葡萄糖脑苷脂酶基因多态性与帕金森病的相关性研究_司君增.doc

《葡萄糖脑苷脂酶基因多态性与帕金森病的相关性研究_司君增.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《葡萄糖脑苷脂酶基因多态性与帕金森病的相关性研究_司君增.doc（4页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、海南医学 2014 年 4 月第 25 卷第 7 期 doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2014.07.0367 论 著 葡萄糖脑苷脂酶基因多态性与帕金森病的相关性研究 司君增，魏丽萍，郭秀玲，宋方禹，亓勤德 （莱芜市人民医院神经内科，山东 莱芜 271199） 【摘要】 目的 研究中国 山东人群帕金森病 患者的 葡萄糖脑苷脂酶 (Glucocerebrosidase， GBA)基因 N370S、 V394L 和 L444P 突变位点 多态性，探讨 GBA 基因 突变与帕金森病的 相关性。方法 应 用 PCR 产物直 接 DNA 测 序法对 60 例 帕金森病患者及 6

2、0 例正常对照组 的 9、 10 号外显 子进行检测，然后进行测序 对比分析。结果 测 序 结果 显 示帕 金森 病 患者 和 正常 对 照组 的 GBA 基 因 外显 子 9 和外 显 子 10 核 苷酸 序 列完 全 一致 ，未 发现 突 变 点。结 论 该研究不支持 GBA 基因 N370S、 V394L 和 L444P 突变位点是中国山东人群帕金森病的危险因素。 【关键词】 帕金森病；葡萄糖脑苷脂酶基因；基因突变 【中图分类号】 R742.5 【文献标识码】 A 【文章编号】 1003 6350（ 2014） 07 0944 03 Association between glucoce

3、rebrosidase genetic polymorphisms and Parkinsons disease. SI Jun-zeng, WEI Li-Ping, GUO Xiu-ling, SONG Fang-yu, QI Qin-de. Department of Neurology, Laiwu Peoples Hospital, Laiwu 271199, Shandong, CHINA 【 Abstract】 Objective To study the polymorphisms of Glucocerebrosidase (GBA) gene mutation sites (

4、N370S, V394L and L444P) in patients with Parkinsons disease in Shandong province of China, and to explore the re- lationship between GBA gene and Parkinsons disease (PD). Methods Exon 9 and exon 10 of GBA gene were ampli- fied the in 60 PD patients and 60 normal controls by polymerase chain reaction

5、 (PCR). PCR products were analyzed by direct DNA sequencing. BLAST was used for sequences analysis. Results The sequence results demonstrated that the nucleotide sequences of exon 9 and exon 10 of GBA gene in the patients of Parkinsons disease and normal controls were the same, with no mutation foun

6、d. Conclusion The GBA gene mutation sites (N370S, V394L and L444P) may not be risk factors for PD in Chinese Shandong population. 【 Key words】 Parkinsons disease; Glucocerebrosidase gene; Gene mutation 帕金森病 (Parkinsons disease， PD)是一种中老年人 金森病的诊断参照英国脑库的诊断标准。对照组系 常见的运动障碍疾病。由于该病具有较强的致残性，严 莱芜市人民医院门诊健康体检

7、人员，排查锥体外系及 重影响了患者的正常工作及生活，给患者家属及社会带 其他神经系统变性疾病。病例组及对照组各 60 例， 来了沉重的负担，已成为社会关注的焦点之一 。研究 均为山东地区汉族，性别及年龄分布两组间差异无统 易感候选基因是探索 PD 这种复杂疾病的关键步骤。 计学意义 (P0.05)，具有可比性。 近年来， GBA 基因成为研究的热点，而且，不同种族不 1.2 研究方法 同区域人群有遗传异质性，之前的研究结果不一 。 1.2.1 提取基因组 DNA 抽取研究对象外周静 重要的是，中国人群 PD 患者基数庞大，中国大陆山东 脉血 5 ml，用乙二胺四乙酸二钠 (EDTA)抗凝。常规

8、 人群尚未有类似报道，说明开展对山东人群的 GBA 基 酚 /氯仿法提取基因组 DNA。 因与 PD 相关性的深入研究，具有重要的意义。 1.2.2 聚合酶链扩增反应 (PCR)引物合成 真、 1 资料与方法 假基因具有高度同源性，首先将真假基因区分开，在 1.1 一般资料 病例组系 2011 年 9 月至 2013 年 此基础上分别扩增单个外显子；参照相关文献设计 7 月山东省莱芜市人民医院、山东大学齐鲁医院、山 引物 ，由上海生工公司合成。引物序列见表 1(均为 东省立医院神经内科门诊及住院的帕金森病患者，帕 5-3方向 )。 表 1 GBA 基因 PCR 引物序列 扩增外显子 正向引物

9、反向引物 产物长度 (bp) 811 TGTGTGCAAGGTCCAGGATCAG ACCACCTAGAGGGGAAAGTG 1682 9 CACAGGGCTGACCTACCCAC GCTCCCTCGTGGTGTAGAGT 362 10 CAGGAGTTATGGGGTGGGTC GAGGCACATCCTTAGAGGAG 329 基金项目：莱芜市人民医院科研立项课题（编号： yylx2013022） 通讯作者：司君增。 E-mail： 944 1 2-3 2 Hainan Med J, Apr. 2014, Vol. 25, No. 7 1.2.3 PCR 反应条件 94 预变性 5 min，

10、 94 2.2 海南医学 2014 年 4 月第 25 卷第 7 期 DNA 直接测序结果 测序结果经序列比对 变 性 5 min，退火 45 s (外 显子 811、外 显子 9、外 显 子 10 的退火温度分别为 40 、 50 、 50 )， 72 延伸 1 min， 30 个循环，最后 72 终延伸 7 min。 1.5%琼脂 糖凝 胶检验 PCR 扩增产物。反应体系总体积 25 l， 包括 ddH2O、 10 PCR buffer、 5 mmol/L 的 4 种 dNTP、 5 mmol/L 的 MgCl2 、 10 mol/L 引物 A (正向 )、 10 mol/L 引物 A (

11、反向 )、模板 DNA、 TaqDNA 聚合酶 (5 U/l)。 1.2.4 序列测定 从琼脂糖凝胶中回收扩增外 显子 9、外显子 10 的 PCR 产物，纯化产物测序委托上 海生工公司和北京天根公司完成，测序结果与 Gene- Bank 提供的序列用 Blast 软件进行比对；根据比对结 果判别基因有无突变。 2 结 果 2.1 琼脂糖 凝胶电 泳结果 通过 PCR 扩增 反 应， GBA 基因第 811 外显子扩增成功 (扩增片段长度 1 682 bp，见 图 1)，将 其产 物 纯 化后 作 为模 板 扩 增 GBA 基因外显子 9 (扩增片段长度 362 bp，见图 2)和 外显子 1

12、0 (扩增片段长度 329 bp，见图 3)也扩增成功， 琼脂糖凝胶电泳结果显示为相应特异长度的单一条 带，部分电泳图如下： 后 PD 病例组和对照组均未发现 GBA 基因 9 号外显 子 N370S (见图 4)突变和 V394L (见图 5)突变，也未发 现 10 号外显子 L444P (见图 6)突变。部分测序峰图 如下： 图 4 N370S 突变：图中 68 位 AG 图 5 V394L 突变：图中 139 位 GT 图 1 811 号外显子条带（ 1 682 bp） 3 讨 图 6 论 L444P 突变：图中 118 位 TC 图 2 图 3 9 号外显子条带（ 362 bp） 10

13、 号外显子条带（ 329 bp） 葡 萄糖 脑 苷脂 酶 (GBA) 基 因定 位 于人 染 色体 1q21。基因全长为 7.6 kb，含 11 个外显子；假基因位于 下游 16 kb。在同源区内， 96%的核苷酸是一致的 。 因此研 究 GBA 基因，尤其在研究 GBA 基因的多态性 时，前提必须将真、假基因区分开，否则课题研究将导 致一系列的误差，本文根据真假基因序列的差异而设 计的特异引物首先扩增真基因的外显子 811，此引 物与假基因不能结合从而不能扩增假基因，从而将此 片段的真假基因区分开，然后根据每个外显子设计相 应引物扩增单个外显子 。 GBA 基因编码由 536 个氨基酸组成的

14、葡萄糖脑 苷脂酶，该酶将葡萄糖脑苷脂水解为神经酰胺被机体 945 4 海南医学 2014 年 4 月第 25 卷第 7 期 再利用。 GBA 基因突变导致葡萄糖脑苷脂酶活性降 低，不能将葡萄糖脑苷脂水解为神经酰胺，释放的葡 糖脑苷脂就会被网状内皮系统 (脾、肝、骨髓 )中的巨 噬细胞吞入并储存于其溶酶体中形成十分独特的微 病的发病机制中， GBA 基因突变参与发病的可能性， 在以后的研究中，我们将增大 PD 患者样本量及基因 位点的监测，为进一步阐明 PD 的发病机制提供宝贵 的基础资料。 人 脑 胶 质 瘤 中 管状结构，进而干扰正常细胞凋亡 5 。 参 考 文 献 梁 晓 阳 ， 刘 洛同

15、 ， 明 戈谢 病 (Gauchers disease)是 一种常染色体隐 形 遗传疾病，称葡萄糖神经酰胺贮积病，一般认为其病 1 Levy G, Tang MX, Louis ED, et al. The association of incident de- mentia with mortality in PD J. Neurology, 2002, 59(11): 1708-1713. （ 泸 州 医 学 院 附 属 医 院 神 经 外 科 ， 四 川 泸 州 2 Bonifati V, Rizzu P, Squitieri F, et al. DJ-1( PARK7), a nove

16、l gene 【 摘 要 】 目 的 探讨不同 级别 胶 质 瘤 中 Fas、 Caspase- 8 的 表 达 情 况 。 方 法 因源于葡萄糖脑苷脂酶 (GBA)基因突变导致该酶活 for autosomal recessive, early onset parkinsonism J. Neurol Sci, 质 瘤 组 织 标本 和 1 5 例 正 常 对 照 标本 ， 采 用 免疫 组 化 S P 法 检 测 Fas、 C as pas e-8 的 表 达 。 结 果 性降低，造成葡萄糖脑苷脂酶在网状内皮组织巨噬细 2003, 24(3):159-160. (LG G， 胞中的大量沉积

17、，出现了特征表现的戈谢细胞。目前 3 Valente EM, Abou-Sleiman PM, Caputo V, et al. Hereditary ear- 阳 性 率分别 为 8 1. 8 % (27/33 )和 48 .6 % (17/35 )。 2 已经报道的 GBA 基因突变有 200 多种，其中 常见的 ly-onset Parkinso ns disease caused by mutations in PINK 1 J. Caspase-8 的 阳 性率 越 低 ( =8. 221 ， P=0. 0040.0 5)。 有 N370S、 84GG、 L444P， V394L，研

18、究发现在犹太 民 族戈谢患者中 N370S 突变占到 78%，而在非犹太民族 4 Science, 2004, 304(5674): 1158 -1160. Bembi B, Zambito Marsala S, Sidransky E, et al. Gauchers disease 与 Caspase-8 的 表达呈负 相 关 (rs=-0 .348， P0.0 1 )。 功 能 的 下 降与 胶 质 瘤 的 发 生 和 发 展 密 切 相 关 。 结 论 戈谢病患者中最常见的突变则是 L444P (36%)，其次 with Parkinsons disease: clinical and

19、 pathological aspects J. Neu- 【 关 键 词 】 是 N370S (23%) ，因此本研究选取了以上突变频率 5 rology, 2003, 61(1): 99-101. Whaley NR, Uitti RJ, Dickson DW, et al. Clinical and pathologic 【 中 图 分 类 号 】 R73 0. 264 【 文 献 标 识 码 】 A 【 文 章编 号 】 最高的三个位点 N370S、 V394L 和 L444P 进行研究。 我们的研究结果发现 60 例帕金森病患者和 60 例 正常对照的 GBA 基因的外显子 9、 1

20、0 的核 苷酸序列 完全一致，未发现 基因突变，这与焦玲等 对中国贵 州 人群的 研究报 道结果相 一致。 该研究 也未发 现 V394L 和 L444P 突变，但在挪威、巴西、以色列、意大 利、台湾、新加坡华裔人群等 PD 患者的研究中却发现 了这 两个位点的突变 。这种 差异可能是因为 我 们 的研究样 本量相对 较小，或 者是地区 、种族差异 引起。 6 7 8 9 features of families with LRRK2-associated Parkinsons disease J. J Neural Transm Suppl, 2006, 70: 221-229. Gugg

21、enbu hl P, Grosbois B, Chales G. Gaucher disease J. Joint Bone Spine, 2 008, 75: 11 6-1 24. Beutler E. Gaucher disease: Multiple lessons from a single gene dis- order J. Acta Paediatr Suppl, 2006, 95: 103-109. 焦 玲 , 司君增 , 楚 兰 . 葡糖糖脑苷脂酶基因多 态性与帕金森病 的相关性 J. 江苏医药 , 2010, 36(5): 518-520. Prestel J, Sharm

22、a M, Leitner P, et al. PARK11 is not linked with Par- kinsons disease in European families J. Eur J Hum Genet, 2005, 13 (2): 193-197 国外学者研究以色列德 系犹太人帕金森病患者 的 GBA 基因突变， N370S 是最常见突变位点；挪威学 者对 311 例 PD 患者 GBA 基因进行筛查，结果发现 7 例有基因突变的患者中有 4 例为 N370S 突变；然而台 湾及新加坡华裔人群 PD 患者的 GBA 基因测序分析 未发现 N370S 突变 。因此，我们推测 N

23、370S 位点不 是亚洲人群的突变热点，而是欧洲、美洲等发达国家 PD 患者 GBA 基因的突变热点，同时也表明 GBA 基 因 N370S 多态性可能因人群种族和地区不同而存在 差异性。 尽管本研究我们 未发现 PD 患者及正常对照组的 葡萄糖脑苷脂酶基因突变，但不能就此排除在帕金森 10 Maraganore DM, de Andrade M, Lesnick TG , et al. High-resolution whole-genome association study of Parkinson disease J. Am J Hum Genet, 2005, 77(5): 685-

24、693. 11 Pankratz N, Foroud T. Genetics of Parkinson disease J. Neuro Rx, 2004, 1(2): 235-242. 12 Heutink P. PINK-1 and DJ-1-new genes for autosomal recessive Parkinsons disease J. J Neural Transm Suppl, 2006, 70: 215 -219. 13 Kubo S, Hattori N, Mizuno Y. Recessive Parkinso ns d isease J. Mov Disord,

25、 2006, 21(7): 885-893. 14 Kubo S, Hattori N, Mizuno Y. Recessive Parkinso ns d isease J. Mov Disord, 2006, 21(7): 885-893. 15 Prestel J, Sharma M, Leitner P, et al. PARK11 is not linked with Par- kinsons disease in European families J. Eur J Hum Genet, 2005, 13(2): 193-197. (收稿日期： 2013-10-25) 【 Key words】 6-7 8 9-15 12 946