鼻咽癌基因治疗研究的新进展.pdf

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1、鲤剖皇监压!Q!生!月箜!鲞筮!翅垒!鲤坐z些!堡!世塑：些：!Q!：y尘：!丛!：1 271鼻咽癌基因治疗研究的新进展张佩方马士签作者单位：233004安徽蚌埠，蚌埠医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科作者简介：张佩方(1982一)，男，住院医师，医学硕士生，研究方向：头颈部肿瘤通信作者：马士崔，Email：mhiyinentsinacom【摘要】 目的：总结鼻咽癌基因治疗研究进展，为临床治疗及基础研究提供参考。方法：在万方、中国知网、pubmed数据库检索近年关于鼻咽癌基因治疗的研究资料，并进行综合分析。结果：鼻咽癌基因治疗在基础研究方面取得满意的效果，在临床应用中副作用少、医从性好。具体方

2、法有免疫基因治疗，自杀基因治疗，基因替代治疗，基因沉默治疗和反义基因治疗。结论：基因治疗将成为鼻咽癌治疗的重要手段。【关键词】 鼻咽癌；免疫基因治疗；自杀基因治疗；基因替代治疗；基因沉默治疗；反义基因治疗doi： 103969jissn16717163201203030【中图分类号】 R73963 【文献标识码】 A 【文章编号】 167l-7163(2013)03旬271旬3RI蔓煳鹏h Pmg啷s蚰N踟pharyll嚣al Cardnom G蚰e Thempyz础G_ni一知ng，|)l似册一一nDepanment of OtolaryngologyHead粕d Neck Surgery，

3、the First AmliatedHospital，Bengbu Medical College，Beng Bu，Anhui 233004，China【Abst髓ct】 Objec6ve：To provide references for tIle clinical therapeutics and basic research，NPc genetherapy research was reViewed in the paperMethods：To summarize the relative literatures related to NPC genetherapy in recent

4、years in Wang，CNKI a11d PubMed datab鹊eResults：NPC gene ther印y h踮been achievedsatisf如tory results in basic research讪th fewer adverse reactions，good patientscompli粕ce in tIle clinical印-plicationThere were gene immunothempy，suicide gene ther印y，gene replacement therapy，gene silencing andantisense gene t

5、herapyG啪cIusio璐：Gene thempy埘ll become鲫imponallt treatment on NPC【Key words】 Nasopharyngeal carcinoma；(毛ne immunothempy；suicide gene thempy；(kne replacement therapy；Gene silencing；Antisense gene therapy鼻咽癌是最常见的头颈部恶性肿瘤，目前采用以放疗为主的综合治疗。占鼻咽癌病人70左右的晚期患者，其5年生存率仅为10一40。近年来，同步放、化疗策略虽能在一定程度上提高生存率；但所伴随的放、化疗副反应

6、仍严重影响着患者的生存质量。因此，探索和寻求鼻咽癌治疗的新方法成为研究的热点。基因治疗技术是随着DNA重组技术的成熟而迅速发展起来的，它是当代医学和生物学的一个新的研究领域，通常是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。基因治疗为包括鼻咽癌在内的许多疾病提供了新的治疗方式。本文将从免疫基因疗法、自杀基因疗法、基因替代疗法、基因沉默疗法和反义基因疗法等几个方面对鼻咽癌基因治疗的最新研究进展做一综述。l免疫基因治疗免疫基因治疗包括细胞因子诱导的杀伤细胞治疗、树突状细胞瘤苗、GVAx瘤苗等，都是依靠增强机体免疫效应细胞功能、调节增强组织相容性复合物抗原识别

7、能力，以达到抑制、杀伤瘤细胞为目的的治疗方式。已证实IL一2、IL一12、INF在肿瘤治疗中的效果最为明显。重组IL一2蛋白在血清中半衰期较短，全身给药时需要重复高剂量注射，易引起严重的副作用。研究者多选择腺病毒介导IL一2基因治疗，并显现出明显的抗肿瘤疗效。saito等研究发现，IL一2可高水平募集巨噬细胞和迁移树突状细胞，增强细胞毒性T淋巴细胞活性，增强抗肿瘤免疫，增加癌细胞凋亡率。IL一12是一种炎症和抗血管生成的细胞因子，可通过抑制血管生成而抑制肿瘤活性。朱欠元等旧。发现，IL一12基因治疗的裸鼠鼻咽癌模型瘤体质量及微血管密度明显低于对照组，瘤组织中观察有大量的细胞坏死灶和液化区，及炎

8、性细胞浸润。有研究H o认为，IL一12基因及其表达减少在鼻咽癌的发生发展中可能发挥重要作用。干扰素具有抑制细胞增生、促进细胞凋亡、抑制癌基因表达、调节免疫、抗肿瘤血管生成、抑制肿瘤转移和诱导肿瘤细胞的分化等作用；包括IFN一0【、IFNB、IFN一1，以前者对鼻咽癌有效率最高。“u等H1研究发现，hIFNd1可诱导鼻咽癌细胞G1期细胞周期阻滞，增加抑癌基因pRb和p16的表达，诱导癌基因CcNDl和CDK6表达下调；减少微血管密度，抑制移植瘤生长和转移，增加瘤细胞凋亡和坏死，延长裸鼠存活率。免疫基因疗法的作用机制非常复杂的，有多种免疫细万方数据272 鲤剖皇监座垫!生!旦筮!鲞箜!翅垒!型!

9、坐Y塑4垦!i!堕：塑：!：!：!盟!：!胞、炎性细胞和多种继发诱生的细胞因子参与。单方面的治疗效果往往不佳，现多倾向于多基因联合治疗及联合其他治疗方式策略的研究。张政等1在常规放化疗中联合IL一2治疗中晚期鼻咽癌患者，发现5年生存率明显高于常规放化疗者。2自杀基因治疗自杀基因治疗是一种瘤内化疗，原理是采用基因转染技术，将外源性自杀基因导入肿瘤细胞内，该基因表达的酶可将无毒的药物前体转化为具有肿瘤细胞毒性的药物，从而影响肿瘤细胞的代谢，引起肿瘤细胞的死亡。目前研究较多的有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSVtk)丙氧鸟苷(GcV)系统、胞嘧啶脱氨基酶5一氟尿嘧啶(CD5一Fc)系统及yC-D91y

10、TK基因。HsVtk能使无毒的GcV转化为具有细胞毒性的戊环鸟苷磷酸盐，其通过直接作用或旁观者效应杀伤肿瘤细胞，被杀伤的肿瘤细胞经抗原提呈，诱导肿瘤特异性免疫，从而进一步抑制及消灭肿瘤。有研究者通过腺病毒介导将HSVtk基因转染鼻咽癌HNE一1细胞，发现细胞生长抑制呈现GcV剂量依赖性，杀伤作用中也表现出共培养野生型细胞的旁观者效应旧o。cD5一Fc系统中以酵母菌胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶磷酸核糖转移酶5一氟胞嘧啶(yCDuPRT5一Fc)融合自杀基因系统治疗肿瘤效果最好。cD基因的产物胞嘧啶脱氨酶将5一Fc转化为有毒的5一Fu，随后形成5一氟脲苷酸(5一FuTP)或5一磷酸一5氟一2一脱氧尿嘧啶(5

11、一FduTP)，前者可以整合到RNA，干扰RNA合成；后者抑制腺苷酸合成酶，干扰DNA的合成，导致细胞死亡。UPRT基因的产物能直接将5一Fu转化为5一FuMP，然后转化为5一FduMP和5一FuTP，从而减少了多种竞争酶对5一Fu的降解。以上研究拓展了鼻咽癌治疗，使鼻咽癌的基因治疗研究更加深入，但是肿瘤的发生是复杂的多因素、多步骤、涉及多基因事件发生的过程，针对单一环节的治疗常常不能得到满意疗效。目前更倾向于构建多基因共同表达载体和或联合多种治疗方式策略方面的研究。有研究发现，在hTERT启动子及cMV增强子的联合调控下，TK基因杀伤系统在体内外对鼻咽癌细胞杀伤作用较单TK基因组更加明显，而

12、且对裸鼠无明显毒副作用7 o。基因一放射治疗是weichsellbaum提出治疗恶性肿瘤的新思路：将可经放射线诱导表达并对肿瘤具有杀伤作用的基因转入肿瘤细胞，然后对肿瘤实施局部放疗，诱导基因表达，通过射线和基因的联合作用杀伤肿瘤细胞。放射治疗既作为调控自杀基因肿瘤靶向表达的手段，同时本身又发挥抗肿瘤作用，达到将放射治疗与肿瘤瘤内化疗有机结合起来的目的。启动子Egr一1基因在放射线照射下能强烈诱导下游治疗基因表达旧J。因此，放疗和自杀基因结合治疗策略中，Egr一1启动子可以有效地调节针对肿瘤内的各种肿瘤敏感基因的表达。姜武忠等91发现，pcDNA31一EgrcD阳性的鼻咽癌cNE一2细胞单独经5

13、一Fc处理，24 h后5一Fu的浓度是5111ll，放射处理后，增加到90斗IIll；瘤细胞死亡率也明显提高。邱前辉等叫构建pAdKDRtkGcV自杀基因系统联合_y射线在治疗鼻咽癌裸鼠模型研究中，也发现联合治疗抑瘤率明显高于单纯基因组、单纯放疗组。3基因替代治疗基因替代治疗就是利用载体将缺失的抑癌基因转染肿瘤细胞，以达到杀伤肿瘤细胞的目的。目前临床上应用的仅有p53基因治疗药物“今又生”。p53也是迄今被发现的与包括鼻咽癌在内的肿瘤发生发展关系最为密切的抑癌基因，具有阻滞细胞周期、促进细胞调亡、维持基因组稳定、抑制肿瘤血管生成等功能；另外，p53还可以显著增加肿瘤对化疗、放疗等传统治疗方法的

14、敏感性。Pan等对鼻咽部肿瘤内注射“今又生”8周，联合放疗，发现联合治疗组cR率提高273倍；5年随访也显示联合组在局部复发率、转移率及总生存率等指标上明显优于单纯放疗组。p16基因是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的主要抑制因子，能特异性地抑制cDK4，使Rb蛋白保持去磷酸化，进而使细胞阻滞于G1期，一旦p16失活，细胞G1期缩短，细胞提前进入s期，生长加速，最终导致癌症的发生。有学者认为其在抑癌方面的重要性超过p53和Rb基因1引。大量研究证实鼻咽癌患者存在p16基因的缺失，突变和甲基化。p16蛋白缺失率也达40一82。鼻咽癌的发生与p16蛋白表达缺失和p16基因变异关系密切。p16抑癌基

15、因的缺失可能是导致放射抵抗和放化疗高失败率的原因3|。目前，也有学者在研究应用p16基因进行基因治疗。4反义基因治疗反义基因疗法是通过碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，从而调节细胞的生长、分化等。用于抑制基因表达的反义技术包括3类：小干扰RNA(siRNA)技术；反义寡核苷酸(AsONs)技术，包括反义寡脱核苷酸(As0DNs)技术和反义RNA技术；具有催化活性的核酶(RZ)和DNA酶(DNAzymes)。目前多数研究通过反义核酸技术抑制凋亡抑制基因和向癌细胞导入凋亡活化基因两种形式促癌细胞凋亡。wu等41运用核仁素反义寡核苷酸转染鼻咽癌Tw

16、01细胞，敲除核仁素基因的表达，发现其能明显诱导鼻咽癌细胞凋亡；治疗偈r01裸鼠模型时，移植瘤生长明显受到抑制，而裸鼠未出现明显的毒副作用。DNA依赖性蛋白激酶(DNAPK)是一种DNA断裂修复蛋白，由催化亚基(DNAPKcs)和人自身免疫抗原Ku组成，可以修复细胞的DNA双链断裂损伤。蒋昌斌等1 5。将DNAPKcs反义寡核苷酸转染鼻咽癌cNEl细胞株，联合辐射处理，发现其可在不依赖细胞的p53功能状态下逆转cNEl的辐射抗性，增加辐射敏感性，提高抑制率。5基因沉默治疗基因沉默(gene silencing)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达或者是表达减少的现象，包括发生在由于DNA甲基

17、化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默和转录后基因沉默。RNA干扰(RNAi)是一种转录后基因调控方法，也是一种新发现的通过dsRNA介导的特异同源靶基因途径。RNAi在转录水平、转录后水平和翻译水平发生特异效应，分别由3个效应RNA分子介导：shRNA、siRNA、microRNA(miRNA)。RNAi用于包括鼻咽癌在万方数据蟹型皇!逝压!Q!至!旦笠!鲞筮!塑垒!里Y!型鱼!丛塑：塑：!：!尘：!：!内的肿瘤基因治疗主要表现在以下几个方面。51封闭癌基因利用基因家族中多个基因具有同一段同源性很高的保守序列这一特性，针对这一区段序列设计相应的siRNA，可以特异性地封闭这些

18、基因的转录产物而不影响其他基因的表达。EB病毒潜伏蛋白1(1atent membrane pmteins，LMP1)是鼻咽癌重要的癌基因和促转移因子。刘雄等6川构建针对鼻咽癌EB病毒LMPl的特异性shRNA干扰序列的重组腺相关病毒载体(rAAVshRNALMP一1)在体外发现通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP一1基因表达，也可在动物水平抑制鼻咽癌转移。52抑制突变的抑癌基因Ras基因是一种膜相关的G结合蛋白类癌基因，经点突变后细胞内的信号持续传导，能促使细胞在不受生长因子的约束下自我繁殖和生长。Ras早已被确立为为人鼻咽癌的癌基因之一。左强等。1驯用RNA干扰技术抑制突变型的Hras

19、基因表达的研究中得到充分证明。53干扰细胞周期及凋亡相关基因针对细胞凋亡过程的失调导致肿瘤发生的理论，利用RNAi促进细胞凋亡可以用于肿瘤的治疗。Bax抑制剂一1属于抗凋亡蛋白Bcl一2家族，在线粒体凋亡通路中起着重要的作用。Bax基因可诱导细胞凋亡，在人类，包括鼻咽癌在内的多种癌症中发现其表达明显增加。Li等1引针对Bax抑制剂一1构建了shRNA慢病毒转染系统在体内外对鼻咽癌cNE一1和suNEl细胞进行干预，发现该转染系统可明显诱导鼻咽癌细胞凋亡，裸鼠模型肿瘤体积明显缩小。54下调多种过量表达的生长因子及受体如以血管内皮生长因子(VEGF)2、表皮生长因子受体(EGFR)21。等基因为鼻

20、咽癌治疗的靶点进行的RNAi干预，对鼻咽癌细胞均有明显的抑制效果；针对多药耐药基因等进行干预，可降低肿瘤化疗耐药性，保护正常细胞，降低放、化疗副作用。大量临床和基础研究显示，基因治疗将是治疗鼻咽癌的有效方法。尽管目前还存在许多困难，但随着分子生物学的迅速发展，基因治疗必将在今后大放光彩，成为人类攻克鼻咽癌及其他肿瘤的有力武器。参考文献1 Saito K，Amki K，Reddy N，at e1Enhanced local dendritic cell activ-ity and tumorspecific immunoresponse in combined radiofkquencyabla

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22、isk and tumor extensionTissue Antigens，2011，78(2)：148一1514 Liu X，Lu J，He ML，et a1Antitumor efkcts of inteIfemnalpha onceU growth and metastasis in human nasophary“geal carcinomaCurrcancer Drug Targets2012 Mar 14Epub ahead of print5 张政，覃颖，翁敬锦，等白细胞介素2联合放化疗治疗中晚期273鼻咽癌的远期疗效分析中国l临床新医学，20lo，3(11)：10651068

23、6 Tang Y，Li J，Zhao S，et a1Killing efbct of the h8Ipes simplex vims thymidine kinaseganciclovir enzymepmd兀Ig system on humallnas叩haryngeal carcinoma cellsJ Int Med Res，2007，35(4)：4334417 申聪香，文忠，钱宇虹，等增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤鼻咽癌细胞的实验研究中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2010，45(5)：4144198 Datta R，Taneja N，Sukhatme VP，et a1 React

24、ive oxygen inte肿di-ates target CC(AT)6GG sequences to mediate activation of the ea卜1y growth respose l tmnscription factor gene by ionizing mdiationProcNcadsciusA1993，90(6)：241924229 姜武忠，蒋文娟，叶祥兆，等自杀基因载体对体外鼻咽癌细胞杀伤作用的研究中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，2011，l(17)：182l10邱前辉，孙伟，陈少华，等pAdKDRtkGcV自杀基因系统联合了射线放疗鼻咽癌的体内实验临床耳鼻咽喉头颈外

25、科杂志，20lO，24(9)：414416l l PaJl JJ，Zhang SW，Chen CB，et a1E仃ect of Recombinant Adenovinlsp53 Combined WiIh Radiotherapy on LongTe兀n Pmgnosis ofAdVanced Nas叩hary“geal CarcinomaJcO，2009，27(5)，79980412梁海慧，张月飞抑癌基因p16与鼻咽癌相关性的研究进展广东医学，2007，28(7)：1194一1196l 3 Yoshizaki T，Ito M，Murono S， et a1 Cu玎ent understan

26、ding andmanagement of nasopharyngeal carcinoma Aus Nasus 蛔nx，2012，39(2)：137一l“14 Wu CD，Chou HW，Kuo YS，et a1Nucleolin antisense oligode01y-nucleotides induce apoptosis aIld may be used as a potential dmg fo。na8叩haryngeal carcinoma?therapyoncol Rep，2012，27(1)：94一10015蒋昌斌，刘秀芳，贺玉香，等DNAPKcs反义寡核苷酸对不同p53功能

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