重组腺相关病毒-胸苷激酶-核糖体插入位点-内皮抑素双靶点基因治疗裸鼠膀胱癌的实验研究.pdf

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1、262 主堡塑基签型盘查!生!旦箜i!堂箜!塑曼堕!望翌!垒E型!y!：!型!重组腺相关病毒一胸苷激酶一核糖体插入位点一内皮抑素双靶点基因治疗裸鼠膀胱癌的实验研究潘建刚 周兴 韩瑞发【摘要】 目的 探讨重组腺相关病毒(rAAV)一胸苷激酶(TK)一核糖体插入位点(IRES)一内皮抑素(ES)(简称rAAVTIE)双靶点基因治疗膀胱癌的动物实验效果。 方法 膀胱癌T24细胞悬液接种于27只Balbc裸鼠存侧肩胛区皮下，观察成瘤情况；取已成瘤裸鼠25只，随机分为对照组、rAAV一多克隆位点(MCS)组、rAAv_TK组、rAAv-ES组、rAAVTIE组。每组5只，瘤内分别注射生理盐水、rAAv，

2、MCS、rAAvTK、rAAvES、rAAVTIE，4周后颈椎脱臼处死裸鼠，取出移植瘤，HE染色、计算微血管密度(MVD)；采集裸鼠lL液标本，双夹心酶联免疫吸附试验检测I|iL清中ES浓度。结果T24细胞接种3周后，接种部位肿瘤形成25只，成瘤率93；瘤内注射rAAV-ES、rAAVTK、rAAVTIE 9 d后，肿瘤生长明显抑制。治疗4周后rAAVES、rAA、，-TK、rAAVTIE、rAAV-MCS和对照组肿瘤体积分别为(075士008)、(071士011)、(O52士009)、(127土013)、(124=t=017)cm3；rAAVES组与rAAVTK组间比较差异尤统计学意义。其余

3、组间比较差异均有统计学意义(P值均005)，其余组问比较差异均有统计学意义(P值均O05)。病理观察结果显示rAAVES、rAAVTK、rAAVTIE组裸鼠移植瘤组织中出现大片坏死，癌巢多呈岛状分布，以rAAv-TIE组明显，肿瘤细胞核大，异型性明显；对照组组织坏死较少，癌细胞分布均匀。rAAVES、rAAVTK、rAAVTIE、rAAVMCS、对照组裸鼠移植瘤MVD分别为(1872253)、(2174462)、(1273士178)、(5238646)和(4994717)个HP，治疗组显著低于对万方数据竺塑丛丛型苤查!塑!至!旦箜!鲞箜!塑坠堕!望塑!：垒塑!：!型!：!照组和空病毒组(P00

4、5)，rAAVTlE组较rAAVES组和rAAV-TK组显著降低，组间差异有统计学意义(P005)。rAAVES、rAAVTIE组荷瘤裸鼠m清中ES浓度分别为(3852-t-653)、(4033748)t卫gI。，rAAVTK、rAAVMCS和空白对照组未检测出ES表达。荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾组织病理检查未见异常。讨 论目前困扰肿瘤基因治疗应用进程和疗效的关键问题足：载体选择：选择高表达、低免疫原性、无捕人致畸及生物安伞性好的载体是基因治疗的核心技术；基冈选择：肿瘤的发生、发展是一个多基冈、多通道调控过程，针对单一靶点调控肿瘤细胞分化、加速凋亡过程的荜凶治疗其抗肿瘤作用有限。2。自杀基囚疗

5、法又称为药物敏感基因疗法，由于人体细胞中缺乏催化前体药物的酶系统，前体药物只有在被感染的细胞中被激活，只对自杀基冈阳性细胞起诱导凋亡作用，而不损害萨常细胞。肿瘤细胞转入自杀基因后，前体药物对患者治疗所产生的毒性将被限定在转化细胞或其微环境中，而不产生显著的系统毒性，基于这一优点，自杀基凶治疗仍然是肿瘤基因治疗的热点之一。膀胱癌为血管生成依赖性肿瘤，新生【fL管易造成瘤细胞逸入血管形成血行转移。抑制肿瘤血管生成足近年治疗膀胱癌的新热点。ES是目前已知作用最强的肿瘤l饥管乍成抑制剂，能够有效减缓肿瘤的生长速度，且不良反应极少L3j。AAV载体具有安伞性好、无致病性、免疫原性低、物理性质稳定、感染细

6、胞谱广，可介导外源基因长期稳定表达等优点，被视为最有前途的基因治疗载体之一，成为目前基因治疗载体研究的重点。目前，影响膀胱癌基冈治疗的难题是：缺乏用于体内高效、安全的靶向治疗基囚载体；单基凶靶点治疗的抗肿瘤作用有限；融合基因治疗可能导致另一基因的抗肿瘤作Jj减弱甚至失活，在一定程度上影响基因治疗效果的真实性与可靠性。我们采用牛物安全性商、低免疫原性的rAAV载体构建抗肿瘤血管生成作用最强的ES基因和自杀基因作融合重组新璎凡W载体并加入信哆肽，利用W对膀胱痛细胞的高度亲和力，促使感染后膀胱癌细胞持续表达并分泌ES，血管生成抑制使肿瘤在缺血状态下对前药及自杀基凶的敏感性增强，协同双靶点治疗膀胱癌，

7、以期建立高效、靶向、低毒副作用、协同作用强的双靶点基因输送及表达系统J。本研究结果证实：rAAVES、rAAVTIE病毒转染肿瘤细胞后可以同等分泌ES；rAAVTIE双靶点治疗组抑制移植瘤的效果明显优于单靶点治疗组；rAAVTIE双靶点治疗组MVD较rAAVES组和rAAVTK组最著降低。证实双靶点基因治疗效果明显优于单靶点基囚治疗。本研究巾肿瘤体积未能缩小呵能有以下原冈：ES的抑瘤作用呈剂量依赖关系，rAAV转染肿瘤细胞后，早期ES浓度处于低水平，以后逐渐升高。这种滞后现象可能是由于AAV荩凶组由单链变为双链的过程延迟-r目的基因的表达。也有实验证实ES主要作用于有增殖栉睾力的血管内皮细胞，

8、可能在肿瘤进展阶段发挥最有效作用L53；腹腔注射GCV后并不能很快在肿瘤内达到治疗浓度，存在药物的首关效应。Faneca等例认为，GCV浓度在不足以很快杀死细胞时，细胞体积先增大、变扁平，然后才开始皱缩变圆，细胞变大可能与肿瘤体积增大有关。本研究结果表明，ES和自杀基因可以明显抑制肿瘤生长，双靶点联合ES和自杀基冈联合基因治疗膀胱癌的效果明显优于单靶点基因治疗，本研究结果为肿瘤基因治疗提供r新的实验方向与思路。参 考文 献13 Xiaojun H。Michael KK，Wong QZ，et a1Soluble recombinant endostatin purified from Esche

9、richiacoli：Antiangiogenicactivity and antitumor effectCancer Res。2001，15：4784812Eder JP Jr，Supko JGSClark JW，et a1Phase l dinical trial of”combinant human endostatin administered as a short intravenous infusion repeated dailyJ Clin Onc012002，20：3772378433卢炳新，韩瑞发，汤洋重组分泌型内皮抑素腺相关病毒的包装及在膀胱癌EJ细胞系巾的表达天津医科

10、大学学报，2006，12：24294Robe PA，NguyenKhac MT，Lambert F，et a1Sulfasalazineunveils a contactindependent HSV一FKganciclovir gene theraPy bystander effect in malignant gliomasInt J Oncol，2007，30：28329053 t亮陈昭颌。杨前哨，等蕈组内皮抑素与BB-94及阿霉素治疗小鼠膀胱癌种植瘤的协同作用巾华泌尿外科杂志，2003，24：6476496Faneca H，Faustino A，Pedroso de Lima MCSynergistic antitumoral effect of vinhlastine and HSV-TkGCV gene therapymediated by albuminassociated cationic liposomesJ ControlRelease2008。126：175184(收稿rI期：20080407)(本文编辑：孙忠民)万方数据