多聚酶链式反应扩增片段.ppt

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1、关于多聚酶链式反应扩增片段关于多聚酶链式反应扩增片段现在学习的是第1页，共45页温故知新温故知新1:1:组成组成DNADNA分子的分子的基本单位基本单位是什么是什么?这些基本单位是如何连接成这些基本单位是如何连接成DNADNA分子的分子的?DNADNA分子结构有什么特点？分子结构有什么特点？现在学习的是第2页，共45页1 12 23 34 45 5DNADNA的基本单位的基本单位脱氧核苷酸脱氧核苷酸现在学习的是第3页，共45页O OO OP PO OHOHO碱基碱基O OOHOHO OO OP PO OHOHOOHOH碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖碱基

2、碱基脱氧核糖脱氧核糖5 53 3脱氧核苷酸链结构简图脱氧核苷酸链结构简图磷酸二酯键磷酸二酯键现在学习的是第4页，共45页A AT TG GC CA AG GC CT TDNADNA分子的平面结构分子的平面结构氢键氢键55端端33端端55端端33端端现在学习的是第5页，共45页DNADNA分子的复制过程是怎样的？分子的复制过程是怎样的？DNADNA分子的复制需要哪些条件？分子的复制需要哪些条件？温故知新温故知新2 2现在学习的是第6页，共45页DNADNA母链：母链：提供复制的模板提供复制的模板解旋酶：解旋酶：打开打开DNADNA双链双链4 4种脱氧核苷酸：种脱氧核苷酸：合成子链的原料合成子链的

3、原料DNADNA聚合酶：聚合酶：催化合成催化合成DNADNA子链子链ATPATP：为复制过程提供能量为复制过程提供能量引物：引物：使使DNADNA聚合酶从引物的聚合酶从引物的3 3端开始连接端开始连接脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNADNA复制的条件复制的条件现在学习的是第7页，共45页复制特点复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。DNADNA复制的方向复制的方向DNADNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的55端向端向33端延伸端延伸现在学习的是第8页，共45页1 1、DNADNA聚合酶特性聚合酶特性不能从头合成不能从头合成DNADNA，只能从

4、，只能从DNADNA的的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，因链，因此，此，DNADNA复制需要引物复制需要引物2 2、DNADNA聚合酶作用过程聚合酶作用过程当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后，DNADNA聚合酶就聚合酶就能从引物的能从引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链，DNADNA的合成方向总是的合成方向总是从子链的从子链的55端向端向33端延伸端延伸一、基础知识一、基础知识（一）（一）PCRPCR原理：原理：现在学习的是第9页，共45页现在学习的是第10页，共45页在在8080100100的温度范围内，的温度范围内，DNA

5、 DNA的双螺旋结构将解体，双的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性链分开，这个过程称为变性3 3、PCR PCR原理原理当温度缓慢降低后，两条彼此分离的当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNADNA链又会重新结链又会重新结合成双链合成双链 PCRPCR利用了利用了DNADNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的解聚与结合，现在使用的PCRPCR仪实质上也是一台能够自动调控仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器温度的仪器现在学习的是第11页，共45页现在学习的是第12页，共45页高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了

6、打开双链的问题，但是，又导致DNADNA聚合酶失活聚合酶失活的问题，耐高温的的问题，耐高温的Taq DNATaq DNA聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致DNADNA聚合酶聚合酶失活的问题，促成了失活的问题，促成了PCRPCR技术的自动化技术的自动化4 4、Taq DNA Taq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用5 5、缓冲液需要为缓冲液需要为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质DNADNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的核苷酸，耐热的DNADNA聚合酶，同时通过控制温度使聚合酶，同时通过控制温度使DNADN

7、A复制复制在体外反复进行在体外反复进行现在学习的是第13页，共45页PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具它具有特异、敏感、产率高、有特异、敏感、产率高、快速、快速、简便、重复性好、易自动化简便、重复性好、易自动化等突出等突出 6 6、PCR PCR技术的特点技术的特点现在学习的是第14页，共45页 PCRPCR过程需要的引物是过程需要的引物是RNARNA或或DNADNA，而是人工合成的，而是人工合成的DNADNA单链，其长度通常为单链，其长度通常为20203030个脱氧核苷酸个脱氧核苷酸7 7、细胞内复制和、细胞内复制和P

8、CRPCR不同点不同点 PCRPCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的的控制来实现的现在学习的是第15页，共45页细胞内细胞内DNADNA的复制的复制PCRPCR不不同同点点解旋解旋解旋酶，边解旋边复制解旋酶，边解旋边复制8080100100高温解旋，双链完全分高温解旋，双链完全分开开酶酶DNADNA解旋酶，解旋酶，DNADNA聚合酶，聚合酶，DNADNA连接连接酶酶TaqTaqDNADNA聚合酶聚合酶引物引物RNARNADNADNA或或RNARNA能量能量ATPATP不加不加温度温度体内温和条件体内温和条件高温高

9、温子链子链合成合成一条链连续（先导链），另一条一条链连续（先导链），另一条链不连续，先合成片段，再由链不连续，先合成片段，再由DNADNA连接酶连接（滞后链）连接酶连接（滞后链）两条子链均连续合成两条子链均连续合成相相同同点点需要提供需要提供DNADNA复制模板复制模板四种脱氧核苷酸作为原料四种脱氧核苷酸作为原料子链延伸的方向都是从子链延伸的方向都是从5 5端到端到3 3端端细胞内细胞内DNADNA的复制与的复制与PCRPCR的比较的比较现在学习的是第16页，共45页PCRPCR技术的原理总结技术的原理总结利用利用DNADNA分子的分子的热变性热变性原理，通过控制温度来控制双链原理，通过控制温

10、度来控制双链的的解旋解旋与结合，从而完成与结合，从而完成体外体外DNADNA分子的扩增。分子的扩增。体外体外DNADNA复制的条件：复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐高温的四种脱氧核苷酸、耐高温的DNADNA聚聚合酶、引物、合酶、引物、模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。设备。复制的方向：复制的方向：子链的子链的55端向端向 3 3端延伸。端延伸。现在学习的是第17页，共45页（二二）PCRPCR的反应过程的反应过程1 1、PCRPCR的反应步骤的反应步骤PCRPCR一般经历三十多次循环，一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤每次循环可以分为三个基

11、本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸变性（模板变性（模板DNADNA解旋）解旋）模板模板DNADNA经加热至经加热至90900 0C C以上。一定时间后，使模板以上。一定时间后，使模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增扩增形成的双链形成的双链DNADNA解离，解离，使成为单链，以便于它与引物结合，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备为下轮反应作准备2 2、循环过程、循环过程现在学习的是第18页，共45页靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循环第一步循环第一步 ：加热变性：加热变性现在学习的是第19页，共45页复性（退火）复性（退火）模板模板DNADNA经加热变性成单

12、链后，温度降到经加热变性成单链后，温度降到50500 0C C左右，左右，引物与模板引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合单链的互补序列配对结合现在学习的是第20页，共45页靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物 引物引物 5533555533553333PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火现在学习的是第21页，共45页延伸延伸DNADNA模板引物结合物在模板引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留

13、复制的原理，合成一条新的合成一条新的DNADNA链链现在学习的是第22页，共45页靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物553 3555533553333Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸现在学习的是第23页，共45页靶序列靶序列 靶序列靶序列第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列：得到两个拷贝的靶序列现在学习的是第24页，共45页现在学习的是第25页，共45页3 3、3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量循环循环次数次数DNADNA数量数量1 1 2 22 2 4 43

14、3 8 82020 1,048,5761,048,5763030 1,073,741,8241,073,741,824现在学习的是第26页，共45页二、二、PCRPCR的反应过程小结的反应过程小结5/3 3/3/5/5/3 3/引物引物5/3/引物引物变性变性9 95 5o oC C复性复性5555o oC C延伸延伸7272o oC C5/3 3/3/5/现在学习的是第27页，共45页5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 252530 30 次循环（复制）后，模板次循环（复制）后，模板DNAD

15、NA的含量可以扩大的含量可以扩大100100万（万（2 22020）倍以上。）倍以上。现在学习的是第28页，共45页每个循环包括：每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且与反应，并且由引物由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结结合，进行合，进行DNADNA的延伸，的延伸，这样，这样，DNADNA聚合酶只能特异性地复聚合酶只能特异性地复制制处于两个引物之间的处于两个引物之间的DNADNA序列，序列，使这段固定长度的序列使这段固定长度的序列呈呈指数扩增。指数扩增

16、。PCRPCR的反应过程：的反应过程：现在学习的是第29页，共45页PCRPCR反应条件：反应条件：稳定的缓冲液环境稳定的缓冲液环境 DNADNA模板模板 分别与两条模板链相结合的两种引物分别与两条模板链相结合的两种引物 A A、T T、G G、C C四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 耐热的耐热的DNADNA聚合酶，一般用聚合酶，一般用TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 能严格控制温度变化的温控设备能严格控制温度变化的温控设备现在学习的是第30页，共45页三三、PCR PCR 的实验操作的实验操作1 1、PCRPCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动

17、调控温度的仪器的仪器2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液体，液体，其上其上的一次性吸液枪头用一次更换一次的一次性吸液枪头用一次更换一次现在学习的是第31页，共45页PCRPCR仪仪现在学习的是第32页，共45页微量离心管微量离心管微量离心管微量离心管微量移液器微量移液器微量移液器微量移液器现在学习的是第33页，共45页1 1、准备、准备2 2、移液、移液（二）实验操作步骤（二）实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在反应体系

18、的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上实验桌上用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方往微量离心反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂管里面加入各种试剂现在学习的是第34页，共45页过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。弹击管壁。注意：注意：3 3、混合、混合B B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反目的是使反应液混合均匀。应液混合均匀。A A、离心管口的盖子一定盖严，、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液防止实验中脱落或液体外溢。体外溢。现在学习的是第35页，共45页将离心管放入将离

19、心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循环程序。仪的循环程序。过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上,离心约离心约10s10s。4 4、离心、离心5 5、反应、反应离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。反应效果。现在学习的是第36页，共45页PCR三步曲三步曲 预变性预变性保温保温 变变 性性94 94 94 94 30s30s30s30s延伸延伸 72721min1min复性复性 555530s30s94 94 94 94 5min5min5min5min现在学习的是第37页，共45页循环数循

20、环数变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性9494，5min5min3030次次9494，30s30s5555，30s30s7272，1min1min最后一次最后一次 9494，1min1min5555，30s30s7272，1min1min现在学习的是第38页，共45页PCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的污染而造成干扰实验，等因素的污染而造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：6 6、注意事项、注意事项隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行使用

21、必须进行高压灭菌高压灭菌；PCRPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20-20储存。使用前，将储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。分装试剂，简化操作程序，使用分装试剂，简化操作程序，使用一次性一次性枪头枪头现在学习的是第39页，共45页（一）理论上（一）理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算四四、课题成果评价、课题成果评价1 1、一条、一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2 n n2 2、a a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为a x2

22、a x2 n n（二）实验中（二）实验中DNADNA含量的测定含量的测定1 1、原理、原理可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波的紫外线波段有一强烈的吸收峰，段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与峰值的大小与DNADNA的含量有关的含量有关现在学习的是第40页，共45页稀释稀释2LPCR2LPCR反应液，加入反应液，加入98L98L蒸馏水，即将蒸馏水，即将样品进行样品进行5050倍稀释倍稀释对照调对照调零零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，处，将紫外分光光度计的读数调

23、节至零将紫外分光光度计的读数调节至零测定测定取取DNADNA稀释液稀释液100100L L至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm处的光吸收值处的光吸收值计算计算DNADNA含量（含量（g g/ml /ml）50(260nm50(260nm的的读数）读数）稀释倍数稀释倍数2.2.过程过程现在学习的是第41页，共45页现在学习的是第42页，共45页比色杯比色杯现在学习的是第43页，共45页五、实验小结五、实验小结 PCRPCR仪仪加加热热使使（）变变性性,复复性性使使引引物物与与模模板板DNADNA（）,延延伸伸需需将将反反应应温温度度升升至至中中温温(),),在在（）的的作作用用下

24、下,以以 （）为为原原料料,以以（）为为复复制制的的起起点点,合合成成新新链链。如如此此重重复复改改变变反反应应温温度度,经经（）三三个个阶阶段段为为一一个个循循环环,每每一一次次循循环环使使特特异异区区段段的的基基因因拷拷贝贝数数放放大大一一倍倍,一一般般样样品品是是经经过过3030次次循循环环,最最终终使使基基因因放放大大了了数数百百万万倍倍;将将扩扩增增产产物物进进行行电电泳泳,经经溴溴化化乙乙锭锭染染色色,在在紫紫外外灯灯照照射下肉眼能见到扩增特异区段的射下肉眼能见到扩增特异区段的DNADNA带。带。模板模板互补互补TaqTaq聚合酶聚合酶四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物变性、复性和延伸变性、复性和延伸7272现在学习的是第44页，共45页2022/9/26感谢大家观看现在学习的是第45页，共45页