性病实验室梅毒SOP1资料.doc

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1、山东省皮肤病医院性病实验室操作手册文件名称梅毒螺旋体检测标准操作规程编 码页 数实施日期制 订 人审 核 人批准人制订日期审核日期批准日期目 的：标准的梅毒螺旋体检验操作，确保检测结果准确。适用范围：性病实验室工作人员责 任 人：实验操作者1、标本的采集与处理操作应标准化。所有标本都应当被视为具有传染性，医务人员应戴手套慎重操作。梅毒的实验室诊断主要有病原体检测和血清学检测方法，各期梅毒的检测方法及部位见下表。临床表现取材部位检查方法一期梅毒溃疡、淋巴结、血液暗视野检查、血清学检查二期梅毒皮损、淋巴结、血液暗视野检查、血清学检查潜伏梅毒血液血清学检查三期梅毒血液、脑脊液血清学检查神经梅毒血液、

2、脑脊液血清学检查血液1.2.1.1血清标本根据需要，用一次性真空采血针与促凝采血管抽取静脉血2-5 ml，室温静置1-2小时或37静置30分钟，待血液凝固、血块收缩后，3000r/min离心10-15分钟，别离新鲜血清，备用。也可采用保存于2-8或-20的血清。溶血、脂血或污染的标本可影响试验结果。1.2.1.2血浆标本根据需要，用一次性真空采血针与抗凝采血管抽取静脉血2-5 ml，轻轻颠倒混匀8-10次，3000r/min离心10-15分钟，别离血浆，备用。血库血浆以及EDTA抗凝血浆同样可以用于梅毒血清学实验一般仅用于RPR实验，但易出现假阳性反响需用血清复试，如用其他抗凝剂应首先评价后再

3、用。1.2.1.3末梢全血消毒局部皮肤成人和1岁以上儿童可选择手指或耳垂，1岁以下儿童采用足跟部。一次性采血针刺破皮肤，用无菌棉签擦掉第一滴血。收集滴出的血液，立即用于检测。1.2.2皮损部位组织液.1用于病原学检查用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损外表的污物，钝刀/刮勺轻刮、挤压皮损部位，取渗出液与预先滴加在载玻片上的生理盐水混合后加盖玻片立即用于暗视野显微镜检测，或取渗出液直接涂片，用于镀银染色试验。.2用于核酸检测用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损外表的污物，钝刀/刮勺轻刮、挤压皮损部位，刮取渗出液，参加有DNA保存液1ml/管的标本管中，备用。淋巴液无菌操作下穿刺腹股沟淋巴结，注入0.

4、3ml无菌生理盐水并反复抽吸2-3次，取少量的淋巴液直接滴于载玻片上，加盖玻片后立即进展暗视野镜检或备用。脑脊液操作由专业人员进展，一般用腰椎穿刺术获得。患者侧卧于硬板床，两手抱膝紧贴腹部，头向前胸屈曲，使躯干呈弓形，以髂后上棘连线与后正中线的交点为穿刺点，相当于第3-4腰椎棘突间隙，消毒处理后，用2%利多卡因自皮肤到椎间韧带作局部麻醉。术者用左手固定穿刺皮肤，右手持穿刺针以垂直背部方向缓缓刺入，针尖稍斜向头部，成人进针深度约4-6cm，儿童约2-4cm。当针头穿过韧带与硬脑膜时，有阻力突然消失落空感，此时可将针芯慢慢抽出，即可见脑脊液流出，至于适宜的容器中，备用。核对样品与运送单，检查样品管

5、有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒并做记录。检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、脂血以及黄疸等情况。如果样品污染或者认为样品不能被承受，应将样品平安废弃。并将样品情况立即通知运送机构。对不合要求的标本，可以拒绝承受。2、梅毒的实验室检查原理梅毒螺旋体侵入人体后，在皮肤黏膜下增殖，并很快沿着淋巴管到达附近淋巴结，经过2-4周的潜伏期，在侵入部位发生炎症反响，称为硬下疳，数天到1周后，淋巴结肿大。二期梅毒是梅毒螺旋体由局部经淋巴结进入血液，在人体内大量播散后而出现的全身表现，一般发生在感染后的7-10周或硬下疳出现后6-24周，主要为皮肤黏膜损害，有扁

6、平疣、黏膜斑和玫瑰斑疹等。患梅毒的孕妇可以通过胎盘使胎儿受染。研究证明，在妊娠期7周时，梅毒螺旋体即可通过胎盘。其梅毒患者硬下疳、淋巴结、皮肤黏膜损害以及孕妇羊水中均可检查到梅毒螺旋体。将标本置于暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上，可使梅毒螺旋体折射出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进展检测。方法.1仪器耗材：1) 暗视野显微镜2) 无菌纱布3) 不锈钢刮刀4) 灭菌棉拭子5) 载玻片、盖玻片6) 注射器，注射针头7) 灭菌生理盐水.2检测流程1) 将待检标本制成生理盐水涂片，加盖玻片后立即备检。2) 在预先调整好的暗视野显微镜的聚光器上加数滴浸油，轻轻调低聚光器，使之在载物台

7、下方。3) 将标本玻片置载物台上，上升聚光器，使浸油接触载玻片底面，防止浸油内有气泡。4) 镜检：先低倍后高倍，寻找有特征形态和运动方式的梅毒螺旋体。结果.1结果判读：在暗视野显微镜下观察,发现有纤细、白色、有折光的螺旋状微生物，长6-20um,um，有6-14个螺旋，具有旋转、蛇行及伸缩等特征性的运动方式，可判断为梅毒螺旋体。.2结果报告：暗视野显微镜下假设发现上述特征的梅毒螺旋体那么报告阳性结果；未见到上述特征的梅毒螺旋体那么报告阴性结果。临床意义1) 梅毒螺旋体暗视野显微镜检测阳性在临床上可确诊梅毒，特别是对于有皮肤黏膜损害和淋巴结病变的一、二期梅毒的诊断具有重要价值，且具有快速，方便，

8、易操作等特点。2) 假设未能发现梅毒螺旋体，不能排除梅毒诊断。阴性结果原因可能为：标本中的微生物数量缺乏单次的暗视野检测其敏感性低于50%、病人已承受治疗、皮损已接近自然消退或取自非梅毒性皮损。3) 无论暗视野显微镜检查的结果如何，都应进一步进展血清学检测。考前须知1) 取材前，应用无菌生理盐水清洁皮肤外表，取材时应注意无菌操作。2) 应取到组织渗出液，尽量防止出血，以提高检出阳性率。3) 取材后应立即置暗视野显微镜下观察，如搁置太久，梅毒螺旋体活动能力会下降，导致镜下难以观察到阳性结果。4) 对口腔溃疡标本，在暗视野显微镜下如观察到梅毒螺旋体的特征性形态和运动方式，应与其他螺旋体相区别。2.

9、2.甲苯胺红不加热血清试验TRUST原理梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主迅速对感染早期被损害的自身细胞以及梅毒螺旋体细胞外表所释放脂类物质做出免疫应答，在3-4周内可产生抗类脂抗原的抗体亦称为反响素。这种抗体在体外可与心磷脂、卵磷脂和胆固醇等组成的抗原0.03%心磷脂、0.21%卵磷脂和0.90%胆固醇发生抗原-抗体反响。心磷脂、卵磷脂和胆固醇都是醇溶性脂类，遇水形成胶体溶液。当含有反响素的梅毒血清与之混合时，即粘附在胶体颗粒的周围。经摇动、碰撞，形成抗原抗体复合物，出现凝集颗粒，即为阳性反响。甲苯胺红不加热血清试验即在抗原中参加甲苯胺红颗粒作为指示物，与待检血清浆中的反响素结合，形成肉眼可见的红

10、色絮状物。血清不需灭活，肉眼可观察结果。方法.1仪器耗材：1) TRUST试剂盒2) 水平旋转仪：要求旋转环状直径为2cm，转速为1002r/min，并带有计时器和保湿盖3) 无菌生理盐水0.9%.2检测流程：1) 试剂准备：检测前将试剂盒置室温预温30分钟2) 加标本：吸取50l血清浆置试验卡片圈中，并均匀地涂布在整个卡圈内。不能将标本溢出环圈外面。3) 加抗原：将抗原轻轻摇匀，在每个标本圈中，用专用滴管针头垂直滴加1滴601滴/ml，约17l/滴抗原,不需要手工混匀。4) 反响：将卡片置水平旋转仪上，建议罩上保湿盖，1002r/min旋转8分钟。5) 从旋转仪中取出卡片后立即在亮光下用肉眼

11、观察结果。用手轻微的旋转或倾斜卡片可有助于弱阳性和阴性标本。1) 实验卡片准备：在卡片中圈1到圈4中分别标上1:2，1：4，1：8，1：162) 稀释液准备：在圈1到圈4中参加50l生理盐水，勿将盐水液滴涂开。3) 标本稀释：吸取50l血清浆于圈1中，用移液器来回吸放5-6次已混合圈1中的生理盐水和标本，但要防止产生气泡。从圈11:2中移取50l到圈21：4用上述同样方法混合后依次稀释至圈31：8和圈41：16。混旋后从圈4中弃去50l。4) 依次从圈4-圈1将不同稀释度的标本涂布整个圈内。5) 加抗原等以下实验步骤同定性试验的2-4。6) 如阳性反响滴度大于1;16,那么继续稀释以测定最高稀

12、释反响滴度。结果.1结果判读1) 阳性反响：圆圈内出现中或大的红色絮状物，液体清亮；2) 弱阳性反响：圆圈内出现小的红色絮状物，液体混浊；3) 阴性反响：圆圈内仅见炭颗粒集中于中央一点或均匀分散。.2结果报告1) 定性试验：出现凝集反响报告阳性，不产生凝集反响报告阴性。2) 定量实验：出现凝集反响的血清最高稀释倍数为抗体滴度，结果报告滴度为1：X，X依次为1、2、4等稀释倍数。临床意义1) 梅毒螺旋体一旦感染人体后产生抗类脂抗原的抗体，未经治疗可长期存在。经适当治疗后，抗体可以逐渐减少至转为阴性，早期梅毒一期、二期经足量规那么抗梅毒治疗后3个月，TRUST抗体滴度可下降2个稀释度，6个月可下降

13、4个稀释度，一期梅毒一般约1年后可转为阴性，二期梅毒2年后可转为阴性。但晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反响仍为阳性。2) TRUST定性试验结果可用于现症梅毒诊断。TURST定量试验结果可用于疗效观察和判愈。考前须知1) 生物学假阳性：非梅毒螺旋体抗原血清学试验采用的抗原为心磷脂、卵磷脂和胆固醇的混合物，所检测的抗心磷脂抗体易见于其他多种疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、结缔组织病、静脉吸毒者以及怀孕的妇女等。因此该类反响会出现假阳性反响。所以该类试验阳性标本需进一步采用梅毒螺旋体抗原血清学试验如TPPA、ELISA等复检，以排除生物学假阳性，确认是否为梅毒螺旋体

14、感染。2) 前带现象：只对早期梅毒患者进展非梅毒螺旋体抗原血清试验时，有时血清中存在高浓度的抗体，导致抗原抗体浓度不匹配，出现弱阳性、不典型或阴性反响的结果，此时需将血清稀释后再进展试验，可出现阳性结果。该现象称为前带现象。2.3梅毒螺旋体明胶凝集试验TPPA原理梅毒螺旋体颗粒凝集试验TPPA是用超声裂解梅毒螺旋体抗原致敏明胶粒子，致敏粒子与待检血清浆中的梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可见的颗粒凝集。方法.1仪器耗材：1) TPPA检测试剂盒2) 移液器3) 保湿盒.2检测流程：1) 试剂准备：试验前30分钟将待检标本和试剂从冰箱中取出，恢复至室温。2) 加稀释液：每份样本作4孔，用移液器将血清

15、稀释液滴入微量反响板第1孔100l，从第2孔-第4孔各滴25l。3) 样本稀释：用移液器取待检血清25l置第1孔中，然后以2n 的方式从第1孔稀释至第4孔。4) 加对照液：用移液器在第3孔滴入25l未致敏粒子；在第4孔滴入25l致敏粒子。5) 混合：以不会导致微量反响板内容物溅出的强度混合30秒钟。6) 反响：加盖置湿盒内，于室温15-30下水平静置。2小时后观察并记录结果。附：重吸收试验对于未致敏粒子和致敏粒子均显示以上凝集的样品，要按照以下程序在完成吸收操作的根底上进展再试验。1) 取用定量的溶解液调制好的未致敏粒子0.95ml至小试管中。2) 参加样品50l混合，于室温15-30下放置2

16、0分钟以上。3) 离心别离2000rpm、5分钟，然后分别吸取上清液【吸收完毕的稀释样品1：20】50l至反响板第3孔中，特别注意不要混入粒子。4) 从第4孔以后，要预先各滴入25l血清稀释液，从第3孔至最后一孔用移液器以2n 的方式进展稀释。5) 之后的步骤同上。结果.1结果判读首先观察未致敏粒子反响孔是否出现凝集第3孔，判断试验有效性后，再根据致敏粒子与标本反响孔第4孔与致敏粒子是否产生1+ 2+凝集反响凝集反响，判断结果。如未致敏粒子反响孔出现凝集第3孔为无效试验，需要对标本进展重吸收试验后再进展检测。+ ：产生均一的凝集，凝集粒子在底部，呈膜状延展；+ ：粒子环明显变大，其外周边缘不均

17、匀且杂乱的凝集在周围； ：粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形；- ：粒子呈纽扣状聚集，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形。.2结果报告阳性：未致敏粒子反响孔第3孔不出现凝集，致敏粒子反响孔第4孔出现1+2+凝集反响，报告阳性。阴性：未致敏粒子反响孔第3孔和致敏粒子反响孔第4孔均未出现凝集反响，报告阴性。弱阳性：未致敏粒子反响孔第3孔不出现凝集，致敏粒子反响孔第4孔出现凝集反响，报告弱阳性。临床意义1) 梅毒螺旋体一旦感染人体后约2-4周即可检测到抗梅毒螺旋体抗体，此抗体特异性高可达98%以上，所以检测到梅毒螺旋体抗体阳性可确证为现在或既往有过梅毒螺旋体感染。2) 患者感染梅毒螺旋体后产

18、生的抗梅毒螺旋体抗体一般能保持终生，梅毒患者即使经过正规疗程的抗梅毒治疗后，梅毒螺旋体抗原血清学试验仍可阳性，故梅毒螺旋体抗原血清学试验不能作为疗效观察的指标。3) 梅毒螺旋体抗原血清试验亦不能区分既往感染和现症感染，试验阳性结果应进一步进展非梅毒螺旋体抗原血清试验，以判断是否为梅毒现症感染。考前须知1) 假设未致敏粒子孔出现凝集反响，血标本需要进展吸收后再重复试验，或改用其他方法复检。2) 试验参加致敏粒子、未致敏粒子后，应以不会导致微量反响板内容物溅出的强度混合。3) 红细胞及其他血液的有形成分会影响结果，所以血液标本应通过离心别离血清。4) 致敏粒子以及未致敏粒子在使用之前均应混合均匀后

19、再使用。5) 微量反响板中的内容物充分混匀后再静置，静置过程中一定要对反响板加盖并制止振摇。6) 梅毒螺旋体感染初期，有可能不产生抗体，或虽然产生抗体但数量很少的情况。2.4 梅毒螺旋体IgM检测 原理梅毒螺旋体溶解物经处理后，将其中的螺旋体蛋白成分用聚丙烯凝胶蛋白电泳按分子量分馏，之后经二次电泳转移至硝化纤维薄膜上，风干切片，最后制成测试条，病人血清稀释后与检测条一起孵育，如果存在梅毒螺旋体特异性抗体，那么抗体会与相应的抗原条带结合。冲洗未结合的酶结合抗体后，测试条最后与染色剂反响，在与抗原条带结合的抗体上产生紫色的沉淀。在特异性条带15.5 ，17，47KD上产生的反响具有临床意义。在其它

20、位置也有可能出现条带，但并不具有临床意义。每条测试条的顶端数字标签下都有血清和酶的加样质控带。这些质控带用于确认病人样本和酶的加样。方法.1仪器耗材1) 梅毒螺旋体IgM试剂盒2) 移液器3) 平台摇摆仪.2检测流程1) 用钝头镊子按需将电泳条取出手不能碰到电泳条，放在孵育盒的小槽中，每槽一条，数字面向上。2) 注意检测条使用前需预湿处理，直接对着检测条中央缓慢参加2.0ml样本稀释液/冲洗液至每一槽中，确保所有检测条浸湿，检测条不能局部漂于缓冲液面上。3) 将孵育盒置于平台摇摆仪上设置最小摆角72,40-45个循环/分钟，浸泡及摇摆至少5分钟。4) 在第一第二槽分别参加80ul阳性质控及阴性

21、质控，在各相应槽中参加20ul病人血清标本，当缓冲液流至槽的前端时参加。5) 将孵育盒置于平台摇摆仪，孵育及摇摆45分钟，之后取出。小心倾斜孵育盒倒出液体。6) 在每槽中参加2.0ml样本稀释液/冲洗液，置于平台摇摆仪摇摆5分钟7) 完全倒出小槽中液体，重复6，7步骤2次8) 在每槽中参加2.0ml稀释后的酶结合抗人IgM抗体，防止平台摇摆仪赋予及摇摆15分钟。9) 倾斜孵育盒倒出酶结合抗人IgM抗体10) 在每槽中参加2.0样本稀释液/冲洗液，置于平台摇摆仪摇摆5分钟11) 完全倒出小槽中液体，重复10，11步骤2次12) 在每槽中参加2.0ml蒸馏水，置于平台摇摆仪摇摆1分钟。13) 完全

22、倒出小槽中液体14) 在每槽中参加2.0ml染色剂，置于平台摇摆仪摇摆5-10分钟或直到阳性质控充分显色。条带明显、清晰、清楚15) 从平台摇摆仪取出孵育盒16) 用蒸馏水冲洗3次以终止反响17) 用钝头镊子将湿检测条取出，放置在纸巾上自然风干18) 风干后的检测条可随时阅读，将标本条，阳性质控条及阴性质控条粘贴在检测条结果粘贴单上，之后放入塑料保护袋内，放至阴凉，枯燥处勿置于阳光下结果1)2) 中只有一个位置出现明显色带，结果可疑3) 三个位置全部没有出现明显色带，表示梅毒阴性。临床意义1) 来源于其他螺旋体病原体疾病病人的血清，如莱姆病，雅司病，品他病，钩端螺旋体病和回归热，可能会出现假阳性结果。需要进展临床，流行病学和实验室调查以防假阳性结果出现2) 对于晚期感染的检测，需使用检测IgG抗体的试剂系统3) 所有检测结果必须考虑病人提供的临床病史，梅毒螺旋体危险区域的接触史，流行病学数据和其他检测的结果。考前须知1) 阳性质控条带应显示出明显的色带2) 阴性质控不应显示有色带，非有色带的标准是显色非常微弱难以观察到3) 如果阴性和阳性质控得色带区显示不符合要求，或血清和酶质控带同时也没有反响，那么实验无效不能报告结果。4) 每个病人的检测条上的血清质控带和酶质控带都应该显色。如果任一质控带未显色或无显色，那么实验无效该病人的结果不能报告。