植物器官和组织培养ppt课件.ppt

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1、植物器官和组织培养植物器官和组织培养 第一节第一节 植物器官和组织培养的基本程序植物器官和组织培养的基本程序 第二节第二节 植物营养器官培养植物营养器官培养 第三节第三节 植物繁殖器官培养植物繁殖器官培养 第四节第四节 植物组织培养植物组织培养 第五节第五节 常见污染问题和解决方案常见污染问题和解决方案 植物器官培养植物器官培养（Organ culture ） ：对植物某一器官（营养器官和繁殖器官）的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。如根、茎、叶、花、果实、种子等。 植物组织培养植物组织培养（Tissue culture） ：对植物组织（分生组织、形成层组织、表皮组织、薄壁组织等）及培养

2、产生的愈伤组织进行离体培养的技术。第一节第一节 植物器官和组织培养的基本程序植物器官和组织培养的基本程序一、无菌外植体的获得一、无菌外植体的获得二、初代培养物的建立二、初代培养物的建立三、形态发生和植株再生三、形态发生和植株再生四、培养物的观察记载四、培养物的观察记载一、无菌外植体的获得一、无菌外植体的获得 从自然界或室内采集的植物器官和组织从自然界或室内采集的植物器官和组织携带有各种微生物，容易造成培养基和培养携带有各种微生物，容易造成培养基和培养材料的污染，污染是组织培养的一大障碍。材料的污染，污染是组织培养的一大障碍。 处理外植体的重要工作是灭菌。不同植处理外植体的重要工作是灭菌。不同植

3、物或同一植物不同器官、不同组织，灭菌的物或同一植物不同器官、不同组织，灭菌的方法不同。方法不同。1、茎尖、茎段、叶片的灭菌、茎尖、茎段、叶片的灭菌茎尖、茎段、叶片茎尖、茎段、叶片清水清洗、吸干清水清洗、吸干0.1%-0.2%氯化氯化汞浸泡汞浸泡2-10min70%酒精酒精浸泡浸泡10-30s10%次氯酸钙次氯酸钙浸泡浸泡10-20min70%酒精浸泡酒精浸泡10-30s2%次氯酸钠次氯酸钠浸泡浸泡15-30min无菌水冲洗无菌水冲洗3-5次次分割后接种分割后接种2、根、块茎、鳞茎的灭菌、根、块茎、鳞茎的灭菌特点：生长在土特点：生长在土中，挖取时易受中，挖取时易受伤，灭菌较困难伤，灭菌较困难清水

4、清洗、清水清洗、切除损伤部位切除损伤部位70%酒精浸泡酒精浸泡10-30s6-10%次氯酸钠次氯酸钠浸泡浸泡5-15min无菌水冲洗无菌水冲洗3-5次次分割后接种分割后接种根、块茎、鳞茎根、块茎、鳞茎0.1%-0.2%氯化氯化汞浸泡汞浸泡5-12min3、花蕾的灭菌、花蕾的灭菌特点：未开放花蕾特点：未开放花蕾中的花药被花被包中的花药被花被包裹，处于无菌状态。裹，处于无菌状态。可直接灭菌。可直接灭菌。70%酒精酒精浸泡浸泡10-30s无菌水冲洗无菌水冲洗3-5次次接种接种花蕾花蕾0.1%氯化汞氯化汞浸泡浸泡3-10min1%次氯酸钠次氯酸钠浸泡浸泡10-20min4、果实、种子的灭菌、果实、种子

5、的灭菌无菌水冲洗无菌水冲洗3-5次次接种接种种子种子0.1-0.2%氯化汞氯化汞浸泡浸泡5-10min10%次氯酸钠次氯酸钠浸泡浸泡20-30min特点：这类材料的表皮特点：这类材料的表皮有茸毛或蜡质需在灭菌有茸毛或蜡质需在灭菌剂中加入几滴吐温剂中加入几滴吐温-80，以增加灭菌效果。以增加灭菌效果。清水清洗、吸干清水清洗、吸干果实果实70%酒精酒精浸泡浸泡10-30s2%次氯酸钠次氯酸钠浸泡浸泡10-20min常用表面灭菌剂使用浓度和效果常用表面灭菌剂使用浓度和效果二、初代培养物的建立二、初代培养物的建立无菌环境无菌环境 规范操作规范操作 条件合适条件合适 组组织织内内无无菌菌培培养养基基无无

6、菌菌接接种种器器械械无无菌菌工工作作台台无无菌菌技技术术熟熟练练经经验验丰丰富富培培养养基基种种类类激激素素种种类类和和浓浓度度外外植植体体来来源源外外植植体体生生理理状状态态培培养养条条件件手手及及工工作作服服消消毒毒配套技术配套技术 三、形态发生和植株再生三、形态发生和植株再生外植体外植体 愈伤组织愈伤组织 胚状体胚状体 器官分化器官分化 植株植株 有根茎的有根茎的两极器官两极器官 植株植株 先茎后根先茎后根单极器官单极器官先根后茎先根后茎单极器官单极器官脱脱分分化化 再再分分化化 芽或芽原基起源于表层细胞（外起源）芽或芽原基起源于表层细胞（外起源） 根芽原基起源于深层细胞根芽原基起源于深

7、层细胞(内起源内起源)四、培养产物的观察记载四、培养产物的观察记载1、愈伤组织、愈伤组织愈伤组织的类型和色泽愈伤组织的类型和色泽愈伤组织诱导率愈伤组织诱导率=愈伤组织生长量愈伤组织生长量=培养一段时间后愈伤组织重培养一段时间后愈伤组织重 接种时愈伤组织重接种时愈伤组织重产生愈伤组织的外植体数产生愈伤组织的外植体数外植体总数外植体总数 100%2、胚状体、胚状体胚状体诱导率胚状体诱导率=产生胚状体的外植体数产生胚状体的外植体数外植体总数外植体总数 100%3、芽、芽芽分化率芽分化率=产生芽的外植体数产生芽的外植体数外植体总数外植体总数 100%4、根、根先诱导芽后诱导根时，先诱导芽后诱导根时，发

8、根率发根率=培养芽数培养芽数 100%发根芽数发根芽数第二节第二节 植物营养器官培养植物营养器官培养一、植物根段培养一、植物根段培养二、植物茎段培养二、植物茎段培养三、植物叶培养三、植物叶培养离体根培养的意义：离体根培养的意义： 是研究根系生理代谢、器官分化及形态建成的良好实验体系； 对生产某些药物有重要作用，因为有些化合物只能在根中形成。 离体根的培养多见于草本。 注注：自然条件下生长在土壤中的根，解决消毒问题非常困难，在离体根培养中，常用无菌苗的根作为培养材料。一、植物根段培养一、植物根段培养离体根的无性系：离体根的无性系：由单个直根衍生，并经继代培养而保持遗传性一致的根的培养物。1、根无

9、性系的建立、根无性系的建立建建立立根根无无性性系系的的方方式式根的直接增殖根的直接增殖根的间接增殖根的间接增殖无菌根切段接种在低盐培养基（如无菌根切段接种在低盐培养基（如White或或1/2MS培养基）中，培养基）中，25，暗培养，根段形成主根和侧根，每暗培养，根段形成主根和侧根，每隔隔7-10天继代一次，取主根增殖。天继代一次，取主根增殖。无菌根切段接种在愈伤组织诱导培无菌根切段接种在愈伤组织诱导培养基中，诱导愈伤组织，而后再生养基中，诱导愈伤组织，而后再生植株。植株。根根切切段段的的培培养养方方法法固体培养法固体培养法液体培养法液体培养法根切段平放在液体培养基中，摇床根切段平放在液体培养基

10、中，摇床上震荡培养。上震荡培养。根切段根尖方朝上浸露在液体培养根切段根尖方朝上浸露在液体培养基中，另一端插在固体培养基中。基中，另一端插在固体培养基中。固固- -液双层培养法液双层培养法根切段平放在固体培养基上。根切段平放在固体培养基上。2、影响离体根发生和生长的因素、影响离体根发生和生长的因素基本培养基基本培养基植物材料植物材料 光温条件光温条件 低低盐盐培培养养基基蔗蔗糖糖浓浓度度低低1-3%生生长长素素利利于于生生根根植植物物种种类：类：木木本本困困难难植植物物部部位位发发育育年年龄龄不不同同材材料料有有差差异异黑黑暗暗利利于于根根形形成成要要求求温温度度较较低，低，16-25基基因因型

11、型生长调节剂生长调节剂培养方式培养方式 pH值值 培培养养方方式式对对发发根根率率有有影影响响大蒜根尖培养及植株再生大蒜根尖培养及植株再生二、植物茎段培养二、植物茎段培养1、概念、概念 植物茎段培养：对植物的带有一个以植物茎段培养：对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养的技术。的技术。2、茎段培养的目的、茎段培养的目的茎段用于植物离体快繁；茎段用于植物离体快繁； 获得突变体获得突变体 ；理论基础研究。理论基础研究。3、茎段培养过程、茎段培养过程表面消毒的茎段表面消毒的茎段

12、切成几厘米长带节的节段切成几厘米长带节的节段接种到固体培养基接种到固体培养基直接发生不定芽直接发生不定芽形成愈伤组织形成愈伤组织再生苗再生苗生根培养基生根培养基植植 株株茎段培养过程示意图茎段培养过程示意图取健壮茎段取健壮茎段去叶片后自来水冲洗去叶片后自来水冲洗 再生再生MS培养培养75%酒精酒精1分钟分钟次氯酸钠次氯酸钠5-10分钟分钟0.1%升汞升汞注意事项：注意事项： 嫩茎段常作为快速繁殖的外植体：即当嫩茎段常作为快速繁殖的外植体：即当年萌发或新抽出的尚未完全木质化的枝条，其年萌发或新抽出的尚未完全木质化的枝条，其细胞的可塑性大，容易离体培养。细胞的可塑性大，容易离体培养。 体积小、不带

13、叶原基的外植体培养难，体积小、不带叶原基的外植体培养难，成苗所需时间长，体积大的易于成功。成苗所需时间长，体积大的易于成功。4、影响茎段芽增殖的因素、影响茎段芽增殖的因素 细胞分裂素和生长素的配比是关键！细胞分裂素和生长素的配比是关键！其它因素的影响其它因素的影响：如月季茎段增殖培养：如月季茎段增殖培养 1、腋芽在茎段上的位置。每段的一个腋芽培养在无激素的、腋芽在茎段上的位置。每段的一个腋芽培养在无激素的基本培养基上，基本培养基上，23天后，靠近枝条两端的芽发育最慢，枝条中天后，靠近枝条两端的芽发育最慢，枝条中部的芽发育最快。部的芽发育最快。 2、去除茎顶端的作用。继代培养接种时切去嫩茎的顶芽

14、后，、去除茎顶端的作用。继代培养接种时切去嫩茎的顶芽后，再转接于新鲜培养基上，能促进嫩茎的增殖。再转接于新鲜培养基上，能促进嫩茎的增殖。 3、嫩茎长度对形成多芽苗的影响。茎段为、嫩茎长度对形成多芽苗的影响。茎段为1-10 mm长短时，长短时，对形成多芽苗最有效，而且每个茎段的侧枝数也较多，若切割对形成多芽苗最有效，而且每个茎段的侧枝数也较多，若切割过短过短(小于小于1mm)或过长或过长(11-15mm)都对茎的增殖不利。都对茎的增殖不利。三、植物叶培养三、植物叶培养1、概念、概念 以植物的叶器官（叶原基、叶柄、以植物的叶器官（叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、叶肉、子叶等）为外植体叶鞘、叶片、叶肉、子

15、叶等）为外植体进行离体培养的技术。进行离体培养的技术。2、用途、用途 （1）研究叶形态发生过程；）研究叶形态发生过程； （2）研究光合作用、叶绿素形成；）研究光合作用、叶绿素形成； （3）研究遗传转化。）研究遗传转化。3、优点、优点 （1）多数植物的叶片具有很强的再生能力；）多数植物的叶片具有很强的再生能力； （2）数量多、取材方便。）数量多、取材方便。4、叶培养的基本过程、叶培养的基本过程 取叶片取叶片70%酒精浸泡酒精浸泡30s0.1%升汞浸泡数分钟升汞浸泡数分钟接种在固体培养基上接种在固体培养基上愈伤组织愈伤组织胚胚 状状 体体再生植株再生植株多数情况下是这种途径多数情况下是这种途径5、

16、影响叶培养的因素、影响叶培养的因素 植物激素的种类和浓度是关键因素。植物激素的种类和浓度是关键因素。注：一般叶培养比茎段培养困难。注：一般叶培养比茎段培养困难。叶片叶片诱导丛生芽诱导丛生芽生根培养生根培养移栽。移栽。 取嫩叶取嫩叶 70酒精浸泡酒精浸泡30s 0.1升汞溶液消毒升汞溶液消毒5-8 min 无菌水冲洗数次无菌水冲洗数次 切成切成0.5-1 cm的小块接的小块接种于种于MS + 1 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA固体培养基上固体培养基上 光照下培养，光照下培养，35天后叶片直接分化出丛生芽天后叶片直接分化出丛生芽 小丛生芽转接于小丛生芽转接于1/2 MS + 0.

17、2 mg/L IBA的培养基上，的培养基上，接种接种10天后，主茎叶片明显增大，根分化，天后，主茎叶片明显增大，根分化，15天后即天后即可移栽。可移栽。举例：非洲紫罗兰嫩叶离体培养的过程举例：非洲紫罗兰嫩叶离体培养的过程叶片离体培养过程叶片离体培养过程芦荟的植物组织培养过程芦荟的植物组织培养过程 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ABEC花烛叶片离体培养及植株再生花烛叶片离体培养及植株再生第三节第三节 植物繁殖器官培养植物繁殖器官培养一、植物花器官培养一、植物花器官培养二、植物幼果培养二、植物幼果培养三、植物种子培养三、植物种子培养一、植物花器官培养一、植物花器官培养1、概念、概

18、念 对植物的整朵花或花的组成部分（花托、对植物的整朵花或花的组成部分（花托、花柄、花瓣、花丝、子房、花药、胚珠等）花柄、花瓣、花丝、子房、花药、胚珠等）进行离体培养的技术。进行离体培养的技术。2、用途、用途 用于性别决定、果实和种子发育、花形用于性别决定、果实和种子发育、花形态发生的研究。态发生的研究。3、基本过程、基本过程花器官灭菌处理花器官灭菌处理适当切割适当切割固体培养基培养固体培养基培养成熟果实成熟果实不定芽或丛生芽不定芽或丛生芽愈伤组织愈伤组织再生植株再生植株如人参、番茄、如人参、番茄、葡萄的花蕾培养葡萄的花蕾培养如花椰菜的如花椰菜的花托培养花托培养如菊花的花托、如菊花的花托、花瓣培

19、养花瓣培养4、花药培养、花药培养 花药培养花药培养(anther culture):(anther culture):把发育到一定把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上阶段的花药接种在人工培养基上, ,使其发育和分使其发育和分化成为植株的过程化成为植株的过程. .Tobacco anther with developing haploid plantlet, arising from the microspore 2 2、花药培、花药培养的基本程养的基本程序是：序是： n外植体选择外植体选择外植体外植体( (花蕾花蕾) )预处预处理理外植体外植体消毒消毒剥取剥取花药花药接接种种诱导培诱导培养

20、养分化培分化培养养- -移栽移栽 n n5 5、花粉及小孢子培养概念、花粉及小孢子培养概念n花粉培养花粉培养(pollen culture):(pollen culture):也叫小孢也叫小孢子培养子培养(microspore culture),(microspore culture),是从花是从花药中分离出花粉粒药中分离出花粉粒, ,使之成为分散的或使之成为分散的或游离的状态游离的状态, ,通过培养使花粉粒脱分化通过培养使花粉粒脱分化, ,进而发育成完整植株的过程进而发育成完整植株的过程. . 优点（与花药培养比）：优点（与花药培养比）：a a、花药培养容易受药壁、花丝、药隔、花药培养容易受

21、药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生植株会出等体细胞组织的影响，再生植株会出现不同倍性的个体，而分离的花粉培现不同倍性的个体，而分离的花粉培养可以克服这一不足。养可以克服这一不足。b b、能更好调节控制核发育的各种因子，、能更好调节控制核发育的各种因子，而且可以直接从单细胞开始观察整个而且可以直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程，为研究雄核的生理雄核发育的过程，为研究雄核的生理生化等问题提供方便。生化等问题提供方便。c c、原则上将，从花粉培养能得到更多、原则上将，从花粉培养能得到更多的花粉植株。的花粉植株。二、植物幼果培养二、植物幼果培养 1、概念、概念：对植物不同发育时期的幼小果：对

22、植物不同发育时期的幼小果实进行离体培养的技术。实进行离体培养的技术。 2、用途、用途：用于果实发育、种子形成和发：用于果实发育、种子形成和发育等方面的研究。育等方面的研究。 3、培养过程、培养过程：培养后直接得到的常是成：培养后直接得到的常是成熟果实或愈伤组织。熟果实或愈伤组织。三、植物种子培养三、植物种子培养 1、概念、概念：对受精后发育不全的未成熟种：对受精后发育不全的未成熟种子进行离体培养的技术。子进行离体培养的技术。 2、用途、用途： 打破种子休眠，缩短生活周期；打破种子休眠，缩短生活周期； 挽救远缘杂种，提高杂种萌发率挽救远缘杂种，提高杂种萌发率。 获三倍体或单倍体植株获三倍体或单倍

23、体植株 3、培养过程及特点、培养过程及特点： 培养的直接产物有：小植株，愈伤组织，丛生芽或不定芽。培养的直接产物有：小植株，愈伤组织，丛生芽或不定芽。 种子培养要求糖浓度较低（种子培养要求糖浓度较低（1-3%），培养目的不同，培养基），培养目的不同，培养基不同。不同。 成熟种子成苗：培养基简单，不加生长调节剂；成熟种子成苗：培养基简单，不加生长调节剂； 未成熟种子成苗：培养基成分较全，需加生长调节剂；未成熟种子成苗：培养基成分较全，需加生长调节剂； 培养种子产生愈伤组织或不定芽：培养基成分、营养物质培养种子产生愈伤组织或不定芽：培养基成分、营养物质全面，添加不同种类、浓度的生长调节剂。全面，添

24、加不同种类、浓度的生长调节剂。 胚胎培养是指使胚或具胚器官在离体无菌条件下发育胚胎培养是指使胚或具胚器官在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。成幼苗的技术。 根据在培养中所取的外植体的部位不同，植物胚胎培根据在培养中所取的外植体的部位不同，植物胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养。养包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养。 胚珠和子房培养由于取材的时期不同，又包括：胚珠和子房培养由于取材的时期不同，又包括： 受精以后的胚珠子房培养受精以后的胚珠子房培养 未受精胚珠和子房未受精胚珠和子房成熟胚培养成熟胚培养幼胚培养幼胚培养n胚乳培养胚乳培养n胚乳培养的研究主要集中在以下胚乳培养的研究主

25、要集中在以下一些问题的探讨：一些问题的探讨： nA A、胚乳细胞的全能性。、胚乳细胞的全能性。 nB B、能否通过胚乳培养获得三倍体、能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实；植株而得到无籽结实； C C、研究、研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。离体培养条件下胚和胚乳的关系。Triticum grain 到目前为止，已有到目前为止，已有4040多种植物的多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再梨、核桃等的胚乳培养得到了

26、再生植株。其它有的分化出芽、根、生植株。其它有的分化出芽、根、叶等或得到愈伤组织。叶等或得到愈伤组织。 Plantlets arising from isolated endosperm tissue 第四节第四节 植物组织培养植物组织培养 离体植物组织培养对研究形态发生、器官离体植物组织培养对研究形态发生、器官发生、植株再生、植株脱毒、组织培养基础理发生、植株再生、植株脱毒、组织培养基础理论的建立等具有重要的作用，在整个离体培养论的建立等具有重要的作用，在整个离体培养研究中占有重要的地位。研究中占有重要的地位。植植物物组组织织培培养养分生组织培养分生组织培养愈伤组织培养愈伤组织培养薄层组织培

27、养薄层组织培养顶端分生组织（根尖、茎尖等）顶端分生组织（根尖、茎尖等）形成层组织形成层组织对植物的薄细胞层进行离体培养的对植物的薄细胞层进行离体培养的技术。如灭菌后的器官切取技术。如灭菌后的器官切取3-6层薄层薄细胞层（如细胞层（如3-6层表皮细胞及表皮下层表皮细胞及表皮下细胞组成的薄层组织）细胞组成的薄层组织）一、植物分生组织培养一、植物分生组织培养分生组织培养的特点：分生组织培养的特点： 生命力强；生命力强； 分裂能力持久；分裂能力持久； 培养时易发生细胞分化再生植株；培养时易发生细胞分化再生植株； 利于获得无病毒植株。利于获得无病毒植株。1、茎尖培养研究最为深入，广泛用于植株再生和脱病、

28、茎尖培养研究最为深入，广泛用于植株再生和脱病 毒的研究及应用毒的研究及应用2、茎尖培养可能发育的方向：、茎尖培养可能发育的方向： （1）芽萌发）芽萌发 （2）产生胚状体）产生胚状体 （3）产生不定器官）产生不定器官 （4）形成愈伤组织）形成愈伤组织3、影响发育方向的因素、影响发育方向的因素 （1）茎尖大小（用于脱毒的茎尖小，快繁的茎尖大）茎尖大小（用于脱毒的茎尖小，快繁的茎尖大） （2）培养条件）培养条件 （3）生长调节剂的种类和浓度）生长调节剂的种类和浓度4、茎尖培养常用的培养基：、茎尖培养常用的培养基：MS培养基培养基5、注意事项：不得使用、注意事项：不得使用2，4-D，避免产生愈伤组织。

29、，避免产生愈伤组织。二、植物愈伤组织培养二、植物愈伤组织培养愈伤组织培养的作用：愈伤组织培养的作用： 1、研究脫分化、再分化、生长和发育、遗、研究脫分化、再分化、生长和发育、遗传变异、育种和次生代谢产物的生产等；传变异、育种和次生代谢产物的生产等； 2、是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。、是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。愈伤组织培养的条件：愈伤组织培养的条件：黑暗或弱光，黑暗或弱光，25三、植物薄层组织培养三、植物薄层组织培养薄层组织培养的作用：薄层组织培养的作用： 研究形态发生机理和影响因素及遗研究形态发生机理和影响因素及遗传变异产生的机理。传变异产生的机理。一、污染及控制一、污染及控制1

30、、污染的含义：污染的含义：指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑，使培养材料指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。第五节第五节 组织培养常见问题及对策组织培养常见问题及对策2、污染原因（从病原菌分析）、污染原因（从病原菌分析）（1）细菌污染：菌斑呈黏粘液状，界限比较明显，一般接）细菌污染：菌斑呈黏粘液状，界限比较明显，一般接种后种后12天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌。天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌。（2）真菌污染：菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有）真菌污染：菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的

31、孢子接种后不同颜色的孢子接种后310天才能发现。主要是霉菌污染。天才能发现。主要是霉菌污染。3、污染途径：、污染途径：（1）外植体带菌）外植体带菌（2）培养基及接种器具灭菌不彻底）培养基及接种器具灭菌不彻底（3）接种操作时带入）接种操作时带入（4）环境不清洁）环境不清洁4、污染的预防措施：、污染的预防措施：A、 防止外植体带菌防止外植体带菌（1） 选择好外植体采集时期和采集部位选择好外植体采集时期和采集部位 外植体采集以春秋为宜；外植体采集以春秋为宜； 优先选择地上部分作为外植体；优先选择地上部分作为外植体； 阴雨天勿采，晴天下午采集；阴雨天勿采，晴天下午采集； 采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋

32、。采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。（2）室内或无菌条件下进行预培养。）室内或无菌条件下进行预培养。（3）外植体严格灭菌）外植体严格灭菌 灭菌效果实验灭菌效果实验 多次灭菌和交替灭菌多次灭菌和交替灭菌 B、保证培养基及接种器具彻底灭菌、保证培养基及接种器具彻底灭菌1 分装时，注射器勿触瓶口。培养基勿粘瓶口分装时，注射器勿触瓶口。培养基勿粘瓶口2 检查封口膜是否破损检查封口膜是否破损3 扎瓶口要位置适当，松紧适宜扎瓶口要位置适当，松紧适宜4 保证灭菌时间和高压锅内温度保证灭菌时间和高压锅内温度5 接种工具用前彻底灭菌接种工具用前彻底灭菌6 工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌工作服、口罩、帽

33、子等布质品定期进行湿热灭菌C、操作人员严格遵守无菌操作规程、操作人员严格遵守无菌操作规程D、 保证接种与培养环境清洁保证接种与培养环境清洁（1） 污染瓶经高压灭菌后再清洗污染瓶经高压灭菌后再清洗（2）接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射，或用臭氧灭菌机消）接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射，或用臭氧灭菌机消毒毒（3）定期清洗或更换超净台初过滤器，进行带菌实验；接种前）定期清洗或更换超净台初过滤器，进行带菌实验；接种前1520min打开风机，风速调整到打开风机，风速调整到2030m/min，并对台面用，并对台面用75%酒精喷雾消毒酒精喷雾消毒（4）定期对培养室消毒，防止高温）定期对培养室消毒，防止高温

34、二、培养物的不良表现及改进措施二、培养物的不良表现及改进措施 （一）、初始培养阶段（一）、初始培养阶段1、培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯、培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯 可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。（部位或时期）。 改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。其他部位，生长初期取材。2.培养物长期培养几乎无反应培养物长期培养几乎无反应 可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度可能

35、原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。不适宜。 改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用离子浓度，增加生长素用量，试用2,4-D，调整培养温度。，调整培养温度。3.愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状 可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。 改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度

36、。（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。4.愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢 可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。 改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。比例，降低糖浓度。5.侧芽不萌发侧芽不萌发,皮层过于膨大皮层过于膨大,皮孔长出愈伤组织皮孔长出愈伤组织 可能原因可能原因:枝条过嫩枝条过嫩,生长素、细胞分裂素用量过多。生长素、细胞分裂素用量过多。 改进措施：减少激素用量，采

37、用较老化枝条。改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。 6、初代培养外植体的褐变、初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。制其他酶的活性，从而

38、影响所接种外植体的培养。 （1）、褐变的主要原因如下：）、褐变的主要原因如下： 植物品种植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。有研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。 生理状态生理状态 由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较度也有所不同。一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而

39、从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。 培养基成分培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。

40、培养条件不当培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。植体的褐变程度。（2）、减轻褐变现象发生的方法）、减轻褐变现象发生的方法 选择合适的外植体选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 合适的培养条件合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适当降无机盐成分、植物生长物质水平、适当降低培养基温度，及时继代培养均可以减轻材

41、料的褐变现象。低培养基温度，及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。使用抗氧化剂使用抗氧化剂 半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏血酸等。该类药剂一般需用浓度为肽、抗坏血酸等。该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L。用。用经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或加入固体经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或加入固体培养基的表层，或将刚切割的外植体浸入其中一定时间。另外，培养基的表层，或将刚切割的外植体浸入其中一定时间。另外，使用使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。 连续

42、转移连续转移 对容易褐变的材料可间隔对容易褐变的材料可间隔1224h的培养后，再转的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。会得到控制或大为减轻。 （二）、继代培养阶段（二）、继代培养阶段 1.苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高 可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。 改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽

43、继代为团块（丛芽）继代。改单芽继代为团块（丛芽）继代。 2.苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化微型化 可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。 改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。3.分化率低分化率低,畸形畸形,培养时间长时苗再次愈伤组织化。培养时间长时苗再次愈伤组织化。 可能原因可能原因:生长素用量偏高生长素用量偏高,温度偏高。温度偏高。 改进措施：减少生长素用量，适当降温。改进措施：减少生长素用量，适当降温。4.

44、叶粗厚变脆叶粗厚变脆 可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。 改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基 5.再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来 可能原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再可能原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。生方式。 改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式生方式 6.丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽丛生苗过

45、于细弱，不适于生根或移栽 可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。 改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，降低接种密度。时间，增强光照，及时转接，降低接种密度。 7.幼苗淡绿，部分失绿幼苗淡绿，部分失绿 可能原因：无机盐含量不足，可能原因：无机盐含量不足，pH值不适宜，铁、锰、镁等值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。缺少或比例失调，光照、温

46、度不适。 改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好pH值，值，调控温度、光照。调控温度、光照。8.幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中 可能原因：瓶内气体状况恶化，可能原因：瓶内气体状况恶化，pH值变化过大，久不转值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当、缺铁等。比不当、缺铁等。 改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气

47、体状况，控制温度。养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。 9、继代培养时材料的玻璃化、继代培养时材料的玻璃化 实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。玻璃化为试管苗的生理失调症。 因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。在不同

48、的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。 呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。

49、这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为：造成的，其具体解决的方法为： 增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势； 减少培养基中含氮化合物的用量；减少培养基中含氮化合物的用量； 增加光照；增加光照； 增加容器通风，最好进行增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；的现象有明显的作用； 降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；现

50、象发生； 降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。 两个两个“增加增加”：增加琼脂浓度；增加蔗糖含量；：增加琼脂浓度；增加蔗糖含量； 两个两个“增强增强”：增强溶器通风；增强光照；：增强溶器通风；增强光照； 两个两个“加入加入”：加入渗透剂；加入加入渗透剂；加入ABA； 一个一个“减少减少”：减少培养基氮含量：减少培养基氮含量（三）、生根阶段（三）、生根阶段 1、培养物久不生根，基部切口没有适宜的愈伤组织、培养物久不生根，基部切口没有适宜的愈伤组织 可能原因：生长素种类、用量不适宜；生根部位氧气不良；可能原因：生长素种类、用量不适