多聚酶链式反应扩增片段新讲稿.ppt

《多聚酶链式反应扩增片段新讲稿.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《多聚酶链式反应扩增片段新讲稿.ppt（39页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、多聚酶链式反应扩增片段新第一页，讲稿共三十九页哦DNA指纹法在案件侦破中指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发过案发现场的血液、头发等样品中提取的等样品中提取的DNA，与，与犯罪嫌疑人的犯罪嫌疑人的DNA进行比进行比较，就由可能为案件的侦较，就由可能为案件的侦破提供证据破提供证据。讨论：讨论：1.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的侦人员要怎样才能得到足够量的DNA呢？呢？2.你还能说出你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗？鉴定技术在其他方面的应用吗？第二页，讲稿

2、共三十九页哦第三页，讲稿共三十九页哦第四页，讲稿共三十九页哦脱氧脱氧核糖核糖含氮碱基含氮碱基磷酸磷酸AG CTDNADNA的基本单位的基本单位12345O第五页，讲稿共三十九页哦鸟嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸A腺嘌呤脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸GCT第六页，讲稿共三十九页哦第七页，讲稿共三十九页哦ATGCAGCT5端端3端端5端端3端端第八页，讲稿共三十九页哦ATGCAGCT5端端3端端5端端3端端 识别识别：-OH端为端为3;磷酸基团的磷酸基团的末端为末端为5。第九页，讲稿共三十九页哦第十页，讲稿共三十九页哦第十一页，讲稿

3、共三十九页哦2 2、时间：、时间：细胞分裂细胞分裂间期间期（有丝（有丝分裂间期分裂间期，减，减数第一次分裂的间期）数第一次分裂的间期）1 1、概念：、概念：以亲代以亲代DNA为模板，根据碱基互为模板，根据碱基互补配对合成子代在补配对合成子代在DNA的过程。的过程。3 3、场所：、场所：主要是细胞核主要是细胞核 （其次是线粒体、叶绿体）（其次是线粒体、叶绿体）二细胞内二细胞内DNADNA复制的过程复制的过程第十二页，讲稿共三十九页哦4 4、条件：条件：模板：模板：亲代亲代DNADNA的两条母链的两条母链 原料：原料：游离的四种脱氧核苷酸游离的四种脱氧核苷酸 能量：能量：ATPATP 酶：酶：解旋

4、酶解旋酶 、DNADNA聚合酶聚合酶 引物：一小段引物：一小段RNARNA，能与，能与DNADNA母链的一段碱基序列互补母链的一段碱基序列互补配对配对5 5、过程、过程（1）解旋：解旋酶）解旋：解旋酶、ATP（2）以）以DNA的两条母链为模板，根据碱基互补配的两条母链为模板，根据碱基互补配对规则，合成子链。对规则，合成子链。（3）子链、母链螺旋构成子代）子链、母链螺旋构成子代DNA第十三页，讲稿共三十九页哦6、复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。7、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端延伸端延伸第十四页

5、，讲稿共三十九页哦第十五页，讲稿共三十九页哦第十六页，讲稿共三十九页哦第十七页，讲稿共三十九页哦解旋酶解旋酶DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物（RNA）打开打开DNADNA双链双链模板模板合成子链的原料合成子链的原料催化子链合成催化子链合成使使DNADNA聚合酶能从聚合酶能从引物引物3 3端开始连接端开始连接脱氧核苷酸脱氧核苷酸 思考：思考：体外扩增体外扩增DNADNA时，如何提供与体内时，如何提供与体内DNA复制相似条件？复制相似条件？变性变性（80100）Taq DNA聚合酶聚合酶（耐高温）（耐高温）2030个核苷酸构成个核苷酸构成DNA或或

6、RNA第十八页，讲稿共三十九页哦条件条件组分组分作用作用模板模板DNADNA的两条单链的两条单链提供复制的模板提供复制的模板原料原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 合成合成DNADNA子链的原料子链的原料酶酶解旋酶解旋酶TaqDNA聚合酶聚合酶不需要不需要催化合成催化合成DNADNA子链子链能量能量ATPATP不需要不需要引物引物一般是一小段一般是一小段DNADNA或或RNA,20-30RNA,20-30个核苷酸个核苷酸使使DNADNA聚合酶能够从引物聚合酶能够从引物的的3 3端开始连接脱氧核端开始连接脱氧核苷酸苷酸 （一）、（一）、PCRPCR的技术（的技术（DNADNA体外复制）的条件体外复

7、制）的条件第十九页，讲稿共三十九页哦DNA双链双链变性（加热变性（加热80-100）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）DNA单链单链变性的目的：变性的目的：解开双链解开双链复性的目的：复性的目的：有利于引物有利于引物1和引物和引物2与两条单链的与两条单链的结合结合第二十页，讲稿共三十九页哦PCR扩增仪实际上就是一台能够扩增仪实际上就是一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器，它可以根据的仪器，它可以根据DNA的热变性原理的热变性原理，通，通过自动改变温度，达到扩增过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的片段的目的。第二十一页，讲稿共三十九页哦1234522557294时间（时间（minmin）温度

8、（）适温延伸适温延伸高温变性高温变性低温复性低温复性重复重复1 13 3步步3030轮轮DNA复制的方向：DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端端延伸延伸变性变性 复性（退火）复性（退火）延伸延伸第二十二页，讲稿共三十九页哦PCRPCR技术的原理总结技术的原理总结利用利用DNA分子的分子的热变性热变性原理，通过控制原理，通过控制温度温度来控来控制双链的制双链的解旋解旋与与结合，结合，从而完成从而完成体外体外DAN分子的分子的扩增。扩增。体外体外DNADNA复制的条件：复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐四种脱氧核苷酸、耐高温的高温的DNADNA聚合酶、引物、聚合酶、引物、模

9、板；缓冲溶液和模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。严格控制温度的温控设备。复制的方向：复制的方向：子链的子链的5端向端向 3端延伸。端延伸。第二十三页，讲稿共三十九页哦二、二、PCR的反应过程的反应过程 5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物变性变性95oC复性复性55oC延伸延伸72oC5/3/3/5/第二十四页，讲稿共三十九页哦5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 第二十五页，讲稿共三十九页哦每个循环包括：每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产

10、物也可以从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且作为模板参与反应，并且由引物由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结合，进行结合，进行DNADNA的延伸，的延伸，这这样，样，DNADNA聚合酶只能特异性地复制聚合酶只能特异性地复制处于两个引物处于两个引物之间的之间的DNADNA序列，序列，使这段固定长度的序列使这段固定长度的序列呈指数呈指数扩增。扩增。PCRPCR的反应过程总结的反应过程总结第二十六页，讲稿共三十九页哦三、三、PCR实验操作实验操作第二十七页，讲稿共三十九页哦第二十八页，讲稿共三十九页哦一种通过高速转动产生离心现象，能将固一种通过高

11、速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。体与液体分开的设备。第二十九页，讲稿共三十九页哦（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备准备）（2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量离心管离心管中依次加入各组分（中依次加入各组分（移液移液）（3）盖严）盖严离心管离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合混合）（4）将微量离心管放在）将微量离心管放在离心机离心机上（上（离心离心）（5）将离心管放入）将离心管放入PCR仪仪上，设置好上，设置好PCR仪的循环程序（仪的循环程序（反应反应）第三十页，讲稿共三十九页哦四、四、结

12、果分析与评价结果分析与评价DNA 含量的测定：含量的测定：稀释稀释 对照调零对照调零 测定测定 计算计算5050倍倍蒸馏水做蒸馏水做对照对照波长波长260nm处读数处读数第三十一页，讲稿共三十九页哦第三十二页，讲稿共三十九页哦第三十三页，讲稿共三十九页哦 测定并测定并第三十四页，讲稿共三十九页哦 的含量为的含量为紫外分光光度计紫外分光光度计比色杯比色杯第三十五页，讲稿共三十九页哦体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋在解旋酶作用下，细在解旋酶作用下，细胞提供胞提供ATPATP，部分解开，部分解开加热到加热到9494o oC,C,双链

13、全双链全部解开，不需解旋酶部解开，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解旋半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。边复制，多起点复制。半保留复制，完全解半保留复制，完全解旋后复制，从模板链旋后复制，从模板链的一端开始复制。的一端开始复制。复制的方向复制的方向 子链的子链的55端向端向 3 3端端延伸延伸子链的子链的55端向端向 3 3端延伸端延伸第三十六页，讲稿共三十九页哦课堂小结课堂小结多聚酶链式反应

14、扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段PCR原理原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响的变性和复性受温度影响PCR过程过程变性变性复性复性延伸延伸操作步骤操作步骤配制配制PCR反应体系反应体系移入离心管移入离心管放入放入PCR设置工作参数设置工作参数DNA扩增扩增测定含量测定含量稀释稀释调零调零测定并读数测定并读数计算计算第三十七页，讲稿共三十九页哦练习巩固：练习巩固：1.做做PCRPCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是必须进行的关键步骤是 A.A.反复洗涤反复洗涤 B.B.不怕外源不怕外源DNADNA污染污染 C.C.高压灭菌高压灭菌 D.D.在在-20-20储存储存2.PCR2.PCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是 A.A.原理简单原理简单 B.B.原料易获得原料易获得 C.C.Taq DNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性 D.D.快速、高效、灵活、易于操作快速、高效、灵活、易于操作第三十八页，讲稿共三十九页哦第三十九页，讲稿共三十九页哦