基因克隆.docx

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1、基因克隆I CDNA的TA克隆一、实验目的1、学习和掌握常用PCR产物克隆方法的原理2、掌握PCR产物的T-vector克隆的操作方法3、掌握用氯化钙法制备感受态细胞的原理和方法二、实验原理Taq DNA聚合酶能够在PCR产物的3,末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带 有3，T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，对PCR产物进行直接克隆。 本实验使用的T载体为TaKaRa公司的pMD-19T,由pUC18载体改建而成，在两侧的3端添 加了 “T”的线性化载体。由于载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制能切 下，需要在PCR扩增产物上引入合适的酶

2、切位点。三、实验步骤1、DNA与T载体的连接反响，反响体系：10ul成分体积或用量PMD19-T 载体lul插入DNA2ul超纯水2ulSolution I5ul把以上混合均匀，16反响3h。2、感受态细胞的制备(1)取1ml过夜培养物，接种到含lOOmILB培养液的500ml锥形瓶中，37振荡培养，直 至培养液中细菌浓度到达ODgoo为；(2)分别取1ml菌液至1.5ml离心管中,冰上放置lOmin, 4000r/m, 4离心15min,弃上 清；(3)将菌体悬浮于500ul预冷的0. Imol/L氯化钙溶液中，冰上放置lOmin；(4) 4000r/m,离心2min,弃上清，将细胞轻轻悬浮

3、在lOOul氯化钙溶液中。II重组质粒的转化及重组子筛选鉴定 一、实验目的1、学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法2、学习和了解蓝白斑筛选法的原理3、掌握PCR法快速筛选重组克隆的操作方法二、实验原理细菌处于0、氯化钙的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强；在冷热变化刺激 下细胞膜外表产生裂缝，使外源DNA进入，从而实现细胞的转化。蓝白斑筛选法所用的载体带有一个LacZ基因的调控序列和编码Q .互补肽，重组子由于 外源片段的插入使a肽基因失活不能形成a互补作用，在X-gal平板上，重组子克隆为无色 菌落，非重组克隆为蓝色菌落。用PCR法对重组子进行鉴定，可以快速扩增插入片段，再进行

4、琼脂糖凝胶电泳，初步 判断插入片段的大小是否符合预期。三、实验步骤1、LB/Amp平板制备，冷却凝固后,涂布Xgal40ul和IPTGlOul；2、将老师分发的1003商品化大肠杆菌平均分为两管，编号1、2,自己制备的感受态细胞 编号为3；3、1号管加l.5ul质粒作为正对照，2号管加L5ul连接产物，3号管1003感受态细胞加连 接产物；4、冰上放置30min；5、42c热激45s,迅速在冰浴中冷却5min；6、1、2号管加4503 LB液体培养液，3号管加400ul LB液体培养液，37振荡培养60min； 7、各取50ul菌液涂布LB平板，3号管剩下的菌液浓缩到50ul涂布另一块LB板，

5、涂布均匀, 放37培养箱过夜培养；8、第二天观察比照四个平板的菌落生长情况和菌落蓝白色，数正对照蓝色菌落数，计算转 化效率；9、挑选单菌落到含有ImILB培养液的L5ml离心管中，摇菌3h；10、离心收集细菌，做菌落PCR；11、挑取2号管中单个菌落在400ulLB-Amp培养基上摇菌3h,作为模板进行PCR反响。12、PCR反响体系：10ul每管/组(ul)实配(ul)上游引物0.44.8下游引物0.44.85X PCR Buffer224Taq酶0.22.4菌液样品2超纯水513、PCR循环程序stepl94变性3 minstep294。变性30 secstep360复性30 secste

6、p472 延伸Iminstep572 温育lOminStep2-4运行30个循环14、电泳检测反响结束后,取全部PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,确认PCR产物的大小是否符合预期, 在本实验中使用载体通用引物m3,空载体扩增片段为lllkb,插入片段485kb,预期的片 段大小在600bp左右，电泳完成后在凝胶成像系统拍照。四、实验结果(1)转化效率本小组所做两个正对照得到蓝色菌落数分别为9,17,取平均值13,正对照加的质粒为 L5ul的Q05ng/ul,最后涂布平板时取了 ”10,那么计算得到转化效率=13cfu/ (1.5X0.05X0.1) ng=1.73X103cfu/ng(2)电泳检测

7、结果本小组得到的电泳结果如图一，四个样品得到的PCR产物片段大小在600bp左右，M 为DNA Marker, 1-4号泳道为本小组样品。M12341500bplOOObp500bpM： DNA marker； 1-4：小组样品图一 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果 五、讨论与分析本小组得到的正对照蓝色菌落斑点计算出来的转化效率数量级在正常范围，可用于正常 实验的亚克隆，但还达不到用于文库构建的转化效率要求，所以做文库构建或遗传筛选时入 可用电击转化，其转化效率比氯化许化学法高出1到2个数量级；在PCR鉴定重组子时， 得到的片段大小在600bp左右，与预期的目的片段485bp+空载体扩增片段ll

8、lbp总长600bp 左右片段，marker的染色有点浅，可能是加样量过少，造成染色不深，或者是制备凝胶厚 度过厚；从上图中可以初步确定本小组的四个样品都插入了目的片段，为了进一步确定目的 片段已经出入载体，后面可以送测序或酶切鉴定，进一步证实PCR鉴定结果。 m质粒酶切鉴定一、实验目的1、学习和了解酶切鉴定重组克隆的原理2、掌握酶切鉴定重组子的操作方法二、实验原理对于初步PCR筛选得到的样品菌落，扩大培养扩增质粒，提纯重组质粒，用相应的限 制性内切核酸酶切割重组子，再通过凝胶电泳，鉴定目的片段插入载体与否。三、实验步骤（一）质粒提取1、将PCR筛选出来的菌液接种于LB-Amp培养基上，37摇

9、床过夜培养；2、取5ml菌液，离心收集细菌；3、力口入2503 Solution I /RNaseA混合液，漩涡振荡使细胞完全悬浮；4、加入 250ul Solution 11,轻轻颠倒；5、加入 350ul Solution；6、室温离心 12000r/min, lOmin；7、取一干净的HiBind微型柱（I ）装在一个2ml收集管上，转移上清到柱子内；8、离心使上清液流过柱子，弃去收集管滤液；9、加入5003缓冲液HB到柱子中,10000r/min离心lmin；10、弃去收集管滤液，力口入7003DNA Wash Buffer至柱子；11、室温下 10000r/min 离心 lmin；1

10、2、室温下10000r/min离心2min空转，以出去乙醇；13、把柱子置于一干净的1.5ml离心管上，加入20ul无菌去离子水到柱子基质上，室温下静置2min, 10000r/min离心2min以洗脱出DNA。（二）质粒酶切酶切反响体系：10ul每管/组（ul）实配（ul）10 X Buffer160限制性内切核酸酶（单酶切、双酶切）160DNA3-5超纯水补至10ul总体积101201、混匀反响体系，37水浴3h,使酶切反响完全；2、置于65水浴中lOmin,对限制性内切酶进行灭活3、琼脂糖凝胶电泳检测酶切反响的结果。四、实验结果酶切反响后凝胶电泳结果如图二，其中M为DNAMarker,

11、1、5号泳道为原质粒加样， 2号泳道为样品一单酶切加样，3号为样品一的双醵切加样，4号为样品二的双酶切加样，6 号泳道为样品五单酶切加样，7号为样品五双酶切加样，8号为样品六双酶切加样。1500bplOOObp500bp1500bplOOObp500bpM 1234M 5678M： DNA marker； 1,5：原质粒；2,6：单酸切；3, 4, 7, 8：双酶切 图二酶切反响凝胶电泳图五、讨论与分析从上图可以看出，本小组酶切鉴定得到的结果为4号泳道样品二的双酶切得到了与预期 片段大小一致的条带，即酶切反响将插入载体的目的片段切割下来，证明样品二中目的基因 插入了载体之中，与之前的PCR初步

12、筛选出来得到的结果一致，如果有需要可以进一步进 行胶回收，送去测序以更精确确定插入片段正确与否；再看其他泳道的条带位置，1号和5 号泳道条带的位置最靠下，因为原质粒一般是超螺旋结构构型，在凝胶中受到的空间阻力最 小，所以跑得最快，位置最靠前；2号和6号为单酶切，质粒构型可能为线性，也有可能是 开环结构，这主要取决于所用酶的活性；而3、7、8号泳道的样品双酶切没有得到预期的目的片段大小的条带，分析可能是目的 片段没有插入到载体之中，虽然之前的PCR筛选出来那三个样品中菌落载体可能含有目的 片段，但是PCR用的是载体通用引物M13,对目的片段的特异性可能不是很强，所以PCR 扩增出来的片段很有可能

13、不是目的片段，而是在其他位置扩增出来的，同时，恰巧扩增出来 的片段大小和目的基因大小相似，所以，假阳性结果误使我们做出错误判断，这也说明了一 点，在PCR鉴定重组子中，要进一步对重组子进行测序或酶切鉴定以进一步确定正确结果。关于3、7、8号泳道三个样品没有得到预期目的片段大小条带，还有另外一个猜想，鉴 于前面PCR的结果，四个样品都有插入目的片段，至于酶切鉴定没有得到证明，可能是3、 7、8号样品酶切中两种酶的活性不同所致，其中一种酶可以将质粒切割开，而另一种酶在 另外一个酶切位点的位置没有完全酶切，而是切了双链中其中一条链，造成类似开环结构的 一种构型，其质粒分子量大小介于完全单酶切和完全双酶切之间，同时，可能因为类似开环 构型的影响，所以，其在凝胶中跑动受到阻力影响，其位置和完全单酶切得到质粒位置一致, 正如图二中的7、8号泳道情况，而3号泳道可能就是开环构型对其影响很小，其受到阻力 基本上相对于线性，而其分子量介于两者之间，所以，其条带位置也就位于2、4泳道两者 之间。所以，为了进一步确定结果，我们可以送样品去测序公司进行测序鉴定分析。