人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导胸苷激酶基因治疗人膀胱癌的动物实验研究.pdf

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1、1058 中国肿瘤临床 2007年第34卷第18崩人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导胸苷激酶基因治疗人膀胱癌的动物实验研究摘要 目的：探讨带有人端柱酶逆转录酶(hTElit)启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSVtk)基因的重组腺病毒AdhTERT-HSvtk结合无毒的环氧鸟苷(GCV)对人膀胱癌的治疗作用。方法：建立人膀胱癌细胞株253JBALBC裸小鼠移植癞模型，采用AdhTERT-Hsv一出裸鼠尾静脉注射照度注射GCV活疗并观察结果。通过常规藕理切片观察肿痛破坏情况厦安垒性；通过1LNEl染色进一步观察肿瘤的凋亡情况免疫组化法测定增值细胞核抗原(PCNA)。结果：AdhTERT-H

2、SVtkGCV治疗蛆，显示出明显的肿瘤抑制作用其肿瘤体积、重量显著低于各对照组(P005)，抑瘤率明显。AdhTERTHSVikGCV治疗蛆凋亡指数高于其它各组而增殖指数却明显低于其它各组。结论：AdhTERTHSVtkGCV系统对裸鼠移植瘤的生长有明显抑制作用，可以靶向性转凡人膀胱癌细胞，治疗糟果显芋，关键词 膀胱肿瘤 单纯疤疹病毒胸腺喀啶激酶基因 腺病毒人端粒酶逆转录酶启动子Animal Research using the Adenovirus-mediated HSVTK，GCVSuicide Gene System Controlled bythe hTERT Promoter in

3、 Human Bladder CancerLian Wmffeng Lin Xian野ang Zhang Swing et alDepartment of Urology,Baoding No3 Hospital，BaodingAbstract 0bjective：To investigate the efficacy of replicationdeficient adenovirus carrying theHSVTK gene under the control of the human telomerasc reverse transcriptase(hTERT)promoter an

4、dgatmiclovir(GCV)in a mouse xenograft model of bladder cancerMethods：We established the modelof human bladder cancer cell line 253J xen091afts in BALBC nude mice and administered peritonealinjections of GCV and tail vein injections of Adh。IERTHSVtkResults：The AdhTERTHSVtkGCV system more effectivelv

5、suppressed tumor growth in nude miceThe tanlor volume and weightwere obviously smaller compared to the control groupThe apoptosis index of the AdhTERTHSVtUGCV group was obviously higher than any other90upbut the proliferation index of the AdhTERTHSV-tkGCV group was lower than in the otherm-oupsConcl

6、usion：The AdtffERTHSVtkGCVsystem suppresses the gqowth of human bladder cancer in vivoThe HSVTKGCV suicide gene syslemcoutrolled by the hTERT ptvmoter can be used to treat hnman bladder canceland the effect issignificantKey words Bladder ileOplasm Carcinoma HSV-TK geneAdenovirus hTERTHSVtkGCV系统在肿瘤自杀

7、基因治疗中的研究最为广泛1人端粒酶逆转录酶(Hllman Telom通讯作者：连文峰medlwfsina cornerase Revelserraascriptase，hTERT)是维持端粒酶活性所必需的催化亚单位，它的表达调控在转录水万方数据2007年第34巷第18期 人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒舟导胸苷激酶基因治疗人膀耽癌的动物窭验研究 1059平上利州hTERT启动子来凋控病毒携带的目的基因，理论上可使病毒选择性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达目的基因。因此可以靶向性杀伤肿瘤细胞。我们建立了BALBC裸鼠膀胱癌细胞的移植瘤模型，采用尾静脉注射AdhTERTHSVtk，结合腹腔注射GCV对

8、AdhTERTHSVtkGCV的体内抗肿瘤效果进行初步探讨。1材料与方法11材料复制缺陷型重组腺病毒AdhTERTHSVtk由河北医科大学第二医院泌尿外科王亚轩等构建提供“1：人膀胱癌细胞株253J南上海东方肝胆外科医院钱其军博士惠赠；BALBC裸鼠；5,-6周龄，共28只，雌性重量18229购自中国医学科学院动物培育中心。GCV购于湖北科益药业有限公司，培养液RPMll640、舍10灭活胎牛fl【清(FBS)均购自美国GIBCO公亡d。12方法121膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型建立、分组及治疗方法体外培养人膀胱癌细胞株253J，取对数生长期细胞，用025的胰酶消化，离心后收集细胞，调整细胞悬液浓

9、度为2x10，细胞ml，在裸鼠右前肢皮下接种O2ml。观察小鼠肿瘤生长情况，当肿瘤生长至直径约为6mm和(或)体积为100mm3时，经统计学检验裸鼠间肿瘤体积无统计学意义(挎O05)，后分组试验。肿瘤体积计算按公式：(体积=长径短径2x0523 6)。对荷瘤裸鼠进行随机分组，选用瘤体大小一致的裸鼠28只，分为4组，每组7只。1)AdhTERTHSVtkGCV治疗组：于第1、3、5、7、9天每只裸鼠尾静脉内注射浓缩病毒液AdhTERTHSVtk(510。pfu)01ml。第2天腹腔注射GCV lOOmg(kgd)15d。2)Ad_hTERTHSVtk治疗组：在裸鼠尾静脉注射Ad-hTERTHSV

10、tk(5x109pfu)0，1ml，第2天腹腔注射PBS 100山15d。3)GCV治疗组：在裸鼠尾静脉内注射PBS 1001xl，腹腔注射GCV 100rag(kgd)x15d。4)对照组：裸鼠尾静脉内每天仅注射PBS 100肛1。l 22观察指标 1)AdhTERTHSVtkGCV治疗肿瘤的疗效观察。肿瘤生长抑制的观察：自注射药物开始。每7天用圆规和游标卡尺测量肿瘤犬小，计算肿瘤的体积描绘肿瘤的生长曲线，共观察6周。按公式：(1-治疗组体积对照组体积)x100，计算肿瘤生长抑制率。观察期结束后采用颈椎脱臼法处死裸鼠，取对照组和治疗组的肿瘤组织称重。Ad-hTERT-HSV-tkGCV治疗后

11、，观察裸鼠存活期。2)肿瘤细胞病理学观察及细胞凋亡。取肿瘤组织及心、肝、肾等重要脏器经HE染色后在400高倍镜F仔细对比观察。应用TUNEL法检测细胞凋亡。用图像分析系统测定10个400高倍镜下记数每个视野内阳性细胞占100个肿瘤细胞的比例取其平均值作为捅亡率3)免疫组化染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。采用免疫组化染色法检测，核染色为深棕色为1)CNA表达阳性细胞，400高倍镜下记数每个视野内阳性细胞占100个肿瘤细胞的比例，连续观察lO个视野，取其平均值作为PCNA增殖指数(PI)。13统计学方法对实验中所获得的各种数据均采用均数4-标准差表示，各组数据之由j比较采用单因素方差分析

12、，PO05为有差异有统计学意义应用SPSS 1 l|0软件进行统计学处理。2结果21 裸鼠荷人膀胱癌移植瘤动物模型的建立裸鼠予以皮下注射膀胱癌细胞后5天，可观察到直径约35ram大小的皮下肿瘤结节，成瘤率为100。10天后，瘤结节艮至6mm以上，开始分组及给药治疗。22 AdhTERTHSVtkGCV对荷瘤裸鼠膀胱癌的生长抑制及生存期的观察AdhTERTHSVtkGCV治疗组从腹腔注射GCV后第7天平均体积为28643mm310392ram3，明显小于对照组499，77mm310109ram(心O05)。直至实验结束，肿瘤体积均明显小于AdhTERTHSVtk、GCV治疗组和对照组(表1)。A

13、dhTERTHSVtkGCV治疗组自注射GCV后第7天起肿瘤生长速度明显慢于其它各组(P005)，存在明显的量一效I线(图1)。从移植瘤抑制率曲线可以看出(网2)，Adh。11ERTHSVtkGV治疗组较Ad-hTERTHSVtk、GCV单独治疗组能够更明显的抑制肿瘤生长。比较切除肿瘤标本的重量，可发现AdhTERTHSVtkGCV治疗组的移植瘤重量明显轻于对照组(P005)(表2)。通过对裸鼠生存期的观察，我们看y-0AdhTERT-HSVtk、GCV治疗组及对照组自治疗后14天小鼠开始出现死亡。到观察期结束，对照组等三组中最多只有5只小鼠存活而AdhTERTHSVtkGCV组小鼠全部仔活，

14、存活率达到lOO(表2)。2|3肿瘤组织的病理改变病理检查发现AdhTERTHSVtkGCV治疗组：肿瘤细胞呈稀疏分散排列，有片状坏死，肿瘤血管明显减少，组织结构紊乱，多为纤维组织所代替，部分胞浆空泡性变部分肿瘤细胞核固缩，呈退化表现。对照组以及其它治疗组瘤细胞排列紧密，问质极少，细胞群边缘不光蘩，肿瘤血管网络丰富，肿瘤细万方数据中国肿瘤临床 21307年第34卷第18期胞边界不清，细胞形态和缅胞核呈多行性，细胞核大深染核分裂象多见。AdhTERTTKGCV治疗后显微镜下仔细观察，与正常对照的心、肝、肾、组织形态学上无届著区别。表1各组裸鼠体积的变化(；盘，iflli113)羔蔓瑟瑟基受薹耍匦

15、至蚕曩纛羔童熊二三銮薹羔煎主至噩垂三薹三囊曩懑笺邀薹至一hTERT一7 230 99=77 08 286 43110392*467 92l 57 25*894 73士29616s110 87=33245*l 486 54+-60814+ 2】06 92_+858 53*HSVIkGCVdh下ERT一7 217 6459 48 505 88+81 88 1 007 85I 25 2j 1 329 87=48叭 2 157 4280 34 3 010 10-+608 22 4 86(I 16t824 63HSYtkf,CV埘麒绎_o心O 0560曼40凳20辕 O一207 221 36-+38 9

16、5 432 80_+64端 1 044053996 1 54003-+56 2l 2 21716-6417 2 657 71)99 79 4 424 03-+l 5l 977 222 9329嘶49977+101 09 I()(19 7015315 1 628 40216 70 2 270 50_+292 3】 3 042 563801l 4 627 6-+6l 5 8i0 10 20 30 4D 50时间(天)图1棵鼠移植癌生长曲线Ad-htert一们V一Ad山TERT-TK0 7 14 21 28 35 42时间(天)图2裸鼠移植瘤抑制率fI线表2各组裸鼠存活期殛移植瘤重量：羔-冀遴鎏篓鐾

17、i；夔遴鎏鐾鏊对照组 7 5dcI 7 4Ad一lTERrHSVtk 7 511一h【1KII；I-HSVtluGVC 7 7+Pkn 05l 60。-+0 200 71 43l，630-+0 220 57 14l 456-+0194 71 430901-+0 257* 10f)24肿瘤组织内细胞凋亡和增殖细胞棱抗原的检测结果仅在AdhTERTHSVticGCV治疗组标本中，发现大量的棕色凋亡细胞(图3)，凋亡指数为(11-t-O2)，同其他各组相比差异具有鼎著性(P005)。在AdhTERTHSVtkGCV治疗组的肿瘤组织巾仅见孤立的棕色细胞(图4)，肿瘤细胞的PCNA增殖指数明显减低为(4

18、5698)。罔3 AdhTERTHSVtk+GCV治疗组肿痛细胞凋亡。FUNEL法400图4 AdhTERT-HSVtk+GCV组PCNA表达免疫组化法4003讨论单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶联合无毒的环氧鸟苷已广泛用于肿瘤的基因治疗“,7j。Ritz等在HSVtk基因治疗肿瘤的体内实验中观察到，人端粒酶逆转录酶启动子凋控的复制缺陷型腺病毒AdhTERTHSVtk具有良好的肿瘤细胞内特异性表达能力它可以选择性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中复制。端粒酶在85的恶性肿瘤中都有高效表达，而在正常细咖鼢咖啪咖啪。65432l一0曼嚣壮万方数据2007年第34卷第18期 人端粒酶逆转录酶启动子调控腺稿毒介导胸苷激

19、酶基因治疗人膀胱癌的动物实验研究胞中几乎无表达，在膀胱癌细胞中口丁达到92O。由于活性hTERT与端粒活性一致，而hTERT启动子只有在端粒酶阳性细胞中有转录活性，因此具有特异性靶向治疗肿瘤的能力。已经通过体外实验初步证实了hTERT启动子调控的F游基因可选择性的在前列腺肿瘤细胞中表达，在正常细胞无表达，具有明显的靶向性。另一项研究体外转染膀胱癌细胞Ad_hIERTHSVtkGCV系统也有靶向杀伤作用。我们将253J继胞在裸鼠体内成瘤，AdhTERTHSVtk活体应用时尾静脉注射，结果发现在AdhTERTHSVtkGcv作用下，肿瘤生长明显受到抑制。从而证明了AdhTERT-HSVtkGCV系

20、统用于肿瘤靶向基因治疗的可行性。综上所述，AdhTERTHSVtkGCV系统，是安全、有效、靶向性的减毒非增殖腺病毒基因治疗系统，它为膀胱癌等实体瘤的治疗提供了一种新的手段。参考文献1 Chin CC，Li CJ-L FuhIS，et atThe suppressed proliferation andpremaatre sa蛳caloc by ganddovir in ps3一mueated humannon-smatlu“g camccr cells a“Iir峨herpes simplex vhusthymidineecDNA田Cavour Detect Prey，2005，29 0)：

21、286-2932 Ma CY,Lu YC，Shi JX,n aL Experimemal study of du曲tmge血g gene therapy system for pituitary adenomas 0】Zhonghua Yi Xue Za Zlfi,2005，85(4)：2622863 Zhang Y，Huang SZ，Wang S，ct atD刊0pmcnt of aIlISVlktransgenic moDsc model for study of 5ver damage 0FEBS J2005，272(9)：220722154 Stefani AL，Barzon L，Ga

22、stagtinoin I，et m，Systemic efficacy ofcombined sm蛳okine gene therapy in a murine model ofhepatocellular carcinom3J Hepatol，2005，42(5)：7287355王亚轩，蔡文靖，黎玮，等人端粒酶逆转录酶睹动子嘲控腺瘴毒介导的胸苷激酶基因治疗膀胱癌的实验研究田中华泌尿外科杂志，2005，26(4)：229-232 6丘少鹏，毛小鹏，曹开源等胸苷激酶基嗣系统联合大蒜素诱导膀胱痛细胞凋亡的研究田中华外科杂志，2005，43(0)=3823867孝世拥，于谴，安萍，等腺病毒介导的双自

23、杀基因对直肠痛细胞的杀伤作崩田中华外科杂志，200139(8)：5775798 RitzJM，Ktthle O，Riethdorf S，cc mA lmvd黜moll$emode!reveats humanlike R乒蛹of an 8-kbp human TERTgene promoter hgmin normal and t眦or tissut3町CzmcerRes，2005，6,5：118711969 Kirch HC，Ruschen S，Brockmann D，et缸Tumor 1pe口6cactivation of hTERTd甜vcd promoters bv tlllil01suppressiveEIA-mutanB involves recauimlem of P300GBPHAT andsuppression ofHDAC一1 and defines a combined HJllCm01t“铲“ngand suppression system，Oacogeae，2002，21(52)：7991“8000】O付广，手同斌，卢晓明，等膳厦体生存素反义寡棱苷酸抑制冒癌裸鼠皮下移植瘤F长的作用叩中华外科杂志0004，42(22)：13671371(2007_0309收稿)(邢颖校对)|黼蒸_三至兰万方数据