子尽可能小（转化率高），15kb15kb15kb15kb，转化率，转化率，转化率，转化率、组装各种、组装各种、组装各种、组装各种“元件元件元件元件”，如启动子、终止子等，如启动子、终止子等，如启动子、终止子等，如启动子、终止子等第十二张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月三、质粒载体构建三、质粒载体构建n n过程过程过程过程：严密的实验设计：严密的实验设计：严密的实验设计：严密的实验设计构建（切割、修饰和连接重组）构建（切割、修饰和连接重组）构建（切割、修饰和连接重组）构建（切割、修饰和连接重组）n n构建原则构建原则1

15、 1 1 1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如oriorioriori、选择标记、克隆位点、启动子、选择标记、克隆位点、启动子、选择标记、克隆位点、启动子、选择标记、克隆位点、启动子和终止子和终止子和终止子和终止子2 2 2 2、正确获得构建质粒克隆载体的元件、正确获得构建质粒克隆载体的元件、正确获得构建质粒克隆载体的元件、正确获得构建质粒克隆载体的元件3 3 3 3、组装合适的选择标记基因、组装合适的选择标记基因、组装合适的选择标记基因、组装合适的选择标记基因4 4 4 4、

16、选用合适的启动子、选用合适的启动子、选用合适的启动子、选用合适的启动子5 5 5 5、构建过程力求简单、构建过程力求简单、构建过程力求简单、构建过程力求简单n n代表性实例。代表性实例。代表性实例。代表性实例。第十三张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月（一）（一）pBR322pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建及其衍生质粒克隆载体的构建、pBR322pBR322构建构建n n质粒载体命名法则质粒载体命名法则质粒载体命名法则质粒载体命名法则“pBR322”pBR322”pBR322”pBR322”p p p p：质粒（：质粒（：质粒（：质粒（plasmid)plasmid)plasm

17、id)plasmid)BRBRBRBR：两位主要构建者：两位主要构建者：两位主要构建者：两位主要构建者322322322322：实验编号：实验编号：实验编号：实验编号pSC101pSC101pSC101pSC101（最早用于（最早用于（最早用于（最早用于DNADNADNADNA克隆的载体），严紧型克隆的载体），严紧型克隆的载体），严紧型克隆的载体），严紧型ColE1ColE1ColE1ColE1 松驰型松驰型松驰型松驰型 ，筛选系统复杂，筛选系统复杂，筛选系统复杂，筛选系统复杂第十四张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月第十五张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月n n构建过程

18、构建过程构建过程构建过程(出发质粒：出发质粒：pMB1pMB1)第十六张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月R1R1R1R1（沙门氏菌中分离）（沙门氏菌中分离）（沙门氏菌中分离）（沙门氏菌中分离）变异变异变异变异 R1drd19 R1drd19 R1drd19 R1drd19（含易位子（含易位子（含易位子（含易位子Tn3 ApTn3 ApTn3 ApTn3 Apr r r r）R1drd19 Tn3 R1drd19 Tn3 R1drd19 Tn3 R1drd19 Tn3 pSF2124pSF2124 ColE1 ColE1 ColE1 ColE1 n npBR322pBR322pBR3

19、22pBR322的三个亲本：的三个亲本：pMB1pMB1、pSF2124pSF2124、pSC101pSC101n n识别位点：识别位点：识别位点：识别位点：ApApApApr r基因区（基因区（3 3 3 3个个 ）：）：PstPst、Sca Sca 、Pvu Pvu TcTcr r基因区（基因区（基因区（基因区（7 7 7 7个个 ）：）：BamH BamH BamH BamH 、Scal Scal 、EcoREcoR、Sph Sph 、Nhe Nhe 、Nru Nru 、XmaXmaTcTcTcTcr r启动子区（启动子区（启动子区（启动子区（2 2 2 2个个个个 ）：）：）：）：Cl

20、a Cla 、HindHindHindHindn npBR322pBR322分子大小：分子大小：4363bp4363bp第十七张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月第十八张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月第十九张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月3 3、优点、优点（1 1）较小的分子量）较小的分子量10kb10kb以内以内DNADNA分子纯化过程中可避免断裂，分子纯化过程中可避免断裂，pBR322pBR322易于自身纯化，且可克隆易于自身纯化，且可克隆6kb6kb左右的外源左右的外源DNADNA（2 2）较高的拷贝数）较高的拷贝数经氯霉素扩培后达经氯霉素扩培后达1

21、00010003000 copys/cell 3000 copys/cell （3 3）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。插入失活（图解）标记。插入失活（图解）第二十张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月第二十一张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月、pUC18/19pUC18/19质粒载体质粒载体n n与与与与pBR322pBR322pBR322pBR322区别：乳糖操纵子的一个区别：乳糖操纵子的一个区别：乳糖操纵子的一个区别：乳糖操纵子的一个DNADNADNADNA片段（片段（片段（片段（lac Zlac Zlac Zl

22、ac Z基因）基因）基因）基因）替换替换替换替换TcTcTcTcr r r r基基基基因；组装了一个多克隆位点（因；组装了一个多克隆位点（因；组装了一个多克隆位点（因；组装了一个多克隆位点（MCSMCSMCSMCS）连杆）连杆）连杆）连杆n n命名命名命名命名p UCUniversity of Californiap UCUniversity of Californiap UCUniversity of Californiap UCUniversity of California的科学家首先构建。图的科学家首先构建。图的科学家首先构建。图的科学家首先构建。图3-33-33-33-3。pUCpU

23、CpUCpUC包括四个组成部分：包括四个组成部分：包括四个组成部分：包括四个组成部分：（1 1 1 1）pBR322pBR322pBR322pBR322的复制起点的复制起点的复制起点的复制起点(ori)(ori)(ori)(ori)（2 2 2 2）ApApApApr r r r基因，但基因，但基因，但基因，但DNADNADNADNA序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点别位点别位点别位点 （3 3 3 3）lacZlacZlacZlacZ基因基因基因基因 （4 4

24、4 4）在）在）在）在lacZlacZlacZlacZ基因基因基因基因 内部靠近内部靠近内部靠近内部靠近5555端有一段端有一段端有一段端有一段MCSMCSMCSMCS连杆连杆连杆连杆第二十二张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月第二十三张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月4 4 4 4、pBR322pBR322pBR322pBR322衍生的质粒衍生的质粒 缺失缺失缺失缺失bombombombom位点位点位点位点 pBR325pBR325pBR325pBR325、pBR327pBR327pBR327pBR327，不具被动迁移作用，不具被动迁移作用，不具被动迁移作用，不具被动迁

25、移作用 再移去再移去再移去再移去HaeHaeHaeHae片段片段片段片段pAT153pAT153pAT153pAT153 均更安全均更安全均更安全均更安全第二十四张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月n nLac ZLac Z筛选机制：筛选机制：含乳糖操纵子的启动子、调节因子和含乳糖操纵子的启动子、调节因子和含乳糖操纵子的启动子、调节因子和含乳糖操纵子的启动子、调节因子和-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N N N端端端端146146146146残基残基残基残基(-(-(-(-肽肽肽肽)合成有活性的合成有活性的合成有活性的合成有活性的 基因基因基因基因（lac Zl

26、ac Zlac Zlac Z）的质粒载体引入可编）的质粒载体引入可编）的质粒载体引入可编）的质粒载体引入可编 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶 码码码码C C C C端部分残基的宿主端部分残基的宿主端部分残基的宿主端部分残基的宿主(与与与与Lac ZLac ZLac ZLac Z互补互补互补互补 的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌)在含在含在含在含IPTGIPTGIPTGIPTG（异丙基（异丙基（异丙基（异丙基-D-D-D-D-硫代半乳糖苷）和硫代半乳糖苷）和硫代半乳糖苷）和硫代半乳糖苷）和 X-galX-galX-galX-gal（5-5-5-5-溴溴溴溴-4-4-4-4-氯

27、氯氯氯-3-3-3-3-吲哚吲哚吲哚吲哚-D-D-D-D-半乳糖）半乳糖）半乳糖）半乳糖）蓝色菌落蓝色菌落的诱导培养基上培养的诱导培养基上培养的诱导培养基上培养的诱导培养基上培养 在在在在N N N N端端端端-肽的编码区插入肽的编码区插入肽的编码区插入肽的编码区插入MCS MCS MCS MCS 不影响不影响不影响不影响lac Zlac Zlac Zlac Z基因功能基因功能基因功能基因功能 插入外源插入外源插入外源插入外源DNA DNA DNA DNA 灭活灭活灭活灭活lac Zlac Zlac Zlac Z基因基因基因基因 白色菌落白色菌落白色菌落白色菌落第二十五张，PPT共一百四十七页

28、，创作于2022年6月第二十六张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月n npUCpUC质粒载体的优点质粒载体的优点（1 1 1 1）分子量更小、拷贝数更高）分子量更小、拷贝数更高（2 2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时（3 3 3 3）MCSMCS区方便转移外源区方便转移外源区方便转移外源区方便转移外源DNADNADNADNA在不同载体系列中在不同载体系列中在不同载体系列中在不同载体系列中 “穿梭穿梭”，使具有两种不同粘末端的外源，使具有两种不同粘末端的外源DNADNA 能直接克隆入能直接克隆入p UCp UC载体载体载体载体第二十七张，

29、PPT共一百四十七页，创作于2022年6月（二）蓝藻质粒克隆载体（二）蓝藻质粒克隆载体pPKE2pPKE2的构建的构建大肠杆菌质粒不能转化蓝藻大肠杆菌质粒不能转化蓝藻蓝藻内的质粒属隐蔽质粒蓝藻内的质粒属隐蔽质粒即：即：大肠杆菌源质粒复制起始点大肠杆菌源质粒复制起始点 +蓝藻源质粒复制起始点。蓝藻源质粒复制起始点。pPbs（1511bp）pPbs Cla 重组重组 pPRS-1 多次亚克隆多次亚克隆 pPKE-2pBR322 组装组装组装组装CaMV35sCaMV35sCaMV35sCaMV35s启动子、启动子、启动子、启动子、MCSMCSMCSMCS、rbcSrbcSrbcSrbcS终止子、终

30、止子、终止子、终止子、KmKmKmKmr r r r基因基因基因基因（图（图3-5）构建穿梭质粒构建穿梭质粒第二十八张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月第二十九张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月（三）农杆菌（三）农杆菌（三）农杆菌（三）农杆菌TiTi质粒克隆载体的构建质粒克隆载体的构建 TiTi质粒质粒：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称Tumor Tumor Tumor Tumor inducing

31、plasmidinducing plasmidinducing plasmidinducing plasmid（TiTiTiTi质粒）。双链环状质粒）。双链环状质粒）。双链环状质粒）。双链环状DNADNADNADNA分子，分子，分子，分子，200200200200250kb250kb250kb250kb。1 1 1 1、4 4个功能区：个功能区：个功能区：个功能区：T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA区、区、VirVirVirVir区、区、ConConConCon区、区、OriOriOriOri区区（1 1 1 1）T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA区区TiTiTiTi质粒进入植物细

32、胞的约质粒进入植物细胞的约质粒进入植物细胞的约质粒进入植物细胞的约25kb25kb25kb25kb部分，即部分，即部分，即部分，即T-DNA T-DNA T-DNA T-DNA（transfer DNA)transfer DNA)transfer DNA)transfer DNA)。左右边界各有一个左右边界各有一个左右边界各有一个左右边界各有一个25bp25bp25bp25bp正向重复序列（正向重复序列（正向重复序列（正向重复序列（LTSLTSLTSLTS和和和和RTSRTSRTSRTS）称为）称为）称为）称为边界序列边界序列边界序列边界序列，为，为，为，为T-DNAT-DNAT-DNAT-D

33、NA的转移和整合所必需。只要保留的转移和整合所必需。只要保留的转移和整合所必需。只要保留的转移和整合所必需。只要保留T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA的边界序列，中间序列被的边界序列，中间序列被的边界序列，中间序列被的边界序列，中间序列被外源外源外源外源DNADNADNADNA片段替换，仍可转移整合到植物基因组中。片段替换，仍可转移整合到植物基因组中。片段替换，仍可转移整合到植物基因组中。片段替换，仍可转移整合到植物基因组中。这是这是这是这是TiTiTiTi质粒用于遗传转化的理论依据。质粒用于遗传转化的理论依据。质粒用于遗传转化的理论依据。质粒用于遗传转化的理论依据。用野生型用野生型用野

34、生型用野生型TiTiTiTi质粒获得的转基因植物细胞只能分裂，不能分化质粒获得的转基因植物细胞只能分裂，不能分化质粒获得的转基因植物细胞只能分裂，不能分化质粒获得的转基因植物细胞只能分裂，不能分化为植株，故不能直接选育转基因植物。为植株，故不能直接选育转基因植物。为植株，故不能直接选育转基因植物。为植株，故不能直接选育转基因植物。第三十张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月（2 2 2 2）VirVirVirVir区区区区位于位于T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA区上游，其表达产物可激活区上游，其表达产物可激活T-DNAT-DNA的转移，显示的转移，显示的转移，显示的转移，显示致

35、瘤性。致瘤性。致瘤性。致瘤性。（3 3 3 3）ConCon区区含有农杆菌之间接合转移有关的基因（含有农杆菌之间接合转移有关的基因（含有农杆菌之间接合转移有关的基因（含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)tra)tra)tra)，可受宿主产，可受宿主产生的冠瘿碱活化，使生的冠瘿碱活化，使TiTi质粒在细菌间转移，也即接合转移基质粒在细菌间转移，也即接合转移基质粒在细菌间转移，也即接合转移基质粒在细菌间转移，也即接合转移基因编码区。因编码区。因编码区。因编码区。（4 4 4 4）OriOriOriOri区区区区复制起始区，调控复制起始区，调控TiTi质粒自我复制。质粒自我复制。TiTi质粒克

36、隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介作质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介作质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介作质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介作用。用。用。用。第三十一张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月2 2、构建途径、构建途径（1 1 1 1）取代型载体。）取代型载体。用大肠杆菌质粒克隆载体取代用大肠杆菌质粒克隆载体取代用大肠杆菌质粒克隆载体取代用大肠杆菌质粒克隆载体取代TiTiTiTi质粒的全部或部分质粒的全部或部分质粒的全部或部分质粒的全部或部分T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA序序序序列列列列而构建。外源基因以

37、同源而构建。外源基因以同源而构建。外源基因以同源而构建。外源基因以同源交换而重组。交换而重组。交换而重组。交换而重组。OncOncOncOnc-TiTiTiTi：T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA上的上的上的上的onconconconc基基基基因被取代而构建。因被取代而构建。因被取代而构建。因被取代而构建。OncOncOncOnc+TiTiTiTi：pBR322pBR322pBR322pBR322取代取代取代取代 T-T-T-T-DNADNADNADNA的部分序列但保留的部分序列但保留的部分序列但保留的部分序列但保留onconconconc基因基因基因基因而构建。进入植物细胞诱发冠而构建

38、。进入植物细胞诱发冠而构建。进入植物细胞诱发冠而构建。进入植物细胞诱发冠瘿瘤。瘿瘤。瘿瘤。瘿瘤。第三十二张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月（2 2 2 2）中间质粒克隆载体）中间质粒克隆载体）中间质粒克隆载体）中间质粒克隆载体T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。共整合克隆载体系统（共整合克隆载体系统（共整合克隆载体系统（共整合克隆载体系统（T-DNAT-DNAT-DNAT-DNA同源序列、同源序列、同源序列、同源序列、bom b

39、om bom bom 位点）位点）位点）位点）双元克隆载体系统双元克隆载体系统双元克隆载体系统双元克隆载体系统微型微型微型微型TiTiTiTi质粒质粒质粒质粒第三十三张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月3 32 2病毒（噬菌体）克隆载体病毒（噬菌体）克隆载体病毒基本结构：病毒基本结构：病毒基本结构：病毒基本结构：DNADNADNADNA（或（或（或（或RNARNA）+外壳蛋白外壳蛋白外壳蛋白外壳蛋白感染细菌的病毒，称为感染细菌的病毒，称为感染细菌的病毒，称为感染细菌的病毒，称为噬菌体噬菌体。分类分类分类分类（根据病毒与宿主的关系）：（根据病毒与宿主的关系）：（根据病毒与宿主的关系）：

40、（根据病毒与宿主的关系）：温和性病毒：温和性病毒：温和性病毒：温和性病毒：溶原性增殖溶原性增殖构建病毒载体构建病毒载体构建病毒载体构建病毒载体烈性病毒：烈性病毒：烈性病毒：烈性病毒：溶菌性增殖溶菌性增殖溶菌性增殖溶菌性增殖改造后改造后改造后改造后第三十四张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月n n噬菌体噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名叫做 Bacteriophage（简称 phage）。它的DNA分子除了复制起点分子除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。之外，还有编码外壳蛋白质的基因。n n如同质粒分子一样，噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的DNA。n n噬菌斑噬菌斑，即感染的细

41、菌细胞被噬菌体裂解之后留下的空斑。第三十五张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月第三十六张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月第三十七张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月分离重组体噬菌体的基本过程n n首先是使用无菌消毒的金属接种针，粘着少量的噬菌体颗粒，转移到新鲜的细菌培养基中，使其在感染的细胞内大量地增殖。n n采用密度梯度离心法，便可非常容易地纯化出噬菌体的颗粒。第三十八张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月第三十九张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月一、噬菌体克隆载体n n噬菌体，一种大肠杆菌双链噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。噬菌体。

42、n n噬菌体的分子量为噬菌体的分子量为 31 106dal，是一种中等大小的，是一种中等大小的温和噬菌体。温和噬菌体。第四十张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月噬菌体基因组的结构噬菌体基因组的结构n n在在在在 噬菌体线性双链噬菌体线性双链噬菌体线性双链噬菌体线性双链 DNADNA分子的两端，各有一条由分子的两端，各有一条由分子的两端，各有一条由分子的两端，各有一条由1212个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成的彼此完全互补的的彼此完全互补的的彼此完全互补的的彼此完全互补的5 5单链突出序列，即通常所说的粘性末端。单链突出序列，即通常所说的粘性末端。单链突出序列，即通常所

43、说的粘性末端。单链突出序列，即通常所说的粘性末端。n n注入到感染寄主细胞内的注入到感染寄主细胞内的注入到感染寄主细胞内的注入到感染寄主细胞内的 噬菌体的线性噬菌体的线性噬菌体的线性噬菌体的线性DNADNA分子，会迅速地通过分子，会迅速地通过分子，会迅速地通过分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链粘性末端之间的互补作用，形成环形双链粘性末端之间的互补作用，形成环形双链粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNADNA分子。分子。分子。分子。n n随后在随后在随后在随后在DNADNA连接酶的作用下，将相邻的连接酶的作用下，将相邻的连接酶的作用下，将相邻的连接酶的作用下，将相邻的5-

44、P5-P和和和和3-OH3-OH基团封闭起来，基团封闭起来，基团封闭起来，基团封闭起来，并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为coscos位点（略语位点（略语位点（略语位点（略语coscos，系英语，系英语，系英语，系英语cohesive-end sitecohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之的缩写，即粘性末端位点之的缩写，即粘性末端位点之的缩写，即粘性末端位点之意）意）意）意）第四十一张，PPT共

45、一百四十七页，创作于2022年6月噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体（一）（一）噬菌体性质噬菌体性质DNA+DNA+外壳蛋白外壳蛋白1 1、DNA(48.5kb)DNA(48.5kb)噬菌体中：线性噬菌体中：线性宿主细胞：环状宿主细胞：环状(cos(cos位点位点)第四十二张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月n n迄今已经定位的迄今已经定位的噬菌体的基因至少有噬菌体的基因至少有61个，其中有个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为这类基因为噬菌体的噬菌体的必要基因必要基因；n n另一部分基因，当它们另一部分基因，当它们被外源基

46、因取代被外源基因取代之后，并不之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为噬菌体噬菌体的的非必要的基因非必要的基因（介于基因（介于基因J和基因和基因N之间）之间）。第四十三张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月2 2、噬菌体噬菌体基因组有基因组有基因基因5050个以个以上上第四十四张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月噬菌体DNA的复制n n在噬菌体感染的早期，环形的 DNA分子按形式从双向进行复制。n n到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的长多连体分子。第四十五张，PPT共一百四十七页，创作于20

47、22年6月噬菌体DNA的转录与转译n n在溶菌周期，噬菌体DN A的转录是在三个时期，即早期、中期和晚期发生的。n n大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期；n n中期基因转录的结果导致 DNA进行复制和重组；n n晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒。第四十六张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月3 3、限制性核酸内切酶位点限制性核酸内切酶位点:56:56种种4 4、噬菌体的生长途径噬菌体的生长途径溶菌生长途径溶菌生长途径溶原生长途径溶原生长途径某种胁迫条件下某种胁迫条件下合成合成six six 基因产物基因产物 DNA DNA脱离细菌染色体脱离细菌染色体溶菌溶菌第四

48、十七张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月（二）构建依据（二）构建依据1 1 1 1、噬菌体是一种温和噬菌体噬菌体是一种温和噬菌体2 2 2 2、能承载较大的外源、能承载较大的外源、能承载较大的外源、能承载较大的外源DNADNA片段片段DNADNADNADNA头部可包装约头部可包装约头部可包装约头部可包装约36.436.436.436.451kb(51kb(51kb(51kb(自身的自身的75%75%105%)105%)，且约有，且约有，且约有，且约有20kb DNA20kb DNA20kb DNA20kb DNA可缺失（生长非必需）可缺失（生长非必需）可缺失（生长非必需）可缺失（生长

49、非必需）3 3、在、在DNADNA上有多种限制性内切酶位点上有多种限制性内切酶位点上有多种限制性内切酶位点上有多种限制性内切酶位点（三）构建的基本策略与技术路线（三）构建的基本策略与技术路线（P54P54）n n策略策略:切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位点，切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。插入选择性标记基因，建立体外包装系统。第四十八张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月噬菌体载体的构建及其主要类型噬菌体载体的构建及其主要类型 n n插入型载体（插入型载体（insertion vectors），只具有一个可供外源DNA插入的

50、克隆位点。n n替换型载体（替换型载体（rePlacement vectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代。第四十九张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月第五十张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月第五十一张，PPT共一百四十七页，创作于2022年6月n n在基因克隆中的二者的用途不尽相同。n n插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。n n而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。第五十二张