杆状病毒介导内耳基因治疗的实验研究.pdf

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1、Vel27 No 9 seo 2007上海交通大学学报(医学版)Journal of Shanghai Jiaotong University(Medical Science文章编号：02585898(2007)091041-04杆状病毒介导内耳基因治疗的实验研究专题报道王俊1王士礼1，蔡昌枰1，李彪2，张一帆2(上海交通大学医学院1瑞金医院耳鼻咽喉科耳鼻咽喉科研究所，2瑞金医院棱医学科，上海200025)摘 要：日曲探讨重组杆状病毒作为内耳基因治疗载体的可行性及其转染特点。方法应用BaetoBae杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒BacGFP，建立新生大鼠耳蜗Corti器体外模型，加携带报告基

2、因的病毒悬液，观察外源基因表达情况，并将其通过圆窗直接显微注射进人豚鼠内耳观察杆状病毒在体内的转染特点。结幂Bac-GFP联合丁酸钠可以高效转染毛细胞和螺旋神经节细胞，但并没有改变Corti器的正常结构。体内试验显示杆状病毒可以忠实和长效转染螺旋神经节细胞，而未被补体系统灭活。结论实验证实杆状病毒有希望成为内耳基局治疗的薪型载体。关键词：杆状病毒；基因治疗；丁酸钠；螺旋神经节细胞；Corti器中图分类号：R764 3 Q78；R-332 文献标志码：AExperimental study of baculovirus-mediated inner ear gene therapyWANG Ju

3、n 2，WANG Shili，CAI Changpin91，LI Bia02，ZHANG Yi-fan2(JDepartmentOtolaryngoiogy，Ruijin Hospital。Institute ofOtoLaryngology，2 Department矿Nuclear Medicine，RuFin Hospital，SchoolofMedicine，Shanghai Jiaoteng Utzivers蛳，Shanghai 200025，China)Abstract： ObjeeavP To study the feaslbiliq,and characteristics of

4、recombinant bacufoviras a5 the inner eagene transfer vectorsMethods After the generation of recombinant baeulovirus BacGFP according to Bac-toBac baeulovirus expression system，the in vitromodel of the organ ot Cum was established and the cochlear explants were iafocted by BacGFP The expression of ex

5、ogenous gene wasobserved，BacGFP wdirectly injected into the inner ear of guinea pigsand the in vivo transfeetion characteristics of baculovirus wercinvestigated Results Bacufovirus was able to infect spiral ganglion ncllrOllfl(SGNs)cultures and hair cells，and the expression levelcould be up-regulate

6、d by sodium butyrateHowever，Bae-GFP and sodium butyrate didnt change the organized structure of the organ ofCom，Bae-GFP could transduce SGNs in vivo and was not inactivated by the complement system Conclusion Baculovirus is a noveland promising tool for inner e”gene therapyKey words：baculovirus；gene

7、 therapy；sodium butyrate；spiral ganglion；organ of Coai耳聋足影响人类生话质量最主要的问题之一。明显后天听力障碍者约占全世界总人口的10，其中绝大多数是感音神经性聋”。由于内耳特殊的解剖结构，很多药物无法到达靶细胞发挥生物学效用。1996年基因治疗应用于内耳，目前基因疗法被认为是感音神经性聋最有希望的治疗方法之一。应用安全、高效的载体将目的基因导入内耳组织，并能忠实和长效表达，是内耳基因治疗的关键步骤。杆状病毒(baculovirus，Bac)载体是近些年才发展起来并被认为是表达效率最高的新型载体，但杆状病毒在内耳基因治疗方面的应用，国内外尚

8、未见任何相关研究报道。本试验首次探讨杆状病毒载体作为内耳基因治疗载体的可行性，旨在为杆状病毒作为内耳基因治疗载体的f临床应用提供实验依据。1材料与方法11重组杆状病毒制备和纯化按照BactoBac杆状病毒表达系统操作手册(Invitrogen)进行，将杆状病毒质粒pFBGFPR(香港大学分子生物学研究所孔祥复教授惠赠)转化DHIOBAC“感受态菌，挑取转座成功的杆状病毒穿梭载体(Bacmid)白色克隆。鉴定后提取Bacmid，并通过脂质体转染法转染秋牯虫细胞sf 9，以古10胎牛血清的sF-90011(GibcoBRL公司)27 oc培养。45 d后收集细胞上清，以空斑试验测杆状病毒滴度。将所

9、得上清中的重组杆状病毒BacGFP蹦感染复数(multiplicity of infection，MOI)01感染sf9细胞，继续贴壁培养扩增。45 d后收集上清，4100 000 g超速离心45 min。收集病毒沉淀溶解在适量PBS中。再经410 000 rmin离基金项目：上海市科委基金(0441197“)资助项目(Shanghai Science and Technology Committee Foundation，044119744)。作者简介：王俊(1980一)，女，山西阳泉，住院医师硕土；电干信箱：lsqjunjun126 colu。通讯作者：壬士礼，电子信葙：shiliwang

10、online，sh，cn。万方数据上海交通大学学报(医学版)心5 rain，Q022m滤器(Poll公司)除菌后，4屯避光保存。l 2建立耳蜗Corti器体外培养模型及鉴定选取出生3 d内的SD大鼠(上海中科院实验动物中心提供)作为试验动物，生产许可证号为SCXK(沪)20030003；使用许可证号为SYXK(沪)20030036。预先制备：胶原凝胶液，即以1“smL的胶原(Sigma)为A夜，10BME(Sigma)为B液，2碳酸钠溶液为C液，按A：B：C=9：l：1比例配成。无血清培养液，即小牛血清蛋白(BSA)2 g，SerumFree Supplement(Sigma)2 mL，2葡萄

11、糖4，8 mI，青霉素G 04 mL，200mmoLL谷氨酰胺2 mL，1 x BME 1908 mL。取胶原凝胶液滴入6 7L板中的盖玻片上，待15 min左右溶液出现凝胶化后加入无血清培养液，以培养液刚好淹没胶滴为适度。用75酒精喷洒鼠全身进行皮肤消毒，断头后将头颅置于无菌培养皿中。在超净台内操作，剪开头顶骨，取出整个耳蜗，将耳蜗移人盛有Hanker培养液的培养皿中，打开耳蜗壳，暴露膜迷路，去掉蜗轴和螺旋韧带等其它结构，分离出基底膜，将耳蜗基底膜移人无血清培养液中，再逐步将其移到胶原凝胶滴的表面铺放平整。在37、5CO，培养箱中培养24 h后加入2 mL培养液，此后培养液每2天换一次。培养

12、48 h终止培养，4的多聚甲醛常温下固定20 min，PBS冲洗。Triton X一100液室温下作月j 10 min，PBS冲洗，10羊血清封闭30 min。用FITC标记的鬼笔环肽(Phalloidine-FITC)(Sigma)在避光处染色30 min。PBS闭光冲洗，封片，于荧光共聚焦显微镜下观察、拍照。13病毒转染Corti器Corti器体外培养48 h，小心吸去培养皿中液体培养基，加入含有10空斑形成单位(plaqueforming u口恼，pfu)pfumL病毒(100灿)的无血清培养基。37孵育1 h后，更换不含病毒的无血清的新鲜培养基，不添加或添加丁酸钠(终浓度为5 reto

13、olL)，继续培养。培养24 h后PBS闭光冲洗，封片，于LSM510META激光共聚焦显微镜蔡司光学仪器(上海)国际贸易有限公司下观察、拍照。14体内转染杆状病毒载体红目白毛成年雄性豚鼠(上海中科院实验动物中心)，生产许可证号为SCXK(沪)20030003；使用许可证证号为SYXK(沪)20030036。麻醉后，在严格无菌条件下，左侧耳经背侧进路暴露听泡，显微镜下打开听泡，暴露耳蜗圆窗。用微量注射器将杆状病毒由圃窗注入，骨蜡封口，缝合切口。对照组用PBS。分别在转染3 d和30 d后取耳蜗制作耳蜗基底膜铺片。1S耳蜗基底膜铺片AgNO，染色标本制作 断头取听泡，暴露耳蜗，打开两窗(卵圆窗和

14、圆窗)，从蜗尖向蜗内灌注5 gL AgNO，溶液，蒸馏水冲洗，再反复灌注福尔马林溶液，并浸入此液内30 rain以上，同时在日光下曝光1530 rain。解剖镜下分离基底膜，移至载玻片上。甘油盖玻片封片，镜检。2结果21 BacGFP构建经浓缩和滤菌后，60 mL sf 9细胞培养上清中可获得BacGFP液3 mL。空斑试验结果显示滴度为10pfutmI。4避光保存2月后，感染细胞的能力无明显降低。浓缩病毒液联合5 mmolL丁酸钠转染HEK293细胞后24 h，荧光显微镜观察GFP表达情况，荧光显微镜下观察可见细胞呈明亮的绿色(图1)，证明重组BacGFP收获成功。通过空斑试验测定病毒的活力

15、和滴度，结果显示收获的病毒活力良好，滴度为10pfumL。22 Corti器体外培养模型鉴定 F-actin是毛细胞静纤毛中特有的一种肌动蛋白。鬼笔环肽可以和其特异性结合，因此可以作为识别毛细胞的一种特殊染色标记。培养8 h后光镜下可见移植物贴壁，其周围有成纤维细胞生艮。培养48 h后荧光染色，荧光共聚焦显微镜下观察可见外毛细胞的听纤毛呈“V”形，排列成三排，内毛细胞的听纤毛呈“u”形，排成一排(图2)。23 BacGFP转染coni器体外培养模型 BaeGFP转染coni器体外培养模型24 h后用荧光共聚焦显微镜下观察，可见束加丁酸钠组内外毛细胞荧光很微弱，螺旋神经节细胞处荧光较毛细胞亮，但

16、总体来说也较微弱(图3。加入丁酸钠组三排外毛细胞和一排内毛细胞排列整齐，细胞轮廓清晰可数，呈明亮的绿色荧光。位于基底膜内缘的螺旋神经节结构清晰，呈现明亮的绿色荧光。实验说明杆状病毒载体在丁酸钠(5 mmolL)的协同作用下可以高效转染毛细胞和螺旋神经节细胞，提示杆状病毒载体作为内耳基因载体的可行性和高效性。但同时并没有改变Corti器的正常结构，提示杆状病毒载体作为内耳基因治疗载体的安全性。24耳蜗基底膜铺片光镜下观察 可见外毛细胞的听纤毛呈“V”形，排列成三排，内毛细胞的听纤毛呈“u”形，整齐地排成一排，整个组织结构完整，层次清晰，听纤毛清晰可见(图4)，证明耳蜗基底膜铺片是观察毛细胞状态的

17、可靠方法。万方数据王俊等：杆状病毒介导内耳基因治疗的实验研究25 Bac-GFP体内转染耳蜗 内耳转导72 h后，取出耳蜗经硝酸银染色后观察，可见毛细胞头板清晰，荧光显微镜下可发现弱绿色荧光，螺旋神经节细胞区域有明亮的荧光(阔5)。取转染30 d豚鼠耳蜗，制作基底膜铺片，荧光显微镜下仍可见螺旋神经节细胞区域发出明亮的荧光，证实杆状病毒介导外源基因的表达可持续达1个月之久。围1 Bac-GFP联台5 illmoIL丁酸钠转染HEK2”细胞24 h后莞光显微镜观察 xl加Fig 1 Fluorescence microscopy examination 24 h after traneductio

18、nef HEK293 cells with BacGFP and S mmolL sodium butyi-&te xIoo围2 Cord器体外培养24 h后FITC标记的鬼笔环肽染色 x400Fig 2 Organ of Cortl cultured in VfIrD for24 h examined by fluores-ceia Isothiocyanatecojugaied phaltaldin 400围3 BacGFP转染Corti叠24 h后黄光显微镜观察x400Fig，Fluoreseence microscopy examination 24 h after traneduet

19、tanof organ of Corti with BacGFP x 400Cellstransduced with BaeGFP in the ab6ence(A)or pnce(B)of 5 mmolL Bodium but)咖te田4光镜观察硝酸银染色后基底膜铺片 400Fig 4 The cochleas stained with AgNO，and stretched preparationexamined b，light microscopy 400围5荧光显撒镜观案BacGFP转染72 h后硝酸银染色豚鼠耳蜗基底膜200Fig 5 Fluorescence microscopy e

20、xamination 72 h after transduclionof cochleas with Bac-GFP stained with AgNO， x2003讨论杆状病毒载体是近年才发展起来并被认为是表达效率最高的新型载体。由于利用真核的昆虫幼虫或细胞作为宿主；杆状病毒基因组本身较大且可操作性好，可以容纳多个基因或较大的基因，而且杆状病毒在自然条件下不能感染脊椎动物，生物安全性好，表明杆状病毒载体在基因治疗中具有巨大的应用价值。但目前国内外尚未见杆状病毒介导的以内耳为靶器官的任何相关报道，也未见BacGFP高效转染神经元的报道”“。本实验通过在体外以Corti器模型作为靶器官，利用GF

21、P的荧光特性，使用荧光显微镜检测杆状病毒载体在内耳转染细胞的类型和安全性。证实杆状病毒载体系统在内耳基因治疗应用的可行性，为体内进行杆状病毒的转染提供实验支持。随后我们尝试性地进行了哺乳动物体内转染，经圆窗给药，通过基底膜铺片观察杆状病毒体内转染的特点。体内试验证实杆状病毒可忠实和长效介导外源基因在螺旋神经节细胞中的表达，而在毛细胞中转染效率较低。1995年，Hofmann等”3和Boyce等”。分别把多万方数据上海交通大学学报(医学版)角体蛋白启动子改装成真核细胞启动子，使重组病毒可在昆虫细胞中扩增，但不表达重组蛋白，进入哺乳类动物细胞后高教表达外源基因，同时病毒并不会扩增。此后，杆状病毒作

22、为哺乳动物细胞基因治疗载体系统得到进一步改进并被广泛地应用，可在体外有效转染HeLa、Huh-7、HepG2、keratinocyt、角质化细胞、骨髓成纤维细胞、胰岛细胞。有报道”。1显示杆状病毒载体还可以在体内对骨骼肌、神经上皮细胞和颈动脉进行基因转导。由于杆状病毒对靶细胞存在细胞特异性，在体内被补体系统灭活”及外源基因表达时效短的缺点，阻碍了它作为基因治疗载体的应用。但本实验证实杆状病毒可以在体内有效而长期的介导外源基因的表达，提示其在内耳基因治疗的巨大应用价值。在体外实验中，我们发现丁酸钠可以显著的提高杆状病毒在毛细胞和螺旋神经节细胞转染效率。丁酸盐是一种组蛋白去乙酰酶抑制园子，能诱导染

23、色体的超乙酰化，从而导致沉默基因的诱导表达”。1。本研究结果表明除了外源基因表达量不仅与杆状病毒进入哺乳动物细胞数量有关，同时杆状病毒基因组在哺乳动物细胞内所受的调控对于转基因的表达也极其关键。因此，杆状病毒基因组在细胞中的状态，例如乙酰化、甲基化和(或)染色质的致密性，可能对于杆状病毒携带的外源基因的表达具有重要作用。此特性提示我们在以后的实验中可以通过添加丁酸钠来提高杆状病毒在体内对毛细胞的转染率，提高其作为内耳基因治疗载体的应用价值。本实验在国内外首次应用杆状病毒作为内耳基因治疗载体，通过体外和体内试验证明杆状病毒载体携带CMV启动子可以在哺乳动物体内忠实、长效的转染神经元听神经第一级神

24、经元螺旋神经节细胞。而杆状病毒以毛细胞为靶细胞可以在体外高教、安全介导外源基因的表达，而在体内转染效率较低，提示需进一步完善实验方法，并利用一些外源调控手段来提高其对内耳毛细胞的转染效率。本实验初步证明了杆状病毒作为内耳基因治疗载体的可能性，为杆状病毒体内转染和携带治疗基因在体内进行内耳基因治疗的可行性提供了实验基础。本研究填补了杆状病毒载体系统在内耳基因治疗方面应用的空白，提出一条解决目前内耳基因治疗I临床应用问题的新途径。参考文献：1Hawkins RDLovett M The deveopmenta!genetics of auditorhaircellsJHum Mol Cenet20

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