植物组织培养第三章植物器官和组织培养课件.ppt

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1、关于植物组织培养第三章植物器官和组织培养第1页，此课件共98页哦组织培养步骤图组织培养步骤图第2页，此课件共98页哦（1 1）准备阶段）准备阶段 查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制定查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制定出切实可行的培养方案。出切实可行的培养方案。根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。（2 2）外植体的选择与消毒）外植体的选择与消毒 选择合适的部位作为外植体，采回后经过处理，然后进行消毒处选择合适

2、的部位作为外植体，采回后经过处理，然后进行消毒处理。理。将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或剥离出茎尖、挑出花药，接种到启动培养基上。剥离出茎尖、挑出花药，接种到启动培养基上。第3页，此课件共98页哦（3 3）启动培养）启动培养 接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。芽。将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基或将愈伤组织转移到分化培养基

3、分化成不同的器官原基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。形成胚状体，最后发育形成再生植株。（4 4）增殖培养）增殖培养 分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的增殖培养基经反分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的增殖培养基经反复多次切割转接。复多次切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根，当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的还要进行病毒另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的还要进行病毒检测。检测。第4页，此课件共98页哦（5 5）生根培养）生根培养 刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降低刚形成的芽苗往往比较弱小，多

4、数无根，此时可降低或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗生根，或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗生根，提高其健壮度。提高其健壮度。（6 6）炼苗移栽）炼苗移栽 选择生长健壮，有选择生长健壮，有3 35 5条根的生根苗进行炼苗，移栽到疏条根的生根苗进行炼苗，移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫。当苗完全成活后，再松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫。当苗完全成活后，再移向大田。移向大田。第5页，此课件共98页哦拟定培养方案拟定培养方案外植体预处理外植体预处理外植体无菌接种外植体无菌接种启动培养启动培养分化出芽、胚状分化出芽、胚状体或原球茎体或原球茎继代增殖培养继代增殖

5、培养生根培养生根培养炼苗移栽炼苗移栽成活供生产使成活供生产使用用植物组织培养的一般程序植物组织培养的一般程序 培养基配制灭菌培养基配制灭菌第6页，此课件共98页哦第一节第一节 植物器官和组织培养的基本程序植物器官和组织培养的基本程序n无菌外植体的获得n初代培养物的建立 n形态发生和植株再生n培养产物的观察记载第7页，此课件共98页哦无菌外植体的获得无菌外植体的获得（一）茎尖、茎段、叶片的灭菌 清水冲洗，吸干0.1-0.2%氯化汞浸泡2-10min，（70%酒精浸泡数秒，10%次氯酸钙浸泡10-20min或2%次氯酸钠浸泡15-30min）灭菌水冲洗3-5次无菌滤纸吸干分割接种。（二）根、块茎、

6、鳞茎的灭菌生长在土中，灭菌困难，以受损伤。灭菌前仔细清洗，加大灭菌剂浓度或延长灭菌时间。第8页，此课件共98页哦无菌外植体的获得无菌外植体的获得（三）花蕾的灭菌 未开放的花蕾中的花药为花被包裹，处于无菌状态，采摘后可直接灭菌。70%酒精浸泡10-30s0.1-0.2%氯化汞浸泡3-10min，（或1%次氯酸钠浸泡10-20min）灭菌水冲洗3-5次无菌滤纸吸干分割接种。（四）果实和种子的灭菌 表皮有茸毛或蜡质，需在灭菌剂中加入几滴土温-80。果实70%酒精浸泡数秒0.1-0.2%氯化汞浸泡3-10min，（或1%次氯酸钠浸泡10-20min）灭菌水冲洗3-5次无菌滤纸吸干分割接种。第9页，此课

7、件共98页哦初代培养物的建立初代培养物的建立（一）无菌环境 培养基、接种器械、超净工作台、接种室环境、抗生素物质（去除侵入组织内部的病菌。见表）（二）规范操作 操作技术熟练、工作经验、操作者、进入超净工作台的物品表面。（三）条件合适 培养基种类、激素种类和浓度、其他添加物、外植体来源、生长发育状态、培养条件。第10页，此课件共98页哦形态发生和植株再生形态发生和植株再生建立的无菌培养物在适宜的离体环境中，生长发育（形态发生）形成完整的小植株。离体材料的形态发生的途径：器官发生器官发生体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生第11页，此课件共98页哦形态发生和植株再生形态发生和植株再生器官发生：芽或芽原基起

8、源于培养组织中比较表层的细胞，即外起源。根原基发生在组织较深处，即内起源。两者之间一般没有什么联系，呈现单向极性。胚状体发生：极大多数体细胞胚起源于单细胞，形成的胚状体具有双极性，在其发育的早期阶段，在方向相反的两端分化出茎端和根端，其维管组织与母体植物或外植体的维管组织通常没有联系。胚状体维管组织呈独立的Y形。第12页，此课件共98页哦 外植体形态发生形成完整植株的途径外植体形态发生形成完整植株的途径（一）外植体（一）外植体-愈伤组织愈伤组织-完整植株。完整植株。具体又可分为三种：具体又可分为三种：1 1、愈伤组织、愈伤组织-同时长芽和根同时长芽和根-植株。植株。2 2、愈伤组织、愈伤组织-

9、茎茎-根根-植株。植株。3 3、愈伤组织、愈伤组织-根根-芽芽-植株。植株。4 4、愈伤组织、愈伤组织-体细胞胚体细胞胚-植株植株第13页，此课件共98页哦（二）外植体（二）外植体-胚状体胚状体-植株。可从以下几种培养物中产生：植株。可从以下几种培养物中产生：1 1、器官上发生。、器官上发生。2 2、愈伤组织上发生。、愈伤组织上发生。3 3、游离单细胞发生。、游离单细胞发生。4 4、小孢子发生。、小孢子发生。诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整。诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整。（三）外植体（三）外植体-直接形成根与芽直接形成根与芽-植株。如茎尖培养植株。如茎尖培养 第14页，

10、此课件共98页哦第15页，此课件共98页哦培养产物的观察与记载培养产物的观察与记载（一）愈伤组织（一）愈伤组织诱导率诱导率=产生愈伤组织的外植体数产生愈伤组织的外植体数/外植体总数外植体总数100%生长量生长量=培养一段时间后愈伤组织干重或鲜重培养一段时间后愈伤组织干重或鲜重-接种时愈伤组织接种时愈伤组织的干重或鲜重的干重或鲜重（二）胚状体（二）胚状体胚状体诱导率胚状体诱导率=产生胚状体的外植体数产生胚状体的外植体数/外植体总数外植体总数100%（三）芽（三）芽芽分化数芽分化数=产生芽的外植体数产生芽的外植体数/外植体总数外植体总数100%（四）根（四）根发根率发根率=发根芽数发根芽数/培养芽

11、数培养芽数每个材料平均发根数每个材料平均发根数第16页，此课件共98页哦第二节 植物营养器官培养n植物根段培养n植物茎段培养n植物叶培养第17页，此课件共98页哦一、离体根的培养一、离体根的培养 植物根段培养是指以植物的根切段为外植体进行培养的技术。（一）根无性系的建立来自无菌种子发芽产生的幼根切段或植物根系经灭菌处理后的切段，可以以两种方式进行培养，建立根的无性繁殖系。第18页，此课件共98页哦1、根的直接增殖1）根无性繁殖系的建立 将种子进行表面消毒，在无菌条件下进行无菌萌发，待根伸长后从根尖一段切取长1.0cm的根尖，接种培养基中。这些根的培养生长很快，番茄根每天约生长10mm，几天后发

12、育出侧根。待侧根生长约一周后，即可切取侧根的根尖进行扩大培养，它们又迅速生长出侧根，又可切下进行培养，如此反复，就可得到从单个根尖衍生而来的离体根的无性系。2）培养条件：黑暗培养，温度为2527一、离体根的培养一、离体根的培养 第19页，此课件共98页哦3）培养基 离体根培养所用的培养基很多，多为无机离子浓度低的White培养基，其他培养基如MS、B5培养基等也可采用，但必须将其离子浓度稀释到2/3或1/2。一、离体根的培养一、离体根的培养 第20页，此课件共98页哦一、离体根的培养一、离体根的培养 4）培养方式 离体根的培养方式有三种类型。第一种固体培养法，即将根尖接种在固体培养基上，根依靠

13、培养基中的养分和生长物质而不断生长。第二种是液体培养法，把根尖接种在无琼脂的液体培养基中，经常振荡使根获得充足的氧气。第三种是固体-液体培养法，就是把根基部插入固体琼脂培养基中，根尖浸在液体培养基中，根尖生长而根不断的伸长和分枝。第21页，此课件共98页哦2、根的间接增殖第一步在脱分化培养基上诱导形成愈伤组织，如胡杨的根段培养，可诱导形成白色愈伤组织。第二步在再分化培养基上诱导形成芽的分化，如胡杨从绿色愈伤组织分化出小植株。一、离体根的培养一、离体根的培养 第22页，此课件共98页哦胡萝卜根培养第23页，此课件共98页哦（二）离体根生长的营养要求n1、无机成分 要求培养基中有全部必要元素，因为

14、它是离体生长所需要的，一般的为MS、B5培养基。n2、氮源 氮源有铵态氮、硝态氮和可溶性有机氮如氨基酸或酰胺等，其中以硝态氮的效果最好。加入含各种氨基酸的水解酪蛋白，能促进离体根的生长。一、离体根的培养一、离体根的培养 第24页，此课件共98页哦n3、碳源 以蔗糖的效果最佳，几乎为葡萄糖的10倍。蔗糖的浓度为23%。n4、维生素 维生素以B1和B6最为重要，缺少它根的生长受到阻碍，而加入它可使根的生长成倍的加快。B1的使用浓度为0.1-1.0mg/L为宜。n5、生长物质 对离体根的生长而言，生长素的效应最为明显，在一般情况，加入适量的生长素能促进根的生长，其反应和需要量因植物种而异：n6、温度

15、和光照 黑暗有利于根的形成，温度一般在16-25n7、PH 根发生和生长所需的PH范围一般为5.0-6.0一、离体根的培养一、离体根的培养 第25页，此课件共98页哦二、茎段培养二、茎段培养n茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎等在内的幼茎切段）的无菌培养。n目的:1、快速繁殖，2、探讨茎细胞的分裂潜力和全能性，以及诱发细胞变异，筛选突变体。n我们主要是介绍用于快速繁殖为目的的茎段培养。第26页，此课件共98页哦茎段茎段 茎尖取材茎尖取材有限，可采有限，可采用带节或不用带节或不定牙的茎段定牙的茎段进行培养。进行培养。第27页，此课件共98页哦茎段培养用于快

16、速繁殖的优点茎段培养用于快速繁殖的优点培养技术简单易行，繁殖速度较快，每年可增殖105-1012株苗；加速良种和珍贵植物的繁殖，芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一；解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖的问题，且可节省种株；试管苗便于运输和防止种苗带菌传播，有利于国际种质交流；试管苗可用于保存某些难以用种子保存的种质资源。第28页，此课件共98页哦nMurashige(1974)曾提出用组织培养法进行植物快速繁殖三个阶段的概念，n第一阶段外植体成苗；n第二阶段繁殖体增殖；n第三阶段移植于土壤中长根。n这三个阶段对于不同植物来说有不同的反应，应用于草本植物是成功的，但对木本植物来说

17、，最大的困难是第三个阶段。第29页，此课件共98页哦1 1、无菌苗的建立、无菌苗的建立目的：从所取用的外植体诱发芽的形成，以获得无菌苗。可能有四种不同结果：一是得到单生芽，二是得到丛生芽：细胞分裂素水平高时三是得到长根的完整植株。四是得到愈伤组织：生长素水平较高时作为快速繁殖而言，我们希望属于第一、第二结果，它有利于提高繁殖系数，加速繁殖速度。第30页，此课件共98页哦2 2、无菌苗的增殖、无菌苗的增殖增殖的途径 一是诱导形成大量的胚状体二是诱导形成大量的不定芽三是促进腋芽的快速形成。第31页，此课件共98页哦2 2、无菌苗的增殖、无菌苗的增殖优缺点：第一、二种途径的好处是增殖速度快，但会产生

18、变异，第三种途径的好处是不会产生变异，能保持品种优良特性，且方法简便，可在各种植物上使用，但增殖速度不如前二者。若用于育种，以第一、第二种途径有利，而用于良种快速增殖，以第三种途径有利，主要是要保证良种的优良品性，不产生变异。目前已广泛采用，每年每个芽可增殖10万株乃至上百万株。第32页，此课件共98页哦腋芽增殖的原理腋芽增殖的原理 高等植物的每个叶腋中都有腋芽存在，通常由于顶芽的存在，顶端优势阻止腋芽的生长，但在一定的条件下可以使它生长，如除去顶芽或使用生长激素，可以解除顶端优势，腋芽便不断分化和生长，逐渐形成芽丛。若反复切割这些腋芽和移植到新的培养基中继代培养，就可在短期内得到大量的芽。第

19、33页，此课件共98页哦影响增殖成功的关键因素影响增殖成功的关键因素A、细胞分裂素 在腋芽增殖上的主要措施是用细胞分裂素抑制顶端优势，促进腋芽生长发育，所以在这一阶段培养基中添加细胞分裂素是必须的。实践证实，除个别的例子外，加入细胞分裂素是行之有效的。6-BA对促进腋芽增殖是最有效，依次为KIN和2ip。一般浓度在0.25mg/l以上，少数用1.0mg/L，个别的用5mg/L。第34页，此课件共98页哦B、生长素 生长素虽不能促进腋芽增殖，但可改善苗的生长，因此，许多种植物也都加入一定的生长素类物质。其中使用最多的是NAA，依次为IBA、IAA和2，4-D，它们的使用浓度多为0.5mg/L以下

20、。影响成功的关键因素影响成功的关键因素第35页，此课件共98页哦C、GA GA对芽的伸长有促进作用，故常加入少量的GA，使用浓度为0.5mg/L。D、光照 光照条件也十分重要，这一阶段必须保持适当的光周期(16小时光照)和光强(2000-3000Lux)，以利芽的再生和生长。影响成功的关键因素影响成功的关键因素第36页，此课件共98页哦3 3、无菌苗的生根、无菌苗的生根n这个阶段的目的是使再生的大量试管苗形成根系，获得完整的植株，在前两阶段以长苗为目的，使用的生长激素往往不利于生根的发生和生长，因此在这个阶段，必须创造一个适于根的发生和生长的条件。n主要是降低或除去细胞分裂素，而加入或增加生长

21、素。第37页，此课件共98页哦影响生根成功的关键因素影响生根成功的关键因素培养基的盐浓度 试管苗的生根，对基本培养基的种类要求不严，一般的培养基都可用于诱导生根，但对其含盐浓度要适量加以稀释。前面的几种培养基中，除White培养基外，都富含N、P、K盐，它们都抑制根的发生。因此，应将它们降低到1/2、1/3或1/4，甚至更低的水平。就可得到理想的生根结果。第38页，此课件共98页哦生长素的浓度 细胞分裂素同生长素的比值大于1时，有利于芽的产生和生长；比值小于1时，则有利于根的产生和生长。由于在苗增殖时施用了较高浓度的细胞分裂素，其苗中尚保持着一定的量，因此在生根培养时一般不需要添加细胞分裂素，

22、或者仍使用较低浓度的细胞分裂素，如降低到0.02mg/L以下。生长素是必须的，且需要较高的浓度。使用的生长素类物质最多的是NAA，依次为IBA、IAA、2，4-D。生长素的浓度，NAA一般是0.1-1.0mg/l不等。IBA和IAA可稍高些。第39页，此课件共98页哦光照和温度条件 增强光照有利于发根，且对成功地移栽到盆钵中有良好作用，故在生根培养时应增加光照时间和光照强度。但强光直接照射根部会抑制根的生长，所以在生根培养基时最好在培养基中加入0.3%的活性碳，可促进生长。第40页，此课件共98页哦4 4、试管苗的移植、试管苗的移植 1）盆土的准备 土最好是经过干热灭菌、高温高压灭菌，或者用福

23、尔马林（5%）或（0.3%）硫酸铜稀释液喷洒在土壤中，然后用塑料布覆盖一周，在翻动土，让其溶液气味挥发掉。为了有利于试管苗根系的发育，要求移栽土疏松，因此与1/21/3的草木灰混合起来作为移植的介质。也可以用山土和腐熟过的木屑或其它通气良好的介质。第41页，此课件共98页哦2）遮荫和加热设备的准备 试管苗在冬天或夏天移栽时，最初的几天里要注意温度与日照的变化不能有急剧的变化，温度最好与培养室的温度一致或接近。光也不能直射，主要因为植株的根系还未得到重新发育。夏天温度过高，造成植株萎蔫，冬天温度太低导致植株死亡。第42页，此课件共98页哦3）炼苗 将试管苗容器口的塞子或纸去掉，并在培养室中放置1

24、天。从培养室移至常温条件下放置几天，要注意不要染菌。第43页，此课件共98页哦4）移栽 将试管苗从培养瓶中取出，小心操作，勿把根系损坏。然后洗净根部的培养基。在盆土中开一穴，将植株栽下，最好将根铺展开，种植不要过深，也不能过浅，不要用手用力压土，以免造成根系的损伤。第44页，此课件共98页哦5 5、移栽后管理、移栽后管理 土壤要保持疏松，通气要好，这样有利于根系的发育。水分的控制要得当，移栽后第一次浇水要浇透，且勿出现上湿下干现象。第一次浇水最好采用渗水的方式，即将刚移栽的盆放在装有水的盆中，让水从盆底逐渐渗上来，水在盆面出现既可。平时要勤观察，保持土壤湿润。湿度控制要适当大一些，对试管苗的恢

25、复发育和根系的形成有好处。因而要在盆口用玻璃器皿或塑料布罩上。这样有利于保证湿度，但是也要注意通风，防止发霉而事得其反 第45页，此课件共98页哦 温度 夏天要让试管苗在阴凉的地方进行过渡，冬天要在温室中过渡一段时间，以免温度过高或过低导致试管苗的死亡。光照 刚移栽的试管苗且勿在阳光下。注意天气变化，试管苗应移栽在无风的地方，移栽初期应避免大的风雨的袭击。第46页，此课件共98页哦三、离体叶的培养三、离体叶的培养n离体叶培养是指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。n再生植株的方式有两种：一种是直接诱导形成芽或胚状体，另一种是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化成植株。n叶

26、培养的结果：芽或胚状体；愈伤组织；成熟叶第47页，此课件共98页哦第48页，此课件共98页哦叶的离体培养技术叶的离体培养技术 1、材料灭菌 取干净幼嫩的叶，用70%酒精漂洗10秒钟，再在饱和漂白粉中浸815分钟，用无菌水冲洗数次，再把叶子夹放在无菌干滤纸上吸干水份，供接种用。注意粗糙的或带绒毛的叶较难除菌，应在消毒液中加入一滴吐温(一种表面活化剂)，时间应适当的延长。第49页，此课件共98页哦2、接种 把消毒过的叶组织切成约0.2cm2小块或薄片，接种在MS培养基或其它常用的培养基中，附加足够量的生长素(如2，4-D2mg/L)或细胞分裂素(如0.2mg/L6-BA)。第50页，此课件共98页

27、哦3、培养 叶接种物应放在25，每天10小时的光照，光强约15002000LUX的培养室中培养。培养约经两周至月余，叶切口乃至切块开始增厚肿大，进而形成愈伤组织。这时应转移到含细胞分裂素约2mg/L的再分化培养基上进行分化培养，约经10天愈伤组织开始转绿，因而出现绿色芽点，它们将发育成苗。若在分化培养基上不长根，还需将苗移至NAA0.5mg/L的生根培养基上诱导生根，从而发育成完整的植株。第51页，此课件共98页哦叶片愈伤组织诱导形成第52页，此课件共98页哦4 4、培养中应注意的问题、培养中应注意的问题 首先要选用易培养成功的叶组织，如幼嫩叶比成熟叶易培养，子叶比叶片易于培养。其次要添加适当

28、种类和数量的生长激素，叶的培养比胚、茎尖、茎段培养难度大，因此生长激素的选用是十分重要的，往往以多种生长素或多种细胞分裂素的配合使用，较有利于叶组织的脱分化和再分化。如水稻叶片单用2，4-D效果差，而2，4-D、NAA、IAA等三种生长素以4:2:1(mg/L)的比例配合使用，有利于愈伤组织形成。第53页，此课件共98页哦第三节 植物繁殖器官培养n植物花器官培养n植物幼果培养n植物种子培养第54页，此课件共98页哦植物花器官培养植物花器官培养n植物的花器官培养：对植物的整朵花或花的组成部分（花托、花柄、花瓣、花丝、子房、花药、胚珠等）进行离体培养的技术。n将未开放的花蕾、花柄、花瓣、花托等组织

29、经过灭菌处理或适当切割后，在适宜条件下进行培养。n培养结果可能有：成熟果实、不定芽或丛生芽、愈伤组织 第55页，此课件共98页哦植物幼果培养植物幼果培养n植物幼果培养：对植物不同发育时期的幼小果实进行离体培养的技术。n经过灭菌处理后，在适宜条件下进行培养。n培养结果可能有：成熟果实、愈伤组织 第56页，此课件共98页哦植物种子培养植物种子培养n植物种子培养：对受精后发育不全的未成熟种子和发育完全的成熟种子实进行离体培养的技术。n经过灭菌处理后，在适宜条件下进行培养。n培养结果可能有：小植株、愈伤组织、丛生芽或不定芽。n对糖浓度要求一般较低，为1-3%。第57页，此课件共98页哦第四节 植物组织

30、培养植物分生组织培养植物愈伤组织培养植物薄层组织培养第58页，此课件共98页哦 植物分生组织培养植物分生组织培养是指对植物的分生组织进行离体培养的技术，包括植物根尖、茎尖等顶端分生组织和形成层组织的培养。茎尖培养：茎尖培养：对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。茎尖组织经过适当培养后，可能发育的方向为：芽萌发、产生胚状体、产生不定器官、形成愈伤组织。植物分生组织的培养植物分生组织的培养第59页，此课件共98页哦植物愈伤组织培养植物愈伤组织培养植物愈伤组织培养：植物愈伤组织培养：诱导植物外植体产生无序生长的薄壁细胞及对其培养的技术。植物的各种器官及组织，经培养都可产生愈伤组织，并能不断

31、继代繁殖。一般薄壁细胞和形成层容易形成愈伤组织，愈伤组织的质地差异很大，有的紧密坚实，有的疏松柔软。第60页，此课件共98页哦植物愈伤组织培养植物愈伤组织培养致密坚实的愈伤组织内无大的细胞间隙，由管状分子组成维管组织；疏松柔软的愈伤组织有大量的大细胞间隙，细胞排列无序。两种质地的愈伤组织可以利用生长素进行转换，即高浓度生长素变致密坚实愈伤组织为疏松柔软。愈伤组织通常在黑暗或弱光下进行，温度为25第61页，此课件共98页哦茎尖分生组织培养n茎尖分生组织培养仅指长度不超过0.1mm茎尖的顶端圆锥区的培养，这么小的外植体是不易培养成功的，因此只有在用于某些植物获得无病原体的植物才采用，而一般都采用较

32、大的带一个和几个叶原基的茎尖培养。第62页，此课件共98页哦能得到无病毒的植株的主要原因是：n病毒侵染植株后，通过胞间连丝转移到其他细胞中，或依靠筛管进行转移。因此，病毒在患病植株上的分布是不均匀的，即老的成熟器官中病毒含量高，幼嫩未成熟的器官中病毒含量较低而茎尖分生组织，在细胞没有充分分化以前不受侵染，故几乎不带病毒。第63页，此课件共98页哦1、培养技术茎尖组织的分离 从未发病植株上，取正在生长的顶芽、萌发芽和球茎的中心芽。材料用70%的酒精浸没几秒到数十秒钟，再在稀释20倍的次氯酸钠中浸510分钟，用无菌水冲洗数次后，供组织分离用。第64页，此课件共98页哦n在无菌条件下进行无菌操作，把

33、芽放在解剖镜下，用镊子、刀子、解剖针等工具，逐层把芽外面的幼叶和叶原基除去，使生长点露出，这时要细心，不要弄伤顶端圆锥体，用利刃切下含有12个叶原基的0.1-0.2mm长的生长点，然后接种到琼脂培养基上，切取生长点的大小，是培养能否取得成功的关键，原则是在生长点不带病毒的情况下，尽量取稍大些的生长点，这样易于培养成功。第65页，此课件共98页哦培养：n常用的培养基有White(1943)，Morel(1995)，MS培养基等等。n2，4-D，IAA，NAA等生长素是必须的，它们能有效地促进芽的生长发育，但是浓度并能太高，一般用0.1mg/l左右即可，高于1.0mg/L，往往产生畸变芽或形成愈伤

34、组织。n接种后的生长点，在培养基上生长很慢，再生植株往往需要几个月甚至一年以上。因此，注意满足其培养条件是十分重要的。生长点培养要求2427的温度，最好给以日夜温差，适当的光周期和光。由于培养时间长，应注意培养基保湿，一般可用防湿的铝箔或塑料薄膜包裹解决。第66页，此课件共98页哦茎尖经过适当培养后，可能发育的方向为：n 芽萌发；n 产生胚状体；n 产生不定器官；n 形成愈伤组织第67页，此课件共98页哦脱毒试管苗植物的移植嫁接扦插法 把试管苗剪下，先嫁接在砧(zhen)木上，然后再扦插成活，最后长成植株。移植法 当试管苗长到数厘米和形成较多的根系时，打开试管盖，放在室内窗口处炼苗23天。然后

35、小心取出苗，洗去根上的琼脂以免滋生细菌，再移栽至小花盆中。第68页，此课件共98页哦病毒植物的鉴定病毒植物的鉴定第69页，此课件共98页哦n（一）指示植物(indmatingplant)法n n利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法，就是枯斑和空斑的测定法。这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物，又称鉴别寄主。它只能鉴定靠汁液传染的病毒。n最早是美国的病毒学家Holmes 1929年发现的。他用感染TMV的昔通烟叶的粗汁液和少许金刚砂相混合，然后在烟叶子上摩擦23d后叶片止出现了局部坏死斑。在一定范围内，枯斑与侵染性病毒的浓度成正比。这种方法条件简单，操作方便，故一直沿用至

36、今，仍为一种经济而有效的鉴定方法。枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度，而只能测出病毒的相对感染力。第70页，此课件共98页哦n（二）抗血清(antisemm)鉴定法 用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种抗血清就是高度专一性的试剂，这种方法特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。第71页，此课件共98页哦n由于人的眼睛难以观察小于0.1mm的微粒，而借助于普通光学显微镜也只能看到小至200bm的微粒，所以只有通过电子显微镜才能分辨0.5m大小的病毒颗粒。这样采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形

37、状和结构，又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒。n（三）电子显微镜(elecmc microscope)检查法第72页，此课件共98页哦n酶联免疫法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。n（四）酶联免疫鉴定法第73页，此课件共98页哦第74页，此课件共98页哦n一、无病毒苗的保存繁殖 无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可

38、能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好地隔离与保存。n 无病毒植物的利用无病毒植物的利用第75页，此课件共98页哦n二、无病毒苗的利用 无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染。生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染。一旦感染，便会影响产量和质量的保证。因此，应重新采用无病毒苗，以保证生产的质量。第76页，此课件共98页哦n三、无病毒苗的效果 无病毒苗可以表现出明显的优良效果。如草莓可增产20%50%，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。菊花切花品种

39、的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，切花较重等特点。第77页，此课件共98页哦（一）（一）污染污染的原因及其预防措施的原因及其预防措施1 1、污染原因、污染原因 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。导致培养失败的现象。病原菌：细菌及真菌两大类。病原菌：细菌及真菌两大类。三、培养中常见问题三、培养中常见问题第78页，此课件共98页哦细菌污染特点细菌污染特点-菌斑呈黏液状，接种后菌斑呈黏液状，接种后1-21-2天发现。天发现。污染途径：污染途径：外植体带菌外植体带菌 培养基及器皿灭菌不彻底培养基及器皿灭菌

40、不彻底 操作人员未遵守操作规程操作人员未遵守操作规程 真菌污染的特点真菌污染的特点-污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后3-3-1010天发现。天发现。污染途径：污染途径：周围环境不清洁周围环境不清洁 超净工作台过滤装置失效超净工作台过滤装置失效 培养瓶的口径过大培养瓶的口径过大第79页，此课件共98页哦2 2、污染的预防措施、污染的预防措施防止材料带菌的措施防止材料带菌的措施-茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或暗培养。无糖营养液茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或暗培养。无糖营养液或自来水使枝条抽枝，以新抽嫩枝作外植体。或自来水使枝条抽枝，以新抽嫩枝作外植体

41、。-晴天取材，下午取材，经日晒过可杀死部分细菌或真菌。晴天取材，下午取材，经日晒过可杀死部分细菌或真菌。-接种时除去外部韧皮组织，只接内部的分生组织。接种时除去外部韧皮组织，只接内部的分生组织。第80页，此课件共98页哦（2 2）外植体的灭菌）外植体的灭菌 -多次灭菌法，次氯酸钠多次灭菌法，次氯酸钠-无菌水无菌水-次氯酸钠次氯酸钠-多种药液交替浸泡法，肥皂水多种药液交替浸泡法，肥皂水-酒精酒精-次氯酸钠次氯酸钠-无菌水。无菌水。第81页，此课件共98页哦器皿与金属器械的灭菌器皿与金属器械的灭菌 玻璃器皿可采用湿热灭菌或干热灭菌玻璃器皿可采用湿热灭菌或干热灭菌 金属器皿一般火焰灭菌，也可干热灭菌

42、金属器皿一般火焰灭菌，也可干热灭菌布质制品的灭菌布质制品的灭菌 湿热灭菌湿热灭菌无菌操作室的灭菌无菌操作室的灭菌 2%2%新捷尔灭或新捷尔灭或70%70%酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲醛酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。和高锰酸钾熏蒸。严格按照操作程序。严格按照操作程序。第82页，此课件共98页哦（二）外植体的（二）外植体的褐变褐变及其防止措施。及其防止措施。1 1、褐变的原因、褐变的原因 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死的使细胞内的酚类物质氧化成棕褐

43、色的醌类物质，这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。第83页，此课件共98页哦基因型基因型 某些植物酚类物质含量较多。某些植物酚类物质含量较多。外植体的生理状态外植体的生理状态 幼年的材料培养含醌类物质较少。幼年的材料培养含醌类物质较少。培养基的成分培养基的成分-过高的无机盐浓度过高的无机盐浓度-生长调节物质使用不当，生长调节物质使用不当，BABA过多过多-分生能力强的材料，氧化受抑制，褐变也被抑制分生能力强的材料，氧化受抑制，褐变也被

44、抑制-培养条件不适宜，温度过高或光照过强，褐变加速。培养条件不适宜，温度过高或光照过强，褐变加速。材料转移时间材料转移时间 时间过长引起材料褐变。时间过长引起材料褐变。第84页，此课件共98页哦2 2、褐变的防止措施、褐变的防止措施选择适宜的外植体及最佳培养基。选择适宜的外植体及最佳培养基。连续转移。连续转移。加抗氧化物。加抗氧化物。加活性炭。加活性炭。0.1-0.5%0.1-0.5%活性炭活性炭 第85页，此课件共98页哦（三）（三）玻璃化玻璃化现象及其预防措施现象及其预防措施1 1、玻璃化现象及其产生原因、玻璃化现象及其产生原因玻璃化是在细胞生长过程中的环境产生变化，试管苗为玻璃化是在细胞

45、生长过程中的环境产生变化，试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。主要原因是：了适应变化了的环境而呈玻璃状。主要原因是：激素浓度激素浓度 BABA浓度提高，导致玻璃化苗的产生。浓度提高，导致玻璃化苗的产生。琼脂浓度琼脂浓度 琼脂浓度低，玻璃化苗增加。琼脂浓度低，玻璃化苗增加。第86页，此课件共98页哦温度温度 低温易形成玻璃化苗。低温易形成玻璃化苗。光照时间光照时间 一般要求一般要求10-12h10-12h，大于，大于15h15h玻璃苗增加。玻璃苗增加。通风条件通风条件 培养瓶容量小，气体交换不良，玻璃化苗多。培养瓶容量小，气体交换不良，玻璃化苗多。离子水平离子水平 植物种类不同，离子形态比例量

46、要求不同。植物种类不同，离子形态比例量要求不同。第87页，此课件共98页哦2 2、预防措施、预防措施控制无机营养成分，降低氮（铵态氮）和氯。控制无机营养成分，降低氮（铵态氮）和氯。提高蔗糖和琼脂浓度提高蔗糖和琼脂浓度降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素比例。降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素比例。增加自然光照增加自然光照1000-1800lx1000-1800lx，控制光照时间，控制光照时间8-12h8-12h。适温生长，适温生长，热击处理防止玻璃化发生。热击处理防止玻璃化发生。使用透气性好的封口膜。使用透气性好的封口膜。培养基中加入间苯三酚、根皮苷或多效唑、矮壮素。培养基中加入间苯三酚

47、、根皮苷或多效唑、矮壮素。第88页，此课件共98页哦第五节第五节 试管苗的驯化移栽（后讲）试管苗的驯化移栽（后讲）一、试管苗的特点一、试管苗的特点1 1、试管苗的生态环境、试管苗的生态环境 组织培养出来的苗通称试管苗或组培苗。组织培养出来的苗通称试管苗或组培苗。试管苗长期生活在密闭容器中，形成其独特生态系统，与外试管苗长期生活在密闭容器中，形成其独特生态系统，与外界环境相比，有四大差异界环境相比，有四大差异第89页，此课件共98页哦高恒温高恒温 试管苗整个生长过程中采用的是恒温培养，温差很小。并且温试管苗整个生长过程中采用的是恒温培养，温差很小。并且温度一般控制在度一般控制在2525+22甚至

48、更高。甚至更高。外界环境条件温度不断变化，其调节由太阳辐射决定，温外界环境条件温度不断变化，其调节由太阳辐射决定，温差很大，而且一般不会达到差很大，而且一般不会达到2525+22。第90页，此课件共98页哦高湿高湿试管瓶内水分移动途径有两条：试管瓶内水分移动途径有两条：试管苗水分从气孔蒸腾试管苗水分从气孔蒸腾 培养基向外蒸发，凝结后又进入培养基培养基向外蒸发，凝结后又进入培养基 水分移动循环造成瓶内相对湿度接近水分移动循环造成瓶内相对湿度接近100%100%，远远大，远远大于瓶外空气湿度，故试管苗蒸腾小。于瓶外空气湿度，故试管苗蒸腾小。第91页，此课件共98页哦弱光弱光 试管瓶内光照一般比太阳

49、光弱，幼苗生长也较弱，不能试管瓶内光照一般比太阳光弱，幼苗生长也较弱，不能受太阳光直接照射。受太阳光直接照射。无菌无菌 试管苗所在环境无菌，与外界有菌环境不同，试管试管苗所在环境无菌，与外界有菌环境不同，试管苗也无菌，同时，培养瓶内气体环境较为特殊，与外界环苗也无菌，同时，培养瓶内气体环境较为特殊，与外界环境有很大差异。境有很大差异。第92页，此课件共98页哦2 2、试管苗特点、试管苗特点试管苗生长细弱、茎叶表面角质层不发达试管苗生长细弱、茎叶表面角质层不发达叶绿体的光合作用较差叶绿体的光合作用较差叶片气孔数目少，活性差叶片气孔数目少，活性差根的吸收功能差根的吸收功能差对逆境的适应性和抵抗能力

50、较差对逆境的适应性和抵抗能力较差第93页，此课件共98页哦二、试管苗的驯化二、试管苗的驯化1 1、驯化的目的、驯化的目的 提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合能力，提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合能力，使试管苗健壮，提高试管苗移栽成活率。使试管苗健壮，提高试管苗移栽成活率。2 2、驯化原则、驯化原则 调节温湿光和无菌等环境要素，开始和培养条件相似，后期调节温湿光和无菌等环境要素，开始和培养条件相似，后期与预计栽培条件相似。与预计栽培条件相似。第94页，此课件共98页哦3 3、驯化方法、驯化方法 将长有完整试管苗的培养瓶由培养室转到半遮荫的自然光下锻将长有完整试管苗的培养瓶由培养