营养成分知识简介.ppt

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1、第六节食品中维生素的测定,维生素(vitamin)是维持人体正常生命活动所必须的天然有机化合物，但它们参与机体重要的生理过程，是生命活动不可缺少的物质。 维生素的种类多（20多种），结构复杂，理化性质及生理功能各异。根据溶解性，可分为：,表3-5维生素的类别及食物来源,根据溶解性，可分为： l 脂溶性维生素（fat-soluble)：维生素A(包括胡萝卜素)、维生素D、维生素E和维生素K等。 l 水溶性维生素(water-soluble)：维生素B族(包括B1、B2、烟酸、B6、泛酸、生物素、肌醇、胆碱、叶酸、B12等)和维生素C。,一、脂溶性维生素的测定 （一） 概述 维生素A是由b-紫罗酮

2、环与不饱和一元醇所组成的一类化合物及其衍生物的总称。包括维生素A1和A2，维生素A1又称视黄醇，维生素A2即3-脱氢视黄醇。,17 16 19 20 7 11 15 CH2OH 18 维生素A 维生素A采用国际单位表示： 1国际单位维生素A ：0.3g 维生素A (醇) ； 0.344g 乙酸维生素A (酯）,1,4,9,13,-胡萝卜素(carotene)在肝脏、小肠粘膜或其它组织中可转化为维生素A，故胡萝卜素又称为维生素A源。 维生素E，又称生育酚，有多种异构体，其中-生育酚的生理活性最高，分布最广泛。,脂溶性维生素的理化性质： (1)溶解性： 不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、三氯甲烷、

3、乙醚、苯等有机溶剂； (2)耐酸碱性： 维生素A、D 对酸不稳定，对碱稳定； 维生素E对酸稳定，对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能承受与碱一起煮沸。,(3)耐热性和耐氧化性： 维生素A、D、E耐热性好，能经受煮沸。维生素A易被氧化，光、热促进其氧化； 维生素E在空气中缓慢氧化，光、热、碱能促进氧化； 维生素D性质稳定，不易被氧化。 检测时脂溶性维生素时应避光,摄入量,根据我国居民营养素参考摄入量 成人男性：800g RE,女性：700g RE 视黄酮当量（retinol equivalents，RE） 1g RE=1g视黄酮 =6g - 胡萝卜素 =12g其他类胡萝卜素,测定

4、食品中脂溶性维生素时，通常采用皂化法处理样品，以除去脂肪等杂质，在皂化和浓缩时，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等),然后用乙醚、石油醚等有机溶剂提取浓缩脂溶性维生素。,(二)维生素A的三氯化锑比色法 1.原理 在三氯甲烷溶液中，维生素A与三氯化锑反应可生成蓝色化合物，在620nm波长处有最大吸收，其吸光度与维生素A的含量成正比。,2. 样品处理 样品 加NaOH醇溶液 水浴上回流(使脂肪转变成肥皂并溶于水中) 加乙醚提取维生素A 净化处理乙醚提取液后 挥干乙醚 三氯甲烷定容。,3.注意事项： (1)三氯甲烷中不应含有水分，因三氯化锑遇水会水解出现沉淀，干扰比色测定 SbCl3十H2O

5、SbOCl十2HCl 在三氯甲烷中加入乙酸酐，以保证脱水。 (2)SbCl3与维生素A所产生的蓝色物质通常只能稳定36s，6s以后便开始退色，因此在吸收池中反应，产生颜色后立即读取吸光度值。,(3)维生素A见光易分解，实验操作应在暗处进行。 2胡萝卜素的纸色谱法 以丙酮-石油醚提取 水洗涤（除去提取液中水溶性色素及丙酮） 石油醚提取液浓缩。,层析滤纸 提取液条状点样 石油醚展开 将Rf值与标准胡萝卜素相同的色斑剪下用石油醚溶解 450nm波长下测定吸光度，与标准系列比较定量。,3.维生素A和维生素E的HPLC测定法 食品样品经皂化处理后，用乙醚提取维生素A和维生素E，浓缩后，挥去乙醚，以乙醇溶

6、解提取物。在反相C18色谱柱上，以甲醇(+水或己烷)为流动相进行色谱分离，紫外分光光度检测器检测，与标准比较定量。,二、水溶性维生素的测定,水溶性维生素(VB1,VB2,Vc)的理化性质： l 溶解性：易溶于水，不溶于苯、乙醚、三氯甲烷等有机溶剂。 l 稳定性：在酸性介质中稳定，即使加热维生素B1、B2也不被破坏；在碱性介质中不稳定，易于分解。Vc在酸性还原性介质中稳定。,l 维生素B2对光敏感，在酸性、中性及碱性环境中都易被光线破坏，维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。,（一）维生素B1的测定 维生素Bl又名硫胺素(thiamine)，易溶于水和丁醇、异丁醇、异戊醇等有机溶剂。维生素B1的测

7、定主要采用荧光分析法(GB12390-90)。 人体每日需要量为12mg。VB1参与糖代谢及乙酰胆碱(Ach)的代谢，促进消化功能。维生素B1缺乏可引起神经系统病变还可引起心血管系统病变。在酵母、米糠、花生、豆类、牛乳、蛋黄中含量丰富。,食品中的维生素Bl经提取净化后，在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素，在紫外光照射下，硫色素产生蓝色荧光，溶液的荧光强度与维生素B1的浓度成正比，与标准比较定量。,1.测定原理,本方法检出限为0.05g， 线性范围为0.2g10g。,硫胺素是由取代的嘧啶环和噻唑环由亚甲基相联而成的一类化合物,2.样品处理：样品粉碎或匀浆于低温冰箱中保存，测定前解冻 。 (1)样

8、品中硫胺素的提取： 稀盐酸提取 高压锅（121）加热 淀粉酶水解4550过夜 游离硫胺素。 (2)样品中硫胺素的纯化： 样液 人造浮石交换管 硫胺素被吸附 水洗除杂质 酸性氯化钾洗脱 硫胺素。 (3)硫色素的生成、萃取和荧光测定:,取一定体积样品提取液 和硫胺素标准液（各2份） 加碱性铁氰化钾 加氢氧化钠 形成硫色素 破坏硫胺素 用丁醇萃取，分层 有机相脱水，荧光测定。,根据标准硫胺素含量和荧光强度及样品荧光强度(均扣除空白)，计算样品中硫胺素的含量。 3.注意 (1)样品与铁氰化钾溶液混合后，所呈黄色至少应保持15s，否则需再滴加铁氰化钾溶液12滴。但铁氰化钾过多又会破坏硫色素。 (2)紫外

9、光会破坏硫色素，硫色素形成后应迅速测定，并避光操作。,(3)硫色素能溶于正丁醇，且稳定。 (4)洗衣粉内常含荧光物质，故所用的仪器，禁用洗衣粉洗涤。,(二)维生素B2的测定,维生素B2又名核黄素(riboflavin)，是多种酶（含有核黄素的氧化还原酶）辅基的组成成分，参与机体的氧化还原过程。 主要存在于瘦肉、肝、肾、心、奶类、蛋类、绿叶蔬菜等动物性食品，许多绿叶蔬菜和豆类也含有一定量维生素B2，而谷类中则含量较少。,表1 常见食品中维生素B2的含量（mg/100g）,维生素B2易溶于水，在酸性和中性溶液中稳定，于120加热6h仅有少量被破坏，但在碱性溶液中较易分解。游离核黄素对光敏感，特别是

10、紫外光，在酸性、中性或碱性条件下都易被光线破坏。只有当维生素B2与磷酸蛋白质结合成复合物，对光才比较稳定。VB2在水溶液中呈现黄绿色荧光, 测定维生素B2常用荧光分析法。,1.测定原理,样品 酸解、酶解使VB2游离 高锰酸钾氧化色素和杂质 硅镁吸附剂柱净化 测定 荧光强度(激发波长为440nm，525nm波长处检测。 试液中加连二亚硫酸钠 还原VB2为无荧光物质 测定杂质的荧光强度。 还原前后荧光强度的差值与维生素B2含量成正比，与标准比较定量。 本方法检出限为0.006g，线性范围为0.1g20g。,2.样品处理 样品 酸性条件下于120水解 核黄素游离 调节pH值 使蛋白质在等电点沉淀 过

11、滤除去杂质 核黄素溶液 KMnO4 酸性条件氧化色素和杂质 H2O2除去多余的KMnO4 。,3.核黄素的吸附和洗脱 核黄素溶液 硅镁吸附剂柱 热水洗除杂质 丙酮-冰乙酸-水(5+2+9)洗脱 收集洗脱液。,4.荧光测定 测定样品的荧光读数A，样品空白的荧光读数Ao，标准溶液的荧光读数B，标准管空白荧光读数Bo, 可计算样品中维生素B2的含量。,4.说明 (1)加入连二亚硫酸钠(Na2S204)，还原维生素B2使生成无荧光的物质，可排除杂质荧光所引起的干扰。加入后应尽快进行测定，否则会氧化成有荧光的核黄素。,(2)操作应在避光条件下进行。,(三） HPLC同时测定B族维生素,B族维生素的检测方

12、法很多，高效液相色谱法分析速度快、灵敏度高、准确性好，样品量需用量少，可以同时测定多种B族维生素。 国家卫生标准方法 (GB/T5009.197-2003) 可以同时测定保健食品中的VB2、烟酸和烟酰胺的高效液相色谱法。,样品经甲醇、水和磷酸的混合液提取，滤膜过滤后，以1-葵烷磺酸钠-乙腈-磷酸为流动相，用C18柱分离，紫外280nm检测，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。,1. 实验原理,2. 样品处理 称取适量研磨混匀的样品，加入甲醇、水和磷酸的混合液（100+400+0.5）超声提取5min，3000r/mim离心5min，上清液经滤膜过滤后即可进样。,3. 色谱条件,C18柱（150m

13、m4.6mm,5m），流速1ml/min，柱温：室温，检测波长为280nm，流动相为1-葵烷磺酸钠溶液（0.22g1-葵烷磺酸钠溶解于850ml水中）+乙腈+磷酸=850+150+1。,4. 方法说明 1）可通过调节流动相的pH值来控制维生素的电离，从而调节其保留时间和分离度。 2）可在测定过程中变换检测波长，提高检测灵敏度，如维生素B1、烟酸、烟酰胺最大吸收波长为254nm，维生素B2、维生素B6、叶酸为280nm。,3）流动相中加入1%磷酸，可降低维生素的离子化，改善峰形，减缓峰的拖尾现象。 4）由于B族维生素在水中可以解离为带电荷的离子，在系统中加入一种与上述电荷相反的离子对试剂，使其形

14、成中性离子对，即可于反相离子对色谱中进行分离。,维生素C，又称为抗坏血酸(ascorbic acid)，具有较强的还原性，被氧化后形成脱氢型抗坏血酸，仍然具有生理活性。脱氢型抗坏血酸水解成2,3-二酮古洛糖酸后，便失去生理活性。在蔬菜和水果中含量很丰富 。,(三)维生素C的测定,O = C O = C COOH HO-C O = C C=O HO-C O O = C O C=O HO-C H- C H-C -OH HO-C-H HO-C -H HO-C - H CH2OH CH2OH CH2OH （还原型 ） （脱氢型） （二酮古洛糖酸）,2,6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色， VC能将其还原

15、成无色。 将2,6-二氯酚靛酚装入滴定管中，滴定样品中的维生素C，当维生素C全部氧化后，滴下的染料使溶液显示粉红色，指示滴定终点。,1. 还原型抗坏血酸的测定 （1.2,6-二氯酚靛酚滴定法）,本法是测定还原型维生素C最简便方法，适合于蔬菜水果中维生素C含量的测定，但不适宜于红色蔬菜。 样品中某些杂质可还原染料，但速度较慢，终点以粉红色出现15s不退为准。 整个测定过程要迅速，以免维生素C被空气中氧所氧化，并避免接触金属离子。,2.总抗坏血酸的测定（ 2,4-二硝基苯肼比色法,GB/5009.86-2003）,用酸处理过的活性炭作氧化剂，将还原型维生素C全部氧化成脱氢型维生素C。然后与2,4-

16、二硝基苯肼作用，生成红色的脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与维生素C总量成正比，在520nm波长下比色定量。,注意事项,1.样品用20g/L草酸匀浆或研磨。 2.活性炭置于1mol/L HCl中回流12 h，过滤，滤液用水洗至无铁离子，于110度烘箱中烘干，备用。 3.检出限为0.1ug/mL,(1)原理：样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline) ,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比。 适用于蔬菜、水果及其制品中还原型和脱氢型抗坏血酸的测定。,3.抗坏血酸的荧光分析法 （GB/T5009.86-2003),(2)

17、样品处理： 样品制备：取一定量样品，加偏磷酸-乙酸溶液，匀浆，用酸碱度（pH 1.2），过滤。 氧化：分别取滤液及标准液，加适量活性炭，振摇过滤，分别收集滤液 除去干扰：各取试样氧化液和标准氧化液作为空白，分别加入硼酸-乙酸钠溶液，放置在冰箱中，备用。 再分别取试样氧化液和标准氧化液各一份，加入乙酸钠溶液，备用。,邻苯二胺溶液在空气中颜色变暗，影响显色，应临用前配制。 活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧进行界面反应，应加入适量，否则测定结果偏低。,(3）方法说明, 当食物中含丙酮酸时，可与邻苯二胺反应生成一种荧光物质，干扰测定。 加入硼酸可与脱氢抗坏血酸结合而不与邻苯二胺反应，以

18、此消除样品中丙酮酸产生的荧光干扰。,4. 维生素C的高效液相色谱分析,(1)原理：样品用0.5%草酸超声波提取，以0.010mol/L NH4Ac-HAc缓冲溶液(pH4.5)作流动相，反相C18液相色谱柱分离，紫外检测器于262nm波长下测定维生素C的吸光度值。样液经0.45 m滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。根据保留时间定性，标准曲线法定量。,(2) 样品处理,饮料：取一定量饮料经0.45m滤膜过滤后进样分析。 保健食品：称取一定量粉碎、混匀的样品，用5g/L草酸溶液超声波提取15min,定容后经0.45m滤膜抽滤后进样分析。 蔬菜和水果样品：用5g/L草酸溶液匀浆，取部分上清液经0.45mm滤膜抽滤后进样分析。,(3) 测 定,色谱条件： C18柱（4.6250mm，5mm）； 流动相为0.01mol/L NH4Ac-HAc（pH4.5）， 检测波长为262nm； 流速为1.0ml/min; 进样量为10l；20C柱温。,1维生素C极易被氧化，因而在操作过程中标准溶液的配制和样品的处理均用具有还原性的草酸溶液，标准溶液和处理后的样液应放冰箱保存，并尽快测定。 2该方法在0.0501000.0g/ml浓度范围内线性良好，检出限为50ng/ml。,