超声微泡介导基因治疗妇科肿瘤的应用研究.pdf

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1、3988 塞旦匡堂盘查!Q!i生箜!鲞筮丝塑超声微泡介导基因治疗妇科肿瘤的应用研究于姣姣赵云 胡兵近年来妇科肿瘤在女性疾病中的发病率呈上升趋势，并对女性的健康和生命存在着严重威胁。超声诊断妇科肿瘤已广泛应用。随着超声技术及分子生物学的飞速发展，超声微泡作为一种新型非病毒载体介导基因治疗妇科肿瘤，克服了病毒载体存在的安全性低、靶向性差、免疫原性高等缺陷，已逐渐成为国内外学者研究的热点，也有望在临床上给妇科肿瘤患者提供更安全有效的治疗方法。本文对超声微泡介导基因治疗相关机制及其在妇科肿瘤中的应用研究进行综述。1超声微泡造影剂超声微泡造影剂是由外膜和其包裹的气体所构成。大多数外膜是脂类、蛋白类、非离

2、子表面活性剂类、高分子材料等它们形成的外膜不仅可以防止微泡内气体向外逸出，还可以阻止微泡间相互融合。微泡包裹的气体目前常用氟碳气体不仅能提高微泡在体内循环中的稳定性，而且可从肺部排出消除了体内残留的隐患。微泡在超声的作用下被激发。产生较强的回波反射性能，从而增强组织回声，提高组织显影的清晰度：另外，微泡作为基因治疗的载体，可减小对周围正常组织的损伤，并增强基因治疗效果。2超声微泡介导基因转染的作用机制理想的超声微泡造影剂经外周静脉注射后，在循环系统中应无毒副作用能保持良好的回声特性载基因微泡可在超声作用下使微泡或破坏微泡后释放的基因进入血管壁甚至组织间隙。相比于其它栽体。微泡的优势在于基因的转

3、染与表达只出现在超声辐照的特定部位。而不会出现在非靶向区域的细胞和组织中。肿瘤基因治疗成功的关键，是导入的外源基因能够在特定的组织和细胞中，进行有效的转染和表达而细胞膜的通透性改变是基因有效转染的前提。微泡作为一种空化核，在一定频率的超声辐照下，发生震荡、收缩、膨胀、乃至破裂，其产生的空化效应和机械效应均可使细胞膜的通透性增强，尤以空化效应为主。空化效应分为两种：(1)稳态空化：在低强度超声作用下，微泡做稳定、周期性震荡，引发较小的辐射压和微射流，对周围组织产生一定的生物学效应。(2)瞬态空化：在高强度超声场下产生一种更为强烈的生物学效应。当超声波能量达到瞬态空化阈值时。微泡破裂，产生高速微射

4、流、高能冲击波和巨大切应力使细胞膜通透性增强，内皮细胞间隙增大及微血管破裂，从而使基因进入细胞，增强基因的转染与表达，引起肿瘤细胞的凋亡坏死。有学者21研doi：103969jissn1006-5725201524003作者单位：443002三峡大学医学院(于姣姣，赵云)；443001三峡大学第_-tt缶床医学院超声科(胡兵)通信作者：赵云Email：zhaoyunctgueducn究表明瞬时空化在增加细胞膜通透性和提高基因有效转染率中起主要作用。伴随产生的微射流、冲击波、巨大切应力等强烈生物学效应，将靶组织的细胞壁和质膜击穿，形成可逆或不可逆的小孔外源基因因此而被捕获的现象称为声孔效应。这种

5、声孔效应是外源基因突破细胞膜屏障进入细胞内的重要环节也是基因治疗中基因成功转染的重要原因。除上述机制以外，也有学者3在文献中报道，经超声辐照后外源基因表达增高的同时细胞损伤修复的相关基因表达也显著增高。由此可见细胞损伤修复的相关基因表达，也可能是超声增强外源基因表达的机制之一。另外，类似于机械损伤后膜的修复动力学及囊泡的胞吐作用，细胞膜损伤后通过重新密封，而成为基因输送的途径，并能减少副作用提高转染效率。Meijering等5在实验中提到超声辐照微泡破裂可诱导形成过氧化氢邻近细胞膜大量Caz+内流，Ca2+活化的K+通道开放，造成局部细胞膜电位的超极化该机制与大分子物质通过内吞和胞饮作用进入细

6、胞内具有相关性，可诱导外源基因进入胞内进行转染和表达。3超声微泡介导基因靶向治疗的机制随着人类基因组学及现代分子生物学的发展基因治疗即将目的基因导入靶组织或靶细胞并进行表达以治疗因基因异常或缺陷所引起的疾病，也是现代医学发展的重大趋势。载体的选择和基因的靶向传递是实现有效基因治疗的重要前提。目前常用的病毒载体虽然转染率高，但其在体内的安全性问题一直备受争议，而裸质粒等非病毒栽体又存在靶向性差，转染率低等诸多问题6。因此，选择高效、安全、实用的载体尤为重要。由超声微泡介导基因靶向治疗不仅能减少全身副作用及对组织的损伤，还能增强基因的转染和表达，表现出良好的靶向性。超声微泡介导基因靶向治疗中，微泡

7、与基因的结合方法十分重要。目前常用方法有两种：一种是通过静电相互作用，基因非共价结合至微泡表面，但其结合的特异性较配体一受体系统差：另一种则是将基因包裹在微泡内部，可避免周围核酸酶的降解及肝脏清道夫受体排除，提高基因的有效率。超声微泡的靶向性是基因靶向传递的重要前提而使超声微泡具有靶向性的方法具有以下几种，：(1)利用微泡外壳材料本身的生物学特性和表面电荷的分布使微泡停留于病变部位：(2)利用分子桥作用使微泡与疾病相关单克隆抗体结合，从而找到病变部位表达的相关抗原并与之结合，来实现微泡的靶向性；(3)对微泡表面进行修饰，耦连上特异性的配体或抗体，在体内通过配体一受体、抗体一抗原选择性的结合达到

8、微泡靶向治疗的目的。带有正电荷的微泡外壳如蛋白质或阳离子脂质体，利用静电吸附作用将带负电的质粒DNA，结合至微泡表面，微泡作为基因的载体可携带基因进入靶细胞或靶组织中进行表达。万方数据塞用医堂盘查!Q!生筮!鲞筮丝塑然而这种微泡携带基因的量十分有限，而且特异性较差。转染率较低，难以满足对疾病的治疗。为克服这些问题实现更好的靶向传输有学者利用高分子材料为外壳制备了纳米微泡并将单克隆抗人类白细胞抗原G(humanleucocyte antigenG，HLLG)的抗体连接于微泡表面。可与绒毛膜癌特异性表达的HLAG靶向结合从而显著改善了高强度聚焦超声消融的效率。Li9等人将肽链环精氨酸一甘氨酸一天冬

9、氨酸作为配体连接于微泡表面其可识别肿瘤细胞高表达的整合素ave3这一靶向位点，并与之结合，从而提高了微泡的靶向性和基因转染的有效性，取得了较好的效果。在制备微泡的过程中通过对微泡的修饰，提高微泡特异性识别及结合的能力在超声辐照下。到达靶向作用位点，实现基因的有效转染。同时还能减少对邻近正常组织的损伤将成为肿瘤基因治疗成功的关键因素。目前，在临床应用方面，微泡和超声设备的相关特性参数，还有待进一步优化4超声微泡介导基因治疗妇科肿瘤的研究基因治疗作为当今医学发展的新趋势【10，在妇科肿瘤的基因治疗方面奠定了基础，靶向超声微泡的应用使超声微泡介导基因治疗妇科肿瘤成为众多学者研究的热点。目前常用的超声

10、微泡介导妇科肿瘤基因治疗的方法有以下几种。41基因沉默疗法RNA干扰是近年来新发展的一种基因沉默的方法该方法是指在生物体内，利用与靶基因同源的双链小干扰RNA诱导靶基因mRNA发生降解从而引起特异性基因沉默。由于小干扰RNA只降解与靶基因同源的mRNA，对其他基因mRNA的表达无影响。因此RNA干扰具有高度特异性。He1l 3等利用微泡携带MDRl(multiple drug resistance，MDR)基因特异性小干扰RNA的真核表达质粒，在超声作用下，靶向转染卵黄囊癌L2细胞通过MDRI基因的沉默。导致P一糖蛋白活性的降低而P一糖蛋白阻止化疗药物进入肿瘤细胞这一作用也将受到抑制。Chen

11、I”1等在实验中构建了靶向Survivin基因短发夹状RNA表达质粒，并以微泡作为载体，在超声辐照下，转染宫颈癌HeLa细胞，结果显示超声微泡增强基因的转染效率，其介导RNA干扰有效沉默Survivin基因的表达并引起肿瘤细胞凋亡。超声微泡与RNA干扰技术的联合也将为妇科肿瘤的治疗与研究提供一种更高效安全的方法。42 自杀基因疗法 自杀基因疗法也称为病毒导向酶解药物前体疗法，即利用基因工程技术，将某些病毒或细菌的基因作为目的基因与载体结合并导入肿瘤细胞中进行表达，使低毒或无毒的药物前体代谢为细胞的毒性药物以达到选择性杀死肿瘤细胞的目的。朱元方m等在实验中制备了载Fcy：Fur自杀基因的微泡，在

12、超声定位辐照下对裸鼠卵巢癌皮下移植瘤表现出较好的抑瘤效果并可见大量的凋亡细胞。也有不少学者。51在自杀基因的实验研究中发现“旁观者效应”是自杀基因疗法中的重要特征之一即转染自杀基因的肿瘤细胞与未转染的肿瘤细胞混合培养，转染的肿瘤细胞发生凋亡坏死，由于两者的相互接触，邻近未转染的肿瘤细胞也出现大量死亡。因此，提高了自杀基因疗法对肿瘤细胞的杀伤效应超声微泡作为自杀3989基因的载体其良好的靶向性也将成为治疗妇科肿瘤的优势。43基因替代疗法抑癌基因是存在于正常细胞内的一类基因群在被激活的情况下，他们具有抑制细胞增殖、转化及肿瘤发生的作用。而基因替代疗法就是在载体体内导入正常细胞的抑癌基因。以代替缺失

13、或异常的抑癌基因转染肿瘤细胞并达到抑制及杀伤肿瘤细胞的目的。Changt”等采用生物素链霉亲和素法，制备了促黄体生成素释放激素类似物的靶向微泡。作为介导外源性野生型p53抑癌基因的载体联合超声，能与卵巢癌A2780DDP细胞表达的促黄体生成素释放激素受体特异性结合，大大增强了p53基因靶向转染的能力使卵巢癌A2780DDP细胞在Gl期被阻滞抑制了肿瘤细胞的生长，并诱导其凋亡。在此实验中超声微泡成功地介导了抑癌基因的转染，达到了基因替代治疗的目的可能作为今后学者攻克妇科肿瘤的重要手段之一。44抗肿瘤新生血管形成疗法新生血管的形成，在肿瘤的生长和转移中起着主导作用而许多细胞因子的表达能够促进肿瘤新

14、生血管的形成，其中以血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factorVEGF)的作用最重要。抗肿瘤新生血管形成疗法，即通过阻断、抑制新生血管的形成达到抑制肿瘤细胞增殖和治疗肿瘤的目的。VEGF在肿瘤细胞中的高表达也将作为抗肿瘤新生血管形成疗法的重要靶点。Florinas17等实验显示，通过超声微泡介导针对VEGF受体的小干扰RNA转染患卵巢癌的裸鼠后发现VEGF受体的表达减少肿瘤血管生成和生长速度受到明显抑制。超声微泡靶向VEGF受体，在抗肿瘤新生血管形成疗法中具有重要意义，有待进一步研究以应用于临床。45 反义基因疗法反义基因疗法是利用反义核酸与靶基

15、因通过碱基互补原则使其参与基因的表达调控从而对特定的靶基因起到抑制或封闭的作用。傅艺冰181等构建了靶向VEGFA基因的2一甲氧乙基修饰的反义寡聚核苷酸并在细胞水平上证实其对卵巢癌细胞靶基因表达的抑制作用。随后进一步实验。将卵巢癌细胞种植于裸鼠皮下，利用超声微泡代替脂质体作为载体，介导该反义核酸对皮下种植瘤细胞的转染发现皮下种植瘤体积明显缩小成功抑制了卵巢癌的恶性生长。由微泡携带基因进入靶细胞内，既减少了对正常组织和细胞的损伤又能稳定释放所携带的基因，增强了反义基因疗法的有效性。46免疫基因疗法免疫基因疗法是指应用基因重组技术，将细胞因子、共刺激分子、主要组织相容性复合物、病毒抗原及肿瘤抗原等

16、外源性基因导入特定的组织和细胞以增强机体抗肿瘤的免疫功能，达到对肿瘤治疗的目的其中免疫活性细胞的免疫监督作用和杀伤活性作用尤为重要。有文献报道m。，IL一12是目前发现在诱导和调节免疫活性细胞中，作用最强、最广泛的细胞因子能促进T细胞、NK细胞的分化和增殖，并产生IFN一y，具有强大的抗肿瘤效应。日本学者Suzukil21等制备了脂质微泡携带IL12基因，注射于皮下种植卵巢癌的小鼠体内。给予超声辐照结果显示其基因转染效率明显高于脂质体。IL12基因的表达增强了机体抗肿瘤的免疫功能抑制了肿瘤的生长。近年来，利用微泡在超声作用下将基因输送到细胞已经在肿瘤免疫治疗中显示出一定的潜力圳。万方数据399

17、05问题与展望目前临床上治疗妇科肿瘤的方法仍以手术、放疗、化疗等为主，但这些方法都存在各自的局限性。手术切除主要用于妇科肿瘤的早期治疗，复发率高，放、化疗所致全身毒副作用大。因此寻求高效、安全、可重复使用的治疗方法尤为重要。研究表明m-m。超声微泡是一种极具应用前景的基因载体。超声微泡介导基因治疗妇科肿瘤的安全性、稳定性、可塑性、有效性等特点已在国内外众学者的实验中得到肯定，但其真正进入临床使用仍存在诸多挑战。如微泡载基因量低，达不到临床治疗所需剂量提高微泡载基因量是治疗中首待解决的问题：对微泡表面进行修饰连接配体或抗体的技术尚不成熟增强基因转染的靶向性还需进一步完善；微泡浓度及超声辐照相关参

18、数的选择对基因的转染具有一定的影响，如何使临床治疗效果达到最佳，还需进一步优化：针对不同妇科肿瘤选择合适的基因治疗方法也将大大提高疗效。尽管面对临床应用还存在很多问题，但已取得的研究成果充分显示了其潜在的优势，随着以上问题的攻克超声微泡介导基因治疗妇科肿瘤也将得到突破性的进展，发挥其临床应用价值。6参考文献2345678910PikeOverzet K， Baum C， Bredius RGSuccessful RAGl一SCID gene therapy depends on the level of RAGl expressionJJ Allergy Clin Immunol，2014，1

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