集成孔内纳米电极的纳米孔的制备_王磊.docx

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1、硕 士 学 位 论文 集成孔内纳米电极的纳米孔的制备 专业名称： 生物医学工程 作者姓名： 王磊 指导教师： 刘全俊 东南大学硕士学位论文 Fabrication of nanopore and nanopore integrated with nanoelectrodes A Thesis Submitted to SoutheastUniversity For the Academic Degree of Master of Engineering BY WANG Lei Supervised by Prof. LIU Quan-jun School of Biological Scien

2、ce & Medical Engineering SoutheastUniversity May 2015 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研宄成果。尽我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果， 也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 东南大学、中国科学技术信息研宄所、国家图书馆有杈保留本人所送交学位论文的复印件和电 子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子

3、文档的内容和纸质论文的内容相 一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布（包括以电子信息形式刊登 ） 论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布（包括以电子信息形式刊登 ） 授权东南大 学研宄生院办理。 研 生 签 名 ： W 导 师 签 名 :_ 外 日期 : x 乂 ， 研宂生签名 : 日期： C7 / . r, V . 东南大学学位论文使用授权声明 题目：集成孔内纳米电极纳米孔的制备 研宄生姓名：王磊 导师姓名：刘全俊 学校：东南大学 纳米孔技术作为新一代单分子检测技术己经成为研究的热点。目前，制备固态纳米 孔的材料和方法很多，其中主要以氮化硅材料和离子束轰击

4、方法为主，以此种材料和方 法制备出的固态纳米孔被广泛应用于 DNA、 RNA、 蛋白质和纳米颗粒等易位事件的研 宄，这就使得对直径大小可控的固态纳米孔的需求不断增加。 本课题主要研究了固态纳米孔及集成孔内纳米电极纳米孔的制备与加工，并对制备 的纳米孔直径进行统计分析，随后对制备的纳米孔进行了表征，并将其应用于易位事件 的研究中。主要内容主要包括以下几个方面： 1. 利用 MEMS微加工工艺和聚焦离子束 （ Strata FIB 201)微细加工平台制备单个固 态纳米孔。首先利用标准的硅加工工艺制备形成 5 timX5 nm正方形大小的 Si3N4自支 撑膜。随后，利用聚焦离子束加工平台发出的高

5、能 Ga+离子将氮化硅悬空膜击穿，制备 纳米孔。综合 spot和 circle两种模式，可以根据需求制备出直径 60 nm以上的圆形纳米 孔，对制备出的纳米孔孔径进行统计分析，发现具有较好的重复性、稳定性和一致性， 并将制备的固态纳米孔应用于易位信号的检测。 2. 利用双束型聚焦离子束 (DB-FIB)加工系统和氦离 子显微镜 (HIM)平台在 100 nm和 30 nm两种膜厚的氮化硅悬空膜上对纳米孔的制备进行优化，双束型聚焦离子束加工系 统可以实现直径 10 60 nm之间纳米孔的制备，氦离子显微镜可以实现了直径 2 60 nm 之间纳米孔的制备，弥补了单束型聚焦离子束制备纳米孔的不足，完

6、善了纳米孔孔径的 范围，可以满足各类分子易位实验的研究，并为纳米电极的制备和加工提供了坚实的基 础、经验和前提。 3. 利用 MEMS微加工工艺和双束型聚焦离子束加工系统及氦离子显微镜平台制备 出集成孔内纳米孔电极的纳米孔。在具有表面金线的氮化硅悬 空膜上，利用双束型聚焦 离子束和氦离子显微镜对 50 nm厚、 5 pm线宽的金线进行刻蚀。通过两次初步刻蚀和 一次精细刻蚀后最终形成长约 50 nm、 宽约 10 nm的纳米金线。再以 PECVD蒸镀一层 100 nm厚的氮化硅作为绝缘层，将纳米金线覆盖，形成了 “ 氮化硅 -金 -氮化桂 ” 的三层结 构。最后，利用用氦离子显微镜平台将三层结构

7、击穿，形成直径 l nm左右的集成孔内 纳米电极的纳米孔。 利用微纳加工工艺和平台进行了纳米孔的制备和优化，并在此基础上制备了集成孔 内纳米电极的纳米孔，以期望在未来实现横向隧穿电流的检测 。 【关键词】：固态纳米孔，氮化硅薄膜，纳米电极，微纳加工 ABSTRACT ABSTRACT Title: Fabrication of nanopore and nanopore integrated with nanoelectrodes Author: WANG Lei Thesis Supervisor: LIU Quan-jun School: Southeast University Nano

8、pore has become a hotspot, which was a new generation of single molecule detection technology. Nowadays, many materialsand methods have been used in the fabrication of solid-state nanopore, particularly, silicon nitride has been mostly used for fabrication of nanopore by the focus ion beam. This kin

9、d of solid-state nanopore has been widely used for single molecular sensing of different kinds of molecular, such as DNA, RNA, protein and nanoparticles. So the demand of different diameters of nanopore is increasing constantly. In this thesis, the fabrication of solid-state nanopore and the nanopor

10、e integrated with nanoelectrodes has been suited, and the distribution of diameters were analyzed. The characteristic of nanopores and the translocation events of nanopore have been discussed systematically. The main content of this thesis is composed of the following parts: 1. The micro-fabrication

11、 techniques of MEMS and nano-fabrication of Focus Ion Beam (FIB) were used for fabrication the flim of solid-state nanopores and nanopore arrays. At first, The free_stand Si3N4 film with square of 50 X 50 jim was fabricated repeatedly. Secondly， The FIB (Strata FIB 201) of Ga+ was used to drill the

12、nanopores on silicon nitride film. In the modes of spot and circle, solid-state nanopores can be fabricated stably. And the solid-state nanopores were used for nanopore detection experiments. 2. The Dual-beam Focused Ion Beam(DB-FIB) and Helium Ion Microscope (HIM) were used to drill nanopores with

13、smaller diameters on the free-stand silicon nitride. The free-stand silicon nitride has two kinds of thickness, including 100 nanometers and 30 nanometers. DB-FIB can be used to dill nanopores with diameters from 10 nanometers to 60 nanometers. HIM can be used to drill nanopores with diameters from

14、2 nanometers and 60 nanometers. This make up the lack of diameters which were fabricated of FIB. And it expands the scope of the diameters. The widely range of diameters can meet the various requirements for nanopore detection experiments.And it established a solid foundation of the fabrication of n

15、anoelectrodes. 3. The micro-fabrication techniques and nanofabrication were used to fabricate the nanopore integrated with nanoelectrodes. Firstly, The gold nanoelectrodes with thickness of 50 nm and width of 5 xm on the free-stand silicon nitride film was fabricated by MEMS. Secondly,DB-FIB was use

16、d to do the preliminary etching. And HIMwas use to fine the width of the nanoelectrodes. By the two step of etching, nanoelectrodes with width of 10 nm was conformed. Then, 100 nm thickness of silicon nitride as an insulating layer was deposition by PECVD. Thisform the structure of sandwich, silicon

17、 nitride - gold - silicon nitride1. Finally, HIM was used to drill a nanopore integrated with nanoelectrodes， whose diameter is about 10 nm. Nanopore and nanopore integrated with nanoelectrodes was fabricated by the micro-fabrication techniques and nano-fabrication. Onthis basis, tunneling current c

18、an be detection in the future. Keywords: solid-state nanopore; silicon nitride film; nanoelectrodes; Micro/Nano fabricati HI 目录 mm. i ABSTRACT . Ill 胃一章绪论 . 1 1.1 I H . 1 1.2纳米孔检测技术的产生与发展 . 2 1.2.1生物纳米孔 . 2 1.2.2固态纳米孔 . 4 1.2.3复合纳米孔 . 8 1.2.4集成横向纳米电极的纳米孔 . 9 1.3本章小结 . 12 1.4本课题的研宄内容和技术路线 . 13 1.4.1研

19、究目标 . 13 1.4.2研宄内容 . 13 1.4.3技术路线 . 13 第二章固态纳米孔的制备与应用 . 14 2.1 弓 IW . 14 2.2聚焦离子束的原理与作用 . 14 2.3聚焦离子束制备固态纳米孔 . 15 2.3.1材料及仪器 . 15 2.3.2纳米孔的加工 . 17 2.4实验结果 . 17 2.4.1 spot模式下制备纳米孔 . 18 2.4.2 circle模式下制备纳米孔 . 19 2.4.3纳米孔在易位事件检测中的应用 . 20 2.5分析及讨论 . 23 2.6辟触 . 24 第三章固态纳米孔制备的优化 . 25 3.1 弓 I 目 . 25 3.2双束型

20、聚焦离子束 (DB-FIB)制备固态纳米孔 . 25 3.2.1双束型聚焦离子束的工作原理 . 25 3.2.2双束型聚焦离子束优化纳米孔的制备 . 26 3.3氦离子显微镜 (HIM)制备固态纳米孔 . 29 3.2.1氦离子显微镜 (HIM)的工作原理 . 29 3.2.2氦离子显微镜 (HIM)优化纳米孔的制备 . 29 3.4分析及讨论 . 33 3.5本章小结 . 34 第四章集成孔内纳米电极纳米孔的制备 . 35 4.1弓丨胃 . 35 4.2纳米电极的制备 . 35 4.2.1实验材料与仪器 . 35 4.2.2纳米电极的制备流程 . 37 4.2.3纳米电极的绝缘层处理 . 3

21、9 4.3集成孔内纳米电极的纳米孔的制备 . 39 4.3.1集成孔内纳米电极纳米孔的制备 . 40 4.3.2集成孔内纳米电极纳米孔的表征 . 40 4.4分析与讨论 . 42 4.5本章小结 . 42 第五章总结与展望 . 43 5.1工作总结 . 43 5.2前景展望 . 44 SCii . 46 参考文献 . 47 硕士阶段发表文章 . 52 第一聿绪论 U引言 地球上各种生物都具有被称为 “ 基因 ” 的遗传物潢，这种遗传物质是由 DNA片段组 成，因此， DNA被称作遗传密码，指引生物体的发育与生命机能的运转，传递着生物 的遗传信息 遗传密码 DNA的破解能够相助让人类对自身的认识

22、，包括基因在痛症和 各类遗传病的认识，这对人类是极具意义的一项研宄 20世纪 70年代，第一代测序技 术即 Sanger测序法即焦磷酸测序法诞生，并且被用于对人类全基因组的检测，但是 存在测序成本高、效率低等缺点 .随后，第二代高通邐 :测序应运而生，以 454测序 、 SOLID 测序和 Sotexa等为代表的二代测序技术，提高了测序的速度和通童，但是读长较短，且 测序成本较髙，难以普及应用为 了实现 “ 千元基因组测序 ” ，以纳米孔单分子传感技术 为代表的第三代测序技术 2备受瞩目 纳米孔技术作为新一代单分子检测技术己经成为众多科学研究人员的研宄热点，纳 米孔技术的基本原理源于经典的库尔

23、特计数器，这种技术产生了纳米孔技术的基本设想。 库尔特计数提供了一种对微小体积颗粒进行测童的方法，其主要原理是指两个充满 电解质溶液 的腔体 ，由一个微小的孔道连通，受电压驱动，存在电解质溶液中的纳米分 子或纳米颗粒穿过小孔时，取代相同体积的电解液，产生阻塞效应，使得两极间的电阻 发生瞬时变化，产生电位脉冲信号，脉冲倌 号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比， 从而达到识别小体积颗粒的目的， 纳米孔技术正是利用这一原理，来实现单分子检测，将库尔特计数器 p运用到纳米 尺度上。如图所示，纳米孔是在薄膜上制备或者组装成的纳米级孔洞，这个孔洞将 充满电解质溶液两个腔室连通，然后利用 *没在两个腔室中

24、的电极和外加的恒定电压形 成一个恒定电压的持续电阻 .当在纳米孔两侧施加一个恒定电压时，电解质溶液中的阴 阳离子发生定向的移动，从而产生一定大小的离子通道电流，即为开孔电流 Io;当腔室 中存在纳米级分子或顆粒时，在外加电压的驱动下，分子或 颗粒发生穿过纳米孔时，产 生阻塞效应即体积排阻效应，电流发生瞬时变化，形成阻塞电流根据阻塞电流的大 小 (AI)和阻塞电流的持续时间 (td)可以推测出过孔分子或颗粒的大小、形状和表面 特性 图 1.1纳米孔技术的基本原理 w 第一章绪论 目前纳米孔主要分为三大类：生物纳米孔、固态纳米孔和复合纳米孔 (生物 -固态纳 米孔 )。这三类纳米孔都已经成为相关研

25、宄人员的研宄热点 ,生物纳米孔主要包括 ot-HL、 MspA、phi29连接器，这些生物纳米孔主要来源于生物膜上的离子通道以用于控制离子 与分子进出细胞；固态纳米孔主要是指利用微加工平台在 Si3N4、 Si02、 A1203、 Ti02、 石墨烯或其他聚合物薄膜上制备形成的纳米孔；而复合纳米孔主要是将生物纳米孔与固 态纳米孔相 结合的纳米孔，这种纳米孔具备了生物纳米孔和固态纳米孔的优势。但是仅 仅检测纵向电流难以区分 DNA的四种碱基。许多科研人员通过理论计算得出， A、 T、 C、 G四种碱基的横向隧穿电流是由差异的，这就使得很多研宄人员致力于横向电流的 检测，因此，集成横向纳米电极纳米

26、孔的制备成为科研人员共同关注的热点，研究人员 利用各种微加工加工平台制备出纳米电极应用于 DNA分子的检测，以期望达到区分 DNA四种碱基的目的。 1.2纳米孔检测技术的产生与发展 1.2.1生物纳米孔 近年来，随着细胞生物学的发展，科学家们发现细胞上存在着控制分子和离子进出 细胞的离子通道蛋白，这些通道蛋白在细胞的生命活动中发挥着极其重要作用。而这些 通道蛋白具有的纳米级孔道，形成了天然的纳米孔，使其成为纳米孔研宄的热点。生物 纳米孔主要以脂双层、脂质体或者聚合物膜为基底形成两个腔室，从而构成电化学腔。 利用标准的生物分子技术可以大量生产和纯化不同的通道蛋白，这极大提高了生物纳米 孔制备的效

27、率和重复性。因此，很多科研人员希望通过生物纳米孔的研究，实现快速和 低成本的测序目标。以下主要介绍三类生物纳米孔： a-溶血素、 phi29连接器和 MspA。 1.2.1.1 a-溶血素 a-溶血素是一种外毒素，由金黄色葡萄球菌分泌。其结构为四聚体，呈蘑菇状，从 上到下分为前庭区、连接区和 3桶三个部分，其中最窄的区域为连接区，其直径约为 1.4mn,如图 1.2a所示 5。 a-溶血素固有的纳米孔构造，使得其成为单分子传感的优良 选择，可以用于不同分子的检测，例如金属离子 &7、有机小分子卜 1()、 DNAiN191、 RNA17 2!W2和蛋白质 23 25等等。 2009年 Haga

28、n Bayley小组利用核酸外切酶结合到 a-溶血素上，实现边剪切边测序， 如图1.2b所示。利用这一方法进行碱基读取的正确率为 99%M，如图 1.2c和 d所示。 这是纳米孔检测技术中一个极其重要的发展，向实现千元测序的目标迈进了一大步。 2 第一聿嬸论 图 12三氧化二铝 CAI203 利用原子层沉积制备的 A1203薄膜可以用于多种孔径纳米孔的制备，与 SiN薄膜不 同， A1203薄膜表面带有正电，并且表现出优良的机械特性、较低噪声和较长的使用寿 命 5(W因此，可控的薄膜厚度和直径使得成为 AI2O3薄膜成为纳米孔传感器具有优良 选择之 一 * (3) 高介电常数材料 利用原子层沉

29、积制备的 TiOj和 Hfi 2(氧化铪 )也可用于纳米孔的制备 P3,这些高介 电常数的材料不仅具有优良的电学和机械特性，而且沉积温度可低至 150玖 Dekker等 EM1人利用原子层沉积将取 02沉积到石墨烯纳米孔上，发现有效地降低了石墨烯纳米孔 的嗓声水平，并且提高了机械特性 . (4) 石墨烯 石墨烯是一种二维碳材料，具有优良的机械、电学和热力学等特性，而且单层石墨 烯的厚度小于 DMA碱基之间的距离大大提高了检瀟的空间分辨率 S51,使石墨烯纳米孔 有可能实现 DNA测序。目前，许多研宄人员利用石墨烯薄膜制备了直径 2-25 nm的纳 5 着显著的优势，而且利用半导体加工技术可以实

30、现大规模的加工，而且实现了纳米孔孔 径的可控与可调。与生物纳米孔相比，固态纳米孔具有很多优势，包括机械应力小、可 重复使用、孔径大小可调、稳定性好等等 1.2.2.1固态纳米孔的制备材料 目前，随着半导体微加工工艺的发展，许多材料都被用来制备固态纳米孔，例如氮 化硅（ SbN4、 三氧化二钼 （ A1203)、 二氧化钛 （ Ti 2)、 石墨烯或其他聚合物薄膜等 (1) 氮化硅 （ Si3N4) 氰化桂 （ Si3N4)较低的机械应力和较髙的化学耐受力，使其成为制备纳米孔薄膜的 优良材料 Si3N4薄膜主要是利用微加工工艺中的低压化学气相沉积技术在 8001C的高温 下制备形成，随后利用光刻

31、和标准的湿法刻蚀技术在硅片一側形形成 100 P m X 1 11 m 的腐蚀窗。最后，利用离子束或者电子束在 SiaN4薄胰中央轰击形成纳米孔 纳米孔的 直径可以根据实验的霈求进行精确调控 t45.wle目前， Si3N4纳米孔主要被用于 DNA14.464*、 RNAM等易位事件的检测，如图 1.5所示 第一章结论 米孔，用于 dsDNA易位事件的检测 t54* 561， 如图 1.6所示 S7， 除了用石墨烯纳米孔检测 纵向阻塞电流之外，由于石墨烯优越的导电性能和独特的电子结构，未来有可希望通过 石墨烯纳米孔研制出检测横向电流的装置来提高单分子检测的水平，这势必是一个极具 影响力的发展。

32、 图 1.6石蜃烯纳米孔检测双链 DNA易位事件 |5T1.左田为双链 DNA易位 亊件示意图，右图电流执迹图和石墨烯纳米孔的透射电嫌图 上述四种材料是制备固态纳米孔的主要材料，其中 A1203和 TlOi以其优良的绝缘性 和介电性质，成为制备固态纳米孔中绝缘层的优良选择，能够降低固态纳米孔的嗓声 , 伹是由于这两种材料不适合于对纳米孔进行修饰，因此不作为纳米孔材料的首选；石墨 烯以其独特的电子结构和导电特性，使得其成为检测 DNA易位事件的优良选择，但是 由于其优良的导电性带来的噪声影响对易位事件的检测产生较大影轧虽然现在很多研 宄人员利用 Ti 2等材料作为石墨烯纳米孔的绝缘层，有效地降低

33、了噪声水平，相对于 Si3N4纳米孔制备过程复杂 ： 因此，相较于 Al203、 Ti 2和石昌烯而言， Si3N4成为制备 纳米孔材料的首选 -Si3N4具有优良的电学、化学和热学性质，有利于纳米孔的制备和 后期的修饰 . 1_X2.2固态纳米孔的制备方法 利用各种材料制备薄腆后，霱要在该薄膜上轰击或刻蚀出纳米级的孔隙，以形成纳 米孔。目前，纳米孔加工的方法主要包括：离子束刻蚀、电子束刻蚀和化学刻蚀等。 (1) 离子束刻蚀 随着微纳加工与表征技术的发展，使樗固态纳米孔的制备更加的高效 Biance58和 Chih Jm U1593等人利用聚焦离子束分别在 SiC和 Si3N4上进行小于 10

34、 nra的纳米孔的制 备，而且他们还发现，可以利用离子束不停扫描纳米孔薄膜的表面，达到缩孔的效果 如图 1.7w所示，因此，聚焦离子束固态纳米孔制备方面己经成功应用，并实现了纳米 孔直径的精确可控 G 第一辈绪论 图 1.7聚焦离子束制备固态纳米孔 5 a)聚焦离子束轰击 02 8制备的 106XSSrnn的不规则纳 米孔 s b)利用聚焦离子束对 a图中的纳米孔进行缩孔； （ 利用聚焦离子束继续缩孔，最终将纳米孔 封闭 (2电子束刻蚀 除离子束之外，电子束也可以达到制备固态纳米孔和缩孔的要求和效果 相比于离子束 刻蚀，电子束的精确度更商，且所口号速率更高。而且，利用透射电子显微镜 （ TEM

35、) 可以实时的监测到纳米孔孔径的变化 .是得纳米孔的制备更加的精确和可控 。 Dekkcr 等人 451利用透射电子显微镜在二氧化硅的薄膜上之额比穿孔径小于 5 nm的纳米孔，如 图 1.8l4S1所示 f利用热氧化作用形成的 20X20nm2的纳米孔，在透射电子显微镜下使用 电子束进行缩孔的过程，最终使得纳米孔的直径达到 3 am。 图 1.8透射电子显微镜制备 SiOj纳米孔 4SI, a)自支撑薄膜 SiQj薄膜结构示意图； b) SEM下 20X20 nm2纳米孔图像 5 c)纳米孔在 TBM下的侧视示意图；利用电子束将纳米孔缩小到 3 am过程中 的 TEM图像 (3)湿法化学刻蚀

36、除了上述的离子束和电子束的方法可用于固态纳米孔的制备以外，还有研宄人员利 用湿法化学刻蚀的方法进行纳米孔的制备，这种各向异性刻蚀的方法相较于离子束和电 子束刻蚀更加的容易 Sang Ryul Park等人 601利用湿法化学腐蚀的方法，随后利用热氧 化的方法在Si3N4薄膜上制备出直径约 10 nm的纳米孔，如图 I.#01所示， 第一荦绪论 图 1.9电化学刻蚀反馈控制装置制备纳米孔 a)电化学刻蚀反饿控制装置示意图； b)湿法 刻蚀制备纳米孔的过程示意图 除了上述三种主要的固态纳米孔制备方法以外，还有许多研究人员利用激光灼烧 6U 和离子径迹刻蚀 63等方法制备不同孔 径的纳米孔。 但是目

37、前制备固态纳米孔的主流方 法是离子束刻蚀和电子束刻蚀二 随着固态纳米孔制备技术的不断优化，使得纳米孔技术的应用越来越广泛，不仅加 深了对 dsDNA或 ssDNA易位事件的研宄，而且还将固态纳米孔应用于其他生物分子的 检测，例如：纳米金颗粒、 RNA49、 甲基化 DNA4653和蛋白质复合物 |661等 6 m蝴米孔 复合纳米孔这个概念首次被使用，是 Dekker等人 67将 a-溶血素与 Si3N4纳米孔相 结合，a-溶血素具有精确的结构和特异性修饰和化学修饰的位点，但是支撑 a-溶血素纳 米孔的脂双分子层的不稳定性，限制了在实验装置上的组装。因此，将 a-溶血素与固态 纳米孔相结合形成复

38、合纳米孔，将生物纳米孔和固态纳米孔的势叠加在一起，如图 1.10(a-Cf71所示，将 a-溶血素与 Si3N4固态纳米孔相结合，发现复 #纳米孔稳定性更高 f 但是难以区分单个戚基，并且漏电流现象明显，这些负面影响制约了这类复合纳米孔的 发展。随后 又一出现了一种新型的方法，将 DNA自折叠形成的纳米孔组装到 Si3N4固 态纳米孔上，如图 1.10(d和 ef81所示，该复合纳米孔的直径和形状可以改变以用于不同 分子的传感和检测，目前 ， Silvia Hemaidez-Ainsa等人利用 DNA自折叠的纳米孔与 固态纳米孔结合形成的复合纳米孔检测 DNA易位事件。 8 第一聿绪论 图 L10复合纳米孔检涮 DNA易位事件阶 * 3。 a) dsDNA与 a-洛血素结合形成的复合物； b) et- 溶血素组装到 Si3N4纳米孔过程示意图和对应的电流轨迹图； :复合纳米孔电