再生植株.ppt

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1、第三节 再生植株途径,再生植株途径,悬浮培养途径,脱毒苗快繁,育种材料快繁,良种、突变体、种质、濒危材料快繁,外植体,体细胞杂交材料快繁,融合原生质体,各种器官组织,花药、胚、胚胎、胚乳等,脱毒处理,目的,愈伤组织,丛生芽,胚状体,原球茎,壮苗,生根,移栽,检测,脱毒苗检测,倍性检测,目的,细胞生产,次生代谢产物生产,种质保存,成分检测、提取等,愈伤组织,脱分化,再分化,人工种子,再生植株途径 常规快速繁殖基本环节 脱毒苗组织培养 育种培养 细胞融合,第一部分 常规快速繁殖基本环节,外植体处理-愈伤组织（脱分化）-丛生芽、胚 状体、原球茎（再分化）-增值壮苗-根-移栽,外植体,愈伤组织（脱分化

2、培养基）,丛生芽（再分化培养基）,再生根（生根培养基）,再分化,脱分化,壮苗（壮苗培养基）,接种,接种材料修整方法,一、外植体处理,接种材料修整方法,接种材料修整与冲洗,二、愈伤组织形成-脱分化,植物细胞只要具有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使是已经高度成熟和分化，也还保持着回复到分生状态的能力。 一个细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在原来所处的自然部位上已经达到的细胞和生理状态。,1、愈伤组织特点,植物细胞脱分化而不断增殖形成的愈伤组织，主要由薄壁细胞构成的非器官化组织或不定组织 愈伤组织的颜色、质地不同 愈伤组织具有结构的不均一性和生理和遗传上的不稳定性,外植体产生的

3、排列疏松而无规则且没有发生分化的薄壁细胞。,2、愈伤组织形成的条件,离体 培养条件（尤其是激素的种类和浓度，常用的生长素是2，4D，IAA和NAA，常用的细胞分裂素是KT和6BA） 外植体类型（木本植物中的幼态或成年态） 外植体原来在植株上所处的位置（它反映了内源激素的水平）,3、愈伤组织形成的过程,诱导期 诱导期是外植体细胞进行分裂准备的时期。在这一时期外植体细胞大小没有多大变化，但细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。 分裂期 细胞分裂的速度大大超过了细胞伸展的速率，细胞体积迅速变小，逐渐回复到分生状态。外植体细胞由原来的静止状态经过诱导期的分裂准备之后进入分裂高峰期

4、，回复为分生状态，这整个过程即为脱分化。脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织。,形成期 形成期是外植体细胞经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂。 分化期-愈伤组织增殖或形态发生： 一方面：愈伤组织增殖-增殖型愈伤组织 另一方面：形态发生期,不定芽方式 胚状体方式-胚型愈伤组织,4、愈伤组织增殖,将诱导形成的愈伤组织转接到新鲜的培养基上时，愈伤组织就会进一步增殖生长，生长一段时间以后，又必须重新将愈伤组织切割成一定大小的愈伤组织块，转接到新鲜的培养基上继续增

5、殖。 转接必须及时，因为愈伤组织的生长基本符合s形生长曲线。,1）、无菌短枝型（微型扦插）,2）、丛生芽发生型（器官型）,3）、器官发生型,4）、胚状体型,5）、原球茎型,三、再生途径与类型-愈伤组织再分化,微型扦插,顶芽,CTK刺激,带芽的茎切段,侧芽,接种培养,形成的茎梢节长，直立向上呈小灌木丛状,获得较多嫩茎梢,茎段培养继代扩繁,试管苗,生根培养,无愈伤组织产生,初代,继代,1、无菌短枝型（微型扦插）,脱分化,分化,少量或无愈伤组织,芽、芽丛,切割芽丛 继代培养,大量芽丛,试管苗,生根培养,外植体,初代,继代,2、丛生芽发生型,芽生芽,3、器官发生型,器官发生型有3种基本方式（顺序）：

6、先分化芽再分化根：待芽伸长后在其幼茎基部长根，形成完整的小植株，这种方式在木本植物组织培养中较为普遍，因此芽和根的诱导要分两步完成 先分化根再分化芽：先分化根再在根上产生不定芽而形成完整植株。一般来说，培养物若先形成根，则会抑制芽的形成 愈伤组织的不同部位分别形成芽和根：然后二者的维管组织互相连接，成为具有统一的轴状结构的小植株,来源：体细胞 特点：直接成苗 发生：愈伤组织表面；悬浮培养的细胞或外植体表面,4、胚状体型,体细胞胚(somatic embryo)或胚状体(embryoid)：指的是在植物组织培养中起源于一个非合子细胞、经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚状结构。 定义表

7、明: 它不同于合子胚，因为它不是两性细胞融合的产物; 它不同于孤雌胚或孤雄胚，因为它不是无融合生殖的产物; 它不同于组织培养中通过器官发生途径形成的茎芽和根，因为它的形成经历与合子胚相似的发育过程，而且成熟的胚状体是一个双极性结构。,胚状体苗与器官发生苗的区别,体细胞胚的应用人工种子,人工种子: 将细胞培养所产生的 体细胞胚或具有发育成完整植株的分生组织（相当于胚）包裹在一层含有营养物质的胶囊（相当于胚乳）里，再在胶囊外包上一层 具有保护功能的外膜（相当于种皮），形成在适宜条件下能够发育成完整植株的人造颗粒，在外形上象石榴。 结构：体细胞胚、人工胚乳、人工种皮,优点：其一，可使在自然条件下不结

8、实或种子昂贵的植物得以繁殖，如三倍体、非整倍体、基因工程植物；其二，固定杂种优势； 其三，节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险；,其四，与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。 其五，用人工种子播种可以节约粮食。 例如，一个 12 L的发酵罐在 20 d内生产的胡萝卜胚状体，可以制成1000万粒人工种子，供几千公顷农田的种植需要，与天然种子相比，大大节约了粮食。,人工种子利用中的问题,（1）贮藏问题 ； （2）体细胞无性系变异 ； （3）成本问题 。,短缩的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。,5

9、、原球茎发生型,初代培养中易出现的问题及对策,污染 操作污染分为细菌污染和真菌污染 外植体自身带菌导致的污染 由于表面灭菌不彻底或外植体内部带菌所致 褐变 褐变的概念及影响因素 褐变的防止方法,细菌污染,细菌污染 表现：在培养过程中，在培养基表面或材料表面出现黏液状物体、菌落或浑浊的水迹状，有时甚至出现泡沫发酵状。 原因：主要是由于工作人员使用未经充分消毒的工具、或由于呼吸排除的细菌、或操作人员用手接触材料或器皿的边缘，使微生物落入培养基中，有时也会因剪取某一带菌材料后用具又未彻底灭菌，造成继续污染。,真菌污染,真菌污染 表现：在培养过程中，一般35天发现菌丝，既而很快出现灰、白、黄、绿等孢子

10、。 原因：空气污染以及取放瓶塞扬起的灰尘和真菌孢子落入器皿中造成。,褐变的概念及影响因素,概念 褐变是指培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基和培养材料逐渐变褐而死亡的现象。 褐化的发生是由于组织中多酚氧化酶被激活，酚类化合物被氧化形成褐色的醌类物质。醌类化合物在酪氨酸酶的作用下，与培养材料组织中蛋白质发生聚合，引起其它酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。 影响因素 基因型 材料的生理状态 培养基成分 培养时间,褐变的防止方法,选择适当的外植体，掌握适宜的采芽时间 外植体用流水冲洗30分钟以上，在接种前将外植体在无菌水中浸泡处理 降低对外植体的切割损伤，或在无菌水中切割 降低培养基中无机盐

11、浓度；缺省生长调节物质可减少酮类物质分泌和氧化 使用液体培养基可以迅速稀释外植体伤口处分泌出的有毒物质 在培养基中加入活性炭 在培养基中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP 加入抗氧化剂如柠檬酸、维生素C、L半胱氨酸、硫脲 在培养基中添加氨基酸(谷酰胺、精氨酸、天冬酰胺)、芳香甙、硫代硫酸钠 连续转接到新鲜的培养基上有时可缓慢阻止色素的形成 由苗芽基部光激活引起的褐化可通过将苗芽基部处于黑暗状态得以消除 控制光温条件，避免过高,四、试管苗的增殖和继代培养,试管苗的增殖和继代培养,植物材料在容器中培养一段时间后，往往需要转接到新鲜的培养基上去生长。因为： 培养基消耗尽 植物材料在培养容器中已占尽生长空间 需

12、进一步增殖(转到同样配方的培养基上) 植物材料转入下一阶段生长或另一种器官分化(转到不同配方的培养基上) 由于无机盐和琼脂浓度过高而导致培养基干化 由于pH值下降而引起培养基流体化 防止褐化现象发生而转接 适应生根培养,继代培养中易出现的问题 再生能力的下降 玻璃化现象 驯化作用,试管苗继代培养过程中分化再生能力衰退 原因：1、愈伤组织培养逐渐丧失了成器官中心；2、内源激素的减少；3、染色体畸变。 解决措施：增加外源生长调节物质；筛选具有形态分生能力细胞团；缩短继代时间；重新建立细胞系。,玻璃化现象,玻璃化现象(vitrification) 是一种异常的生理现象。 玻璃化苗是植物组织培养时出现

13、的半透明状、畸形的试管苗。 其解剖特点为：整株植物矮小肿胀，呈半透明状。有时发育出大量短而粗的茎，节间很短或几乎没有节间。输导组织虽可看到，但导管和管胞木质化不完全。叶片厚而狭长，有时基部较宽。叶片皱缩或纵向卷曲，脆弱易折碎。叶表缺少角质层蜡质或蜡质发育不完全，无功能性气孔器。玻璃化叶片不具有栅栏组织，仅有海绵组织。,玻璃化现象,玻璃化现象产生的原因 一般而言，培养条件与玻璃化现象的发生有关.培养条件引起试管苗碳水化合物、氮代谢和水分状态等发生生理异常。 降低和减轻玻璃化现象采取的措施 增加琼脂和(或)糖浓度 改善培养容器的气体交换 改变培养基的大量盐类 降低BA水平 增强光照，适当降低温度

14、避免采用容易产生玻璃化现象的琼脂种类 采用液固两相培养基,玻璃化苗发生的机理,试管苗玻璃化的产生是由于内源激素乙烯在代谢调节中所起的关键性启动作用。试管苗在胁迫培养环境中，如水势不当，通气不畅、生长调节剂浓度过高、温度过高等，导致乙烯产生。培养瓶空气中过剩的乙烯抑制了试管苗体内乙烯的生物合成，但诱发了其它激素质和量的改变及酶类的变化；另外，培养瓶中气体组成的改变，也影响磷酸戊糖途径、光呼吸途径的进行。,驯化作用,驯化作用是指原先依赖于某种生长调节物质而生长的培养物，经过一段时间的继代培养后，不再需要这种生长调节物质，即变成对该生长调节物质自养的培养物的现象 驯化作用一般并非是永久性变化，有时培

15、养条件变化也会逆转驯化作用，所以驯化作用是外遗传变化。 驯化作用可在继代培养中自然发生，也可人为地改变培养条件，可以诱导或逆转这种驯化作用。 驯化作用可能是由于植物组织内对该生长调节物质的合成增加所致，也可能是降解速率降低或受到保护所致，组织对生长调节物质敏感性降低也可能是一种原因，也不排除上述几个原因共同作用的结果。,五、 壮苗与生根,壮苗 材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流，使太细弱的材料达到壮苗的目的 生根（离体生根和活体生根）,离体生根,壮苗后的单苗转入生根培养基后即可生根。 一般来说，多数植物的生根只需要一次培养，但有少部分植物的生根必须经过多次培养才能达到目的。 一般认为矿

16、物元素浓度较高时有利于发展茎叶，而较低时有利于生根，所以多采用1/2或1/4量的MS培养基，全部去掉或仅用很低的细胞分裂素，并加入适当的生长素。,活体生根,又称试管外生根：芽苗先在生长素中快速浸蘸或在含有相对高浓度生长素的培养基中培养510天，然后在温室中栽入培养基质中，并辅以高湿度环境，即经常喷雾，几天后，芽苗可自行生根。,六、驯化移栽,试管苗的特点 1、根与输导系统不通 ； 2、在高湿、弱光和异养条件下分化和生长的叶，叶表保护组织不发达甚至完全没有，易于失水萎焉。试管苗叶光合作用能力极低。 3、组织幼嫩、结构较松散、细胞含水率高，机械组织不发达，容易发生机械损伤，对病虫害特别敏感,试管苗生

17、态环境与自然环境的差异,高温且恒温 高湿 弱光 无菌,不恒温 高湿 强光 有菌,基本步骤： 炼苗（训化）-移栽-移栽后管理,（一）、试管苗的驯化,目的：提高试管苗的适应性，促其健壮，最终提高移栽成活率 原则： 从温、光、湿度及有无杂菌等环境因素考虑。 驯化开始数天内，与培养环境条件相似；后期与预计栽培条件相似，逐步适应。 方法：即炼苗。不开口自然光下2-3天，然后开口1-2天。,1、瓶炼：试管苗在移植前必须对其进行高光强锻炼，同时将瓶口包扎物打开，使试管苗慢慢适应外界环境，让植株生长粗壮，增强小苗体质以提高移苗成活率，这个过程叫做驯化或炼苗。 关键技术： 1）生根培养基中培养的天数； 2）生根

18、的状态 ； 3）炼苗时的光照强度 ； 4）炼苗的时间 ； 5）瓶苗开口也有技巧可言,2、盘炼：从瓶中小心取出试管苗，在20度左右的温水中浸泡约10min，换水两次，将粘附于试管苗根部的培养基清洗干净，迅速栽在装有已经过消毒处理的基质的育苗盘中，喷淋透水，喷洒一定剂量的杀菌药，然后放在干净、排水良好的温室或塑料保温棚中，保持较高的空气湿度，炼苗20天左右。 关键技术： 1）取苗时手要轻。如果培养基太干燥，可以先用清水浸泡一段时间； 2）炼苗基质以疏松、排水性和透气性良好者为宜，且必须经过消毒处理； 3）植苗入盘的时间，最好选在无风阴湿的天气 ； 4）对于刚进行盘炼的小苗，要特别注意掌握光照 ；

19、5）盘炼进行一周后，应该适当叶面追肥 。,（二）、移栽 1、大田移栽 2、容器移栽,试管苗的移栽,移栽方法：取出试管苗，全部轻洗去培养基栽入基质(事先浇透水)后，栽后轻浇薄水，移入高湿环境(90%以上)。 移栽场所与设施：日光温室塑料大棚驯化室 软塑料钵、育苗盘、苗床。 移栽时期：选择自然出苗期 移栽基质：要求透气、保湿、保肥，易灭菌。可选用珍珠岩、蛭石、沙子；外加草炭、腐殖土。 配比： 珍珠岩：蛭石：草炭或腐殖土=1：1：0.5； 沙子：草炭或腐 殖土=1：1,组培驯化常用基质,基质配比： 珍：蛭：草( 腐殖土)=1：1：0.5 珍：草(腐殖土)=1：1,注意基质配比并保持适当的通气性,保持

20、基质通气性： 选颗粒状基质，浇水勿多。,炉渣预处理、做畦与装填基质,基质装填后状态与浇水,试管苗的移栽方法,试管苗的移栽方法,（三）、试管苗移栽后的管理 1、保持小苗的水份供需平衡 ； 2、控制温度 ； 3、控制光照 ； 4、菌类控制。,保持小苗水分供需平衡,1周内： 环境高湿。 1周后： 小苗生长后逐渐降湿，拱棚两端通风。 半个月后： 揭膜，控水。,防止菌类滋生,基质高压灭菌或3h烘烤灭菌或太阳能灭菌。 适当使用杀菌剂、消毒剂。 移栽时少伤苗。 喷水加0.1%尿素或1/2MS大量元素液追肥，加快苗生长。,温光条件适宜,适宜生根温度：1820，温度低可加地热线。 移栽初期弱光，后逐渐加强光照，

21、过渡到自然光照。,提高试管苗质量 及时出瓶驯化，避免试管苗老化 改善环境条件，减少蒸腾，防止叶片灼伤 选择适宜的基质 防止菌类滋生 保持试管苗水分供需平衡 加强肥水管理和病虫害防治,提高试管苗驯化移栽成活率的措施,第二部分 脱毒苗组织培养,脱毒处理+常规快速繁殖环节+检测,脱毒苗的获取及繁育技术,概述 脱毒材料的获取 病毒的检测规程 无毒体系的保持,概述,近年来，随着我国观赏花卉种植面积和栽培种类的不断提高，病毒的发生与危害也逐年加重，病毒病已上升成为影响观赏花卉质量、产量的主要病害 受病毒侵染的观赏花卉有可能会表现为花叶、碎色、褪绿、黄化等症状。然而，很多病毒可能不表现任何可见症状，但受害的

22、植株长势下降，品质退化，产量、抗逆性下降 目前获得无毒种苗常用方法主要是采用茎尖培养、热处理、药剂处理等脱毒技术来消除营养体中的病源，并由这些组织再生出完整的植株，作为原原种 国内外常用于病毒检测鉴定方法包括生物学(如鉴别寄主)、血清学(如ELISA)、分子生物学(如PCR)三类 本章重点讨论脱毒材料的获取、花卉病毒的检测规程、无毒体系的保持等三方面的内容,脱毒材料的获取,热处理脱毒 茎尖脱毒 抗病毒药剂处理脱毒 影响茎尖脱毒的因素,脱毒方式： 热处理脱毒病毒钝化(寄主植物很少或不会受到伤害) 温汤浸渍处理： 在50左右的温水中浸渍 10分钟至数小时。缺点：易使材料受伤。 热空气处理：35-4

23、0，几十分钟，长可达数月温热治疗室（箱）内 。可采用变温处理，即昼夜或隔日高低温交替处理的方法，以提高脱毒成功率缺点：缺陷是并非能脱除所有病毒。热处理时间过长，会造成植株代谢紊乱，影响成活率，加大了品种变异的可能性 。 热处理需与其他方法配合应用才可获得良好的效果。,生长点（约0.1-1MM区域）几乎不含或含病毒很少.,茎尖培养脱毒,茎尖脱毒： 分生组织中不含病毒可能跟以下几点有关 代谢活性高 病毒的增殖依赖于寄主的代谢，由于分生组织具有很高的代谢活性，病毒无法控制寄主的代谢机制 无维管组织 病毒是通过维管组织在寄主的组织中进行快速扩散的，由于分生组织中无细胞分化，那些存在于韧皮部的病毒(如P

24、LRV)就不可能侵染分生组织，而侵染非韧皮部病毒也只能通过胞间连丝进行细胞间传播，但它的速度很慢，难以侵染快速分裂的茎尖细胞 高激素浓度 植物的分生组织比其他组织的植物激素浓度高，可以抑制病毒的增殖,影响茎尖脱毒的因素,培养基 选择正确培养基，可以显著提高获得完整植株的成功率 茎尖剥离体的大小 在最适培养基条件下，茎尖剥离体的大小对其存活率的影响较大。一般被剥取的茎尖越大，越容易产生再生植株。但植株茎尖的脱毒效率与其大小呈负相关，因此被剥取的茎尖应该小到足以能够脱除病毒，但又能够发育成为一个完整的植株,培养条件 茎尖的生理状态 茎尖最好要从活跃生长的芽上切取 取芽的时间,其他途径脱毒 愈伤组织

25、培养脱毒仅有部分单个细胞含有病毒病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度或有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。缺陷植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株，并且一些作物的愈伤组织尚不能产生再生植株。抗病毒药剂处理脱毒：尖培养结合抗病毒剂处理，是观赏花卉脱毒种苗规模化生产的较好选择,脱毒效果检测 抗血清(antiserum)鉴定：已知植物病毒核蛋白（抗原）制备抗体；抗血清+未知的病毒植物可见的沉淀（试管） 酶联免疫吸收鉴定（ELISA）：已知植物病毒（抗原）+一抗（已制备）二抗（酶）酶的显色底物溶液 酶标仪检测 电子显微镜（electric microscope)检查法：直接观察病毒 的有无或种类 指示植

26、物法(indicating plant) ：被鉴定植物 的汁液接种指示植物或嫁接接种法 （指示植物作为砧木，被鉴定植物作接穗 ）,无毒体系的保持,原原种的无毒保持 原原种的保持与扩繁可通过组培方式 也可通过栽培方式进行 原种的无毒保持 采穗圃的无毒保持 无毒优质种苗生产程序,原原种的无毒保持,通过栽培方式进行应注意 防虫温室 单盆定植 器具消毒 清洁卫生 定期喷药 病毒检测,原种的无毒保持,原种在保持条件上，与原原种基本相同 (如仍需防虫温室、基质灭菌、器具消毒、清洁卫生、定期药剂防除等) 仍有不同之处 单系种植 病毒抽测 注：原种的繁殖不能无限制地进行，否则会造成植株退化，生活力下降,采穗圃

27、的无毒保持,采穗圃是整个无毒体系的主体之一，也是实现商品价值的重要环节 离地栽培 适当稀植 母本植株更新与基质消毒 定期喷药 病毒抽测,第三部分 育种培养,花药和花粉培养：外植体+常规培养+倍性检测-单倍体培养 胚胎培养：胚培养、胚珠培养、子房培养、 胚乳培养-克服远缘杂交的不亲和性 细胞融合及融合细胞培养,（一）、花药及花粉培养,1、概念与意义 花药培养：花药培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，改变花粉的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，产生再生植株，或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。,1.4.2 花药及 花粉培养,花药培养的基本程序是：外植体选择外植体(花蕾

28、)预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养,花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。 烟草、茄子 35 72小时 水稻 10 1014天 柑橘 3 510天 马铃薯 4 48小时 低温处理的作用： 可以激发花粉母细胞产生两个相等核:一个营养核一个生殖核；保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老； 激发花粉产生原胚；促使细胞同步分裂。,1.4.2 花药及 花粉培养,花药培养中单倍体形成的途径 营养细胞发育途径: 生殖核退化,营养核发育 生殖细胞发育途径: 营养核退化，生殖核发育 营养细胞和生殖细胞同时发育的途径: 花粉均等分裂途径:,1.4.2 花药及 花粉培养,花粉及小孢子培养

29、:花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。 花粉培养的基本程序是：取材时期的确定外植体(花蕾)预处理外植体消毒花粉或小孢子的分离接种培养 取材时期的确定 四分体单核早期单核晚期双核早期双核晚期三核期 预处理有利于改变正常的发育途径，而且还可以促进花粉植株的形成,花粉或小孢子的分离: 花药小烧杯(有基本培养基)挤压花药(注射器内管) 花粉释放过滤(尼龙筛)低速离心（100-160r/min)吸管吸掉碎片加入新鲜培养基连续进行两次过滤，到每毫升含103-104个花粉/mL 培养方法 花

30、药看护培养花粉悬浮培养（微室培养）,单倍体植株的鉴定与二倍化 鉴定方法：形态学鉴定 染色体分析 单倍体植株的二倍化：秋水仙素处理加倍,优点：不受花药的药隔，药壁、花丝等体细胞的干扰；缺点是较比花粉培养难度大。为何更多的要花药培养? (药壁提供激素) 共同的目的：花粉细胞单倍体(haploid)细胞单倍体植株（但不是最终目的但具应用潜力，为什么？）经染色体加倍正常结实二倍体植株。,单倍体植物三个明显的特点： 体细胞染色体数减半； 生长发育弱，体形小、各器官明显减小； 雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。 加倍后的二倍体特点： 属于真正的纯系。和常规多代自交纯化方法相比，可节省大量的时间和

31、劳力。,单倍体植株的二倍体化,试管小苗期间用0.20.4%秋水仙溶液浸泡处理2448小时； 用同样浓度的秋水仙素溶液处理已移栽土壤的单倍体植株的生长锥 利用组织培养过程中，植物细胞易于自发加倍的特点，培养从单倍体植物上切取的外植体，诱导形成愈伤组织后再使之分化，通常可得到很高比例的二倍体。,（二）、植物胚胎培养 植物胚胎培养包括胚培养、 胚珠培养、子房培养、 胚乳培养。 1、植物胚培养(embryo culture of plants) 克服杂交育种中杂种胚的 早期夭折 胚培养包括成熟胚 (mature embryo)培养； 幼胚(immature embryo)培养,2、 子房培养 子房培养

32、包括授粉前和授粉后的子房培养。 材料的选择 品种间的差异 胚囊发育时期与花粉发育时期的相关性（大麦） 花粉发育时期 胚囊发育时期 单核中期 大孢子四分体 单核靠边期 单核至四核胚囊 二核花粉期 八核胚囊 三核花粉期 成熟胚囊,3、 胚乳培养 胚乳细胞的全能性？被子植物与裸子植物胚乳（三倍体或单倍体？） （在离体培养条件下，胚乳细胞是否与其它体细胞和花粉一样，具有全能性而再生植株。） 大多数被子植物的胚乳是三倍体，能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实；通过胚乳培养技术，探索改良农、林及园艺植物三倍体育种技术的可能性。 到目前为止，已有40多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、

33、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生植株。其它有的分化除芽、根、叶等或得到愈伤组织。,裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳为配子体的一部分，由大孢子直接分裂发育而成，因此它是单倍体组织。 在被子植物中胚乳是双受精的产物，在倍性上属于三倍体，事实上我们培养胚乳的首要目的也是为了直接获得三倍体植株。,几个概念： 什么是原生质体：？ 原生质体培养是将植物原生质体在一定条件下培养，经过细胞壁再生而形成细胞，再分裂成细胞团的过程。,第四部分 细胞融合,植物原生质体的特点（与植物细胞比）： 仍然具细胞全能性 吸收能力增强 分泌能力增强 稳定性较

34、差,原生质体融合，即体细胞杂交。用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。 原生质体制备和培养是原生质体融合的先导技术,4.1 基本程序： 原生质体制备（材料的选择、酶的使用、渗透压的调控、原生质体的收集与纯化、原生质体活力的测定 ）原生质体融合（过程/方法：自发融合、诱导融合/方式：对称融合、不对称融合；自体融合、异体融合）杂种细胞选择杂种细胞培养由杂种组织再生植株杂种或胞质杂种植株的鉴定 4.2细胞融合的意义,原生质体制备：将旺盛生长的植物细胞悬浮在含渗透压稳定剂的高渗缓冲液中，加入适量的

35、细胞壁水解酶，在一定条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。除去细胞壁碎片、未作用的细胞等，即得。,质壁分离,使相对稳定,复合酶（缓冲液+渗透压稳定剂+细胞膜保护剂+表面活性剂）,材料差异,25-30 ,取材与除菌,取材与除菌,取材与除菌,酶解,为何？,分离,洗涤,鉴定P61后保存,融合的过程：三阶段 1、凝聚作用：因胞间连丝的作用，2个或2个以上的原生质体质膜彼此靠近 2、连接“桥”的形成：质膜紧密粘连，细胞质间呈连续状态。 3、异核体或同核体的形成：细胞质桥的扩展，融合完成。,异体融合：不同种的双亲原生质体发生融合得到“异核体”,自体融合：发生在同一个亲本原生质体之间的融合得到“同核体”,一、融

36、合方法：自发融合和诱导融合 诱导融合的方法： 1、物理方法电融合法 原理 （1）交流电的作用原生质体靠近，串珠状 （2）直流电的作用破坏细胞膜，使融合 优缺点：操作简单，但设备昂贵,具体操作： （1）加样：融合培养基（葡萄糖15%+NaCl6%）2d +亲本原生质体悬浮液各1d混合，放置10-20 min （2）倒置观察 （3）通交流电1s（50Hz. 3040V）放置10-20min （4）直流电 （5）洗脱：洗脱液（CaCl2.2H2O2%+甘露醇5%）摇1h （6）离心（80g）3-5min，去上清液 （7）培养,融合成功与否的影响因素 （1）基因型-不同材料融合条件不同。 （2）原生质

37、体的浓度105/ml。大于105/ml，连珠长，易多核融合；小于105/ml，接触疏松，不易融合。 （3）亲本混合的比例与自体融合的难易有关 A B自体融合难易接近，则1：1；如A更易自体融合，则A：B=1:5-10 （4）交变电的强度：影响成串的速度和质量。 （5）直流高电压脉冲：影响异质融合率。,2、PEG-高钙高pH法： 原理： PEG促形成异核体。 高钙离子是原生质体间的联系者，可促原生质体间的粘合，使更易融合，且维持原生质体与融合体的稳定性，防破裂。 高pH使质膜表面特性发生改变从而促进融合。,水溶性高分子化合物，可做蛋白质的脱水和植物的水分胁迫实验；PEG4000，6000，100

38、00等；重复性好、对细胞无毒,操作：试管中进行 （1）加样 （2）低速离心：原生质体聚集在一起 （3）加2mL促融剂（甘氨酸-NaOH+ CaCl2.2H2O+甘露醇PEG）37水浴10-30 min （4）洗涤：甘露醇+ CaCl2.2H2O，反复两次 （5）培养,克服原生质体之间的排斥作用,影响因素： （1）原生质体密度 4%-5% （2）PEG种类和浓度：南瓜+黄瓜：PEG6000 25-35%的浓度；马铃薯栽培种+野生种： PEG4000 20-30% （3）Ca2+ pH （4）融合液的渗透压、保温时间 （5）培养时间,二、融合方式： 对称融合：完整原生质体的融合核与核融合，细胞质与

39、细胞质融合形成对称杂种，可发育成遗传稳定的异源双二倍体。,异源四倍体中,由于两个种的染色体各具有两套,染色体数为双亲之和；外型：中间类型；自交可正常结实,结果：导入有用基因的同时，也带入了不利基因,非对称融合：利用某种外界因素x射线射线对亲本之一的原生质体选择性地破坏其细胞核（A），由用碘乙酰胺等处理在细胞核中含优良基因的另一种亲本的原生质体，选择性地使细胞质失活(B)，二者的原生质体融合实现性状的优化组合形成不对称杂种,染色体达不到双亲之和；外型呈中间型或偏一方；雄性器官退化，正常花粉粒少，育性低,对称杂种：亲本双方原生质体完全融合在一起，相互之间未发生排斥。 不对称杂种：亲本双方原生质体部

40、分融合或在融合体在分裂过程中一方的部分核或质被排斥。,杂种细胞选择,1、借助于精巧的显微操作技术将融合体和杂种细胞直接挑选出来。 可见标记法：双亲及杂种的大小、颜色差异（大豆与烟草；荔枝和龙眼）； 缺点：有时不能让人信服，改进：自动细胞检测仪,大豆下胚轴原生质体-无绿色,烟草叶肉细胞-绿色,选择绿色的异核体继续培养,可见标记,荔枝原生质体-大,龙眼原生质体-小,选大的异核体,可见标记,荧光标记法：绿色荧光与红色荧光分别标记亲本，异核体发两种荧光(两种烟草叶肉细胞原生质体融合),适用范围：形态上彼此无法区分的原生质体融合,异硫氰酸荧光素,碱性絨香荧光素,2、设计一个选择程序，使在某种条件下只有杂

41、种细胞生长，而任一亲本却不能在此条件下生长，或生长速度缓慢、或中途夭折。（水稻与大麦；矮牵牛与爬山虎）,原理：利用双亲在培养基上分裂、分化性能不同来淘汰一方原生质体，再将杂种与亲本分开,水稻与大麦：,水稻（B）原生质体培养基,大麦（A）原生质体不能再生细胞壁，A、AA淘汰,二者的原生质体分开,水稻愈伤组织培养基 B BB AB长愈伤组织,水稻生根培养基 AB生根,水稻愈伤不能生根,矮牵牛叶肉细胞（A）与爬山虎冠癭细胞（B）：,NT培养基,爬山虎不能生长，淘汰B、BB,矮牵牛生长-A AA AB生长,MS培养基（无激素）,仅AB能生长）,3、利用突变细胞系的互补来选择 （1）白化互补选择（白化矮

42、牵牛A与正常矮牵牛B）,叶绿素缺失突变体，不需要合成叶绿素，在没有与合成叶绿素有关的成分的培养基（限定培养基）上能生长,在限定培养基上不能生长,限定培养基: A AA B BB AB,限定培养基: A AA AB成苗,A AA AB生长,B BB淘汰,AA A为白色,AB为绿色,（2）抗性互补选择（拟矮牵牛A和矮牵牛B）,含放线菌素D的培养基 （限定培养基）：A AA B BB AB,放线菌素D的抗性突变体,放线菌素D的药敏型,拟矮牵牛细胞A AA仅分裂，不分化,矮牵牛细胞B BB不分裂,AB的愈伤组织能分化成植株,（3）其它 ，如：生长互补选择、代谢互补选择、遗传互补选择等,鉴定： 筛选出来

43、的杂种需进一步鉴定。 形态学鉴定：通过杂种植株和亲本植株的形态学特征来鉴定,株高、株型、叶片大小、形状、气孔大小、花色等,细胞学鉴定：杂种和亲本的核型分析 以亲本为对照，对细胞杂种的染色体数目、带型（C N G带）长短、染色反应、着丝点位置等进行分析。,生化鉴定：杂种和亲本的同工酶谱分析,脂酶 过氧化物酶 苹果酸脱氢酶等,杂种细胞里，既有分别由两个亲本基因控制的某同工酶，又有重组后表达的同工酶出现,分子生物学的方法： 限制性片段长度多态性分析（RFLP鉴定）：比较双亲与杂种的DNA限制性酶切图谱来达到鉴定的目的。,随机扩增多态性DNA分析（RAPD标记鉴定）,采用随机设计引物来进行特异性DNA片段的扩增,4.2 细胞融合的意义 4.2.1 克服远缘杂交不亲和性，为广泛重组遗传物质开辟新途径(如野生种的有效利用等） 4.2.2 可缩短育种年限 4.2.3 获得新种 4.2.4 利用细胞融合技术转移细胞器（如叶绿体、线粒体等）及目的基因等。,体细胞杂交技术在农业上的应用,通过体细胞杂交培育抗病的新品种 通过体细胞杂交获得新种 通过原生质体融合转移细胞质基因控制的性状,