微生物检验实验室分枝杆菌属检验标准操作规程.doc

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1、微生物检验实验室分枝杆菌属检验标准操作规程1. 概述分枝杆菌属是一类细长的、具有分枝生长趋势的需氧杆菌，因具有耐受或抵抗酸和乙醇脱色的特点，又称为耐酸或抗酸菌。分枝杆菌属至今已发现80多个种，除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌外，其他分枝杆菌，如堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等，统称为非结核分枝杆菌。2. 标本类型痰液、体液（包括脑脊液、腹水、胸水）组织，粪便等标本。3. 鉴定3.1 形态与染色：菌体细长，或稍弯曲，两端钝圆，大小为（0.20.5um）（15um）。革兰染色不易着色，抗酸染色呈红色。以痰液直接涂片，结核分枝杆菌多为单个存在，有时呈V、Y、人字形排列，痰菌量多时可排列为束状或集聚成团。荧

2、光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下观察呈金黄色荧光。3.2 培养特性：结核分枝杆菌生长缓慢，繁殖一代约需18h，因此在罗氏固体培养基上需要培养26星期方可见到菌落。菌落多为粗糙型，不透明，乳白为米黄色，呈干燥颗粒状，形似菜花。液体培养基中结核分枝杆菌生长较快，可形成表面菌膜或沉于管底。3.3 生化反应：不发酵糖类，耐热触酶、耐热磷酸酶和吐温80水解试验均阴性，尿素酶、中性红、结核分枝杆菌烟酸、烟酰胺酶和硝酸盐还原试验均阳性。3.4鉴别要点：3.4.1 本菌特征：菌体细长，抗酸染色呈红色；生长缓慢，菌落乳白或米黄色，呈干燥颗粒状，形似菜花状；不发酵糖类，尿素酶、中性红试验阳性。3.4.2 与牛

3、分枝杆菌的鉴别：结核分枝杆菌菌体细长，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阳性；牛分枝杆菌菌体较短、较粗，烟酸、烟酰胺酶、硝酸盐还原试验均为阴性。3.5 操作步骤3.5.1 中性培养基3.5.1.1 标本的处理痰液：挑取约5ml痰液至已标记的50ml离心试管中，加等量的2%N-乙酰半胱胺-氢氧化钠前处理液（去污染）；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.体液（包括脑脊液、腹水、胸水）：无菌体液直接接种；标本量10ml,离心3000r/min

4、，15分钟，取沉淀物接种；污染标本，须同痰液处理方法后再接种。组织：加1gNALC至组织上溶解组织；加5ml7H9肉汤，以剪刀或研磨器将组织均匀研碎；取约5ml研磨液至标记的50ml离心试管中，加等量的2%N-乙酰半胱胺-氢氧化钠前处理液；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.粪便：挑取约1g粪便至已标记的50ml离心试管中，；加5ml7H9肉汤，混匀；等量的2%N-乙酰半胱胺-氢氧化钠前处理液（去污染）；漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿

5、超过20分钟；加无菌PBS（pH6.8）至约50ml,盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS(pH6.8)以中和pH至6.8.3.5.1.2 固体培养基接种 无菌毛细管吸取消化液后标本0.1ml,滴于中性罗-琼培养基，将接种过的斜面来回晃动，使菌液均匀铺于斜面上，斜面朝上放37 恒温箱内培养。每一标本同时接种2支。3.5.1.3 液体培养基接种 标本接种前，在BBL MGIT便培养管中先加入0.5ml营养添加剂（OADC）和0.1ml杂菌抑菌剂（PANTA）。接种0.5ml标本至BBL MGIT培养管中。若一次处理标本较多，可用营养添加剂（OADC）直接溶

6、解杂菌抑菌剂（PANTA），在BBL MGIT培养管中0.8ml混合添加剂；然后接种0.5ml标本至BBL MGIT培养管中。3.5.2 酸性培养基培养 在约5ml痰液中加入等量的4%nNaOH溶液，漩涡振荡20秒；静置15分钟，勿超过20分钟。无菌吸取消化后标本0.1ml滴于酸性罗-琼培养基，将接种过的斜面来回晃动，使菌液均匀铺于斜面上，斜面朝上放37 恒温箱内培养。每一标本同时接种2支。3.6 结果观察3.6.1 固体培养基 接种后3日、7日观察，此后，每周观察一次。阳性结果涂片证实随时报告。若7日内报阳，则为快速生长菌，超过7日则为缓慢生长菌。阴性结果至8周后报告，必要时可延长。3.6.

7、2 液体培养基 系统每天自动记录信号的变化而测知有无分枝杆菌生长，阳性结果经涂片证实后报告。4. 检验结果解释与分析4.1 固体培养基报告方式菌落生长不足斜面1/4 分枝杆菌培养阳性（N个细菌）。菌落生长占整个斜面1/4 分枝杆菌培养阳性（1+）。菌落生长占整个斜面1/2 分枝杆菌培养阳性（2+）。菌落生长占整个斜面3/4 分枝杆菌培养阳性（3+）。菌落生长铺满整个斜面 分枝杆菌培养阳性（4+）。培养8周仍无菌落生长 分枝杆菌培养阴性4.2液体培养基报告方式42日内系统显示养阳性，涂片染色抗酸杆菌阳性 分枝杆菌液体培养阳性。42日内系统显示养阳性，涂片染色为非抗酸杆菌阳性 标本污染，请重送。4

8、2日内系统显示养阴性，涂片染色为无细菌生长 分枝杆菌液体培养阴性。5.药敏6. 质量控制以结核分枝杆菌H37RV为阳性质控，大肠杆菌ATCC25922为阴性质控，每次检测均进行质量控制。7. 临床意义结核分枝杆菌为结核病的病原体，不产生内、外毒素，其毒性物质为索状因子硫脂。人类对其有较高的易感性，最易受损的器官是肺，绝大多数由呼吸道入侵导致感染和发病，很少经消化道和接触感染。人类初次感染以后有较高的免疫力，可阻止入侵的细菌经淋巴-血流播散，但不能预防再感染。8.安全防护8.1 所有操作均在生物安全柜中进行。8.2 检验人员操作时要穿隔离衣，戴口罩和手套。8.3 痰盒、试管、离心后上清液、剩余或

9、废弃物标本等污染物装入生物危险袋中，先浸泡消毒，再放入防漏容器中经高压灭菌30分钟后，才能丢弃或清洗 。8.4 实验结束后以75%酒精喷洒安全柜台面；必要时对地面和墙面进行消毒，每周至少一次；清洗完毕，安全柜至少工作15分钟后关机。 打开安全柜及实验室紫外灯消毒2小时。 培养阳性标本的保存参见菌种保存程序。参考文献1ISO15189；2003医学实验室-质量和能力认可准则2严碧涯,端沐宏瑾主编.结核病变.北京:北京出版社,20033闫国蕊，苏保亮主编.结核病学实验技术.郑州：郑州大学20014中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程.北京:中国教育文化出版社,20065王金良主编.分枝杆菌病诊断规范.上海:上海科学技术出版社,2006编写人： AAA、BBB 操作人：本室操作人员 批准人：