RNA干扰Survivin基因治疗大肠癌作用机制的研究进展.pdf

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1、1I辱簪渍化泰豁wcjdwjgnetcom文敞综述黼IEW世界华人消化杂志2006年11月28日；14(33)：32153218ISSN 10093079 CN 141260RRNA干扰Survivin基因治疗大肠癌作用机制的研究进展张志宏，韩盛玺张志宏，韩盛玺四川省医学科学院，四川省人民医院消化内科四川省成都市61()041通讯作者：张志宏，61 0041，四川省成都市西一环32号，四I省医学科学院，四川省人民医院消化内科zhang一82121cncom电话：02866304892收稿日期：20060910接受日期：20061009摘要Survivin(生存素)作为IAP家族成员之一，被认为

2、是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子以siRNA干扰Survivin的表达靶向观察其对大肠癌细胞基因的表达及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制关键词：Survjvin；siRNA干扰；COx一2抑制剂张志宏，韩盛玺RNA干扰Su rvivin基因治疗大肠癌作用机制的研究进展世界华人消化杂志2006；1 4(33)：32 1 532 18http：nnfwjgnetcom，1 0093079，1 4，321 5aspO引言小干扰RNA片段(small interfering RNA，siRNA)对目的基因Suivin的干扰是否对相应的基因和蛋白质的表达产生影响，从而干扰细胞的增殖和凋亡1

3、 RNA干扰及其作用机制RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指由小片段的双链RNA分子介导的生物细胞内同源基因的特异性转录后基因静默现象(po sttranscriptional gene silencin曲最早报道见于1990年，但直至1998年，Fire P，a首次将正义链和反义链的RNA混合物双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)注入线虫，结果诱发出比单独注射正反义链强10倍以上的基因静默现象，而且在其后代亦可产生同样应答【2】，自此激励许多实验室从事大规模的基因组筛选研究以阐明基因功能其作用机制分为如下二个阶段：(1)长链的双链RNA进入细

4、胞；在细胞胞质内的核酸酶Dicer的作用下，dsDNA被切割成2123 bp的siRNA；后者(包括外源性合成的和内源性表达的siRNA)均可与一些功能蛋白结合，WWw，叼gnet。com形成RNA介导的基因沉默复合物限NAinduced _背景资料silencing c。mplexes，RJsc)；(2)RJsc中螺旋酶解 鬻青鬟I慕：开双链siRNA，后者通过解开的反义链与siRNA 坌三坌导粤璺内具有高度互ji序列的靶信使RNA(me。enge， 呈霉盖璺嚣簇RNA)结合，RIsc切割降解与siRNA序列互补的 蔓羞萎篱蓓轰釜mRNA，从而引起特定基因的沉默其主要特点 Fi咒甜“的研究结

5、包括：(1)高特异性：siRNA只能特异性的降解同 委蓑墨羹轰囊等源性mRNA，对siRNA其他种类基因的表达不 基因组筛选研究受影响w扑lbold甜a，31证明用siRNA能有效沉 以阐明基因功能默异常BcRABL融合基因表达，而不影响正常cBCR和cABL的转录；(2)高效性：少量dsRNA可促进大量同源mRNA的降解，与寡脱氧核苷酸(oligodeoxyribonucleic acids，0DNs)比较其最大抑制浓度(IC50)低l 001 000倍H巧】，并且作用时间延长【6】，同时有研究证明通过电穿空、局部注射或静脉注射【7】的方法已经成功将化学合成的siRNA、表达siRNA的质粒

6、以及病毒等导入哺乳动物，并不引起全身非特异性反应用4，8。9。2004年美国FDA已经批准将经过修饰的siRNA进行临床新药实验，用于治疗与年龄相关的黄斑退行性改变的患者隅】总之，RNAi作为研究基因功能的一种重要和常用的技术，已经广泛用于基因组的研究和临床疾病包括病毒感染、显性遗传疾病，尤其是肿瘤的治疗研究，有着广阔的前景和应用潜力2 Wnt信号传导通路的作用机制目前在我国，大肠癌作为一种常见的恶性肿瘤，其发病率呈现出逐年增加的趋势，但是由于其治疗效果不尽如人意，使人们对其病因、发病机制的研究兴趣日益增加而防治肿瘤的关键在于诱导肿瘤细胞的凋亡和抑制其无限增殖目前认为在结肠癌变发生、发展的多个

7、环节中，Wnt信号传导通路发挥着决定性的作用其通路中的多个成员如APC，pcatenin，cyclinD，cmyc，Survivin，PTEN等在结肠癌变的过程中均出现异常改变APc(adenomatous p01yposis c01i)属于抑癌基因的一种生理环境中的APC基因既可以自身聚合(即同源寡聚体化)，也可与Bcatenin等蛋万方数据3216 ISSN 1009-3079 CN 141260R 世界华人消化杂志 2006年1 1月28日 第1 4卷 第33期应用要点 白结合，从而参与调节细胞的黏附、细胞周期品鬻紫黑莩黧 进程和细胞的凋亡等过程病理条件下，发生突专粤表达竺相 变的APc

8、基因一方面可以干扰细胞与细胞间以NsAiD。制剂及 及细胞与间质组织间的相互作用，从而导致细嘉舅戋：玲鐾量 胞的异常增生；另一方面可导致APc与pcatenin了解其可能对大 复合物的解体，游离的Bcatenin可以结合于转录誓莩芬嚣凳耋 因子TcFLEF-1，引起靶基因cmyc的激活，使细一步阐明其作用 胞无序分裂而不死亡，从而造成细胞的无序增荔羔囊冀望篡窝 生，最终导致肿瘤的形成-11】，这也提示Apc基方法和途径有着 因的失活是大肠肿瘤发生、发展过程中的一个妻枭秦茇理论 关键的分子m】此外，研究证实在腺瘤向腺癌进展的各个阶段，APC基因的失活率相似，均大于80，这说明APC基因失活发生在

9、癌变的初始阶段【1 31进一步的研究发现一些独立的修饰基因(指能够修饰一个突变基因的表现形式，而对正常状态无明显影响的一些基因位点)能够在很大程度上影响APC基因的突变后果，而COx2正是作为APC的一个修饰基因位点对后者的表达发挥着重要的作用而Kim甜a，141证实Survivin是APCTCF4Bcatenin的下一个靶点，由于TcF一4的结合位点是在Survivin转录增强子区域中，TcF4Bcatenin信号通路的激活会导致Survivin的表达显著上升与Sunrivin相反，作为抑癌基因的PTEN与Survivin均参与细胞周期的调控和细胞凋亡的发生，作用环节一致，而生物学效应相反，

10、在肿瘤中的表达常常减少或缺失【”】总而言之，wnt信号传导通路在大肠癌变的过程中可能发挥着决定性的作用3 suivin的作用机制Survivin是近来发现的凋亡抑制蛋白(inhibitorof apoptosis protein，IAP)家族成员之一，被认为是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子于1997年由Ambrosini Pf口经效应细胞蛋白酶受体-1(ef代ctof cell protease receptor-1，EpR-1)cDNA在人类基因组库的杂交筛首先分离出来Survivin位于染色体17q25的同一基因族，长度范围在75130 kb，包括4个外显子和3个内含子mRNA编码的一个

11、由142个氨基酸组成的相对分子质量约17 kDa的胞质蛋白目前发现3个剪切体：SuivinEx3，survivin2B，Suivin一3B不同于其他IAP家族成员主要分布于正常终未分化组织中，由Survivin基因编码产生的蛋白可以在胚胎发育过程中和绝大多数肿瘤组织中表达，在正常组织中则不表达研究发现，survivin在结肠癌组织及癌旁的正常组织中表达阳性率分别为6305和291，有着显著差异同时发现在Dukes分期II期的患者中，Survivin阳性的患者5 a存活期为448，而阴性者则为944。提示其阳性表达对疾病的预后有着重要影响【l 61同样在其他肿瘤如宫颈癌171和乳腺癌m1中的高阳

12、性率的表达也认为与肿瘤细胞的低分化呈正相关，而与预后呈负相关其主要作用机制可能与以下几点相关：(1)凋亡途径的上游启动酶有内源性caspase一9和外源性caspase8，下游的执行酶有caspase3和caspase7等surVivin可直接与激活的caspase一3和caspase7结合而抑制其活性，阻止由caspase激活剂或凋亡诱导剂诱导的细胞DEVDcleaving自杀酶的累积，从而起到抑制细胞凋亡的作用。201；(2)也有研究认为，Survivin通过与线粒体释放的凋亡前蛋白，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶二级活化物(secondmitochondria-derived actiVa

13、tor of caspase，SMAC)结合，间接抑制caspase9依赖的细胞凋亡信号传导或通过Survivin的Thr34磷酸化后直接与caspase9结合抑制其活性，阻断caspase9依赖的细胞凋亡信号传导。221；(3)通过竞争性与CDK4伊21结合，激活cdl(2cycml E，介导pkb磷酸化，促进S期进程，同时从CDK中释放出P21，与procaspase3形成复合物，抑制caspase一3的活性【2纠；(4)通过其细胞周期调节作用，使肿瘤细胞逃避细胞周期G2M期检测点的监测，抵抗因DNA损伤或突变自身诱导的细胞凋亡，从而导致肿瘤细胞异常分裂增殖【241另外，Survivin的

14、表达受到信号通路的调控：(1)survivin作为APCTCF4Bcatenin下游的一个靶点受到Wnt通路的调控；(2)磷酸酰肌醇一3激酶(P13K)AKT通路中，P13K是T淋巴细胞内重要的信号转导分子，通过催化底物磷酸酰肌醇发生磷酸化而将活化信号传入细胞内，进而激活PKB等信号参与细胞活化和细胞毒效应而PKBAKT的主要作用是作为P13K的下游底物P13K磷酸化后，可导致Survivin的上升【25】，相反P13K途径受抑制会导致其表达式的下调Fornaro Pf a，271认为，抑制AKT的表达可以阻断整联蛋白所介导的Suivin的表达；(3)有研究认为，存在JAKsSTAT3一Sur

15、vivin信号传导通路活化的STATs将直接导致Survivin的表达上调【2叫正是由于其所具有的在肿瘤组织中高选择性的表达和独特的抗凋亡的作用机制，Survivin作为一种新的凋亡抑制因子，因而有可能作为肿瘤治疗的一个特异的攻击靶点，从而为肿瘤治疗提供新的思wwW。叼9netcom 万方数据张志宏，等RNA干扰Survivin基因治疗大肠癌作用机制的研究进展路因此，越来越受到国内外学者们的广泛关注与Survivin相反，作为抑癌基因的PTEN定位于 。10q23，与Survivin均参与细胞周期的调控和细胞凋亡的发生，作用环节一致，而生物学效应相反PTEN作为目前发现的唯一具有双特异性磷 4

16、酸酶活性的抑癌基因在维持正常细胞的稳定性中发挥重要作用口81此外因其具有对P13KPKBAKT信号传导通路的负调控作用而备受关注， 。甚至有学者称为其为PTENP13KPKBAKT通路其主要机制为：PTEN蛋白可依赖其脂质磷酸 。酶活性，使磷脂酰肌醇PIP3的D3位去磷化，使焦点黏附蛋白(focal adhesion kinase，FAK)和AKT的磷酸化受抑，导致P13刚AKt信号转导途径受 7阻，从而抑制Suivin的表达，启动细胞周期、促进细胞分裂当组织恶变时，PTEN基因常发生突变，其表达出现下调或缺失，对P13刚AKT通路的抑制作用减弱，则抑制肿瘤细胞增殖分化能力减弱而Suivin的

17、表达上调，一方面启动细胞周期，促进分裂；另一方面进入细胞核与CDK4结 8合，抑制凋亡，促使肿瘤细胞的恶性增殖能力增强【291而应用PTEN基因转染神经胶质瘤和卵巢 9癌可使肿瘤细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡30。3 21可能存在通路APc(cOX2)TCF一4BcateninSurvivin(PT|EN)有实验认为，在结肠隐窝轴系 统中，由基底部至隐窝顶部APC的表达由弱至强而Survivn则相反，在底部表达阳性，中部以上则缺失由此提示，APC可能起着调节Suivin 】1表达的作用【331而在一项肺癌研究中认为APC的修饰基因C0x2与survivin的表达呈协同上升趋势341另有研究报道，通

18、过转染外源性Dcatenin 12和TcF一4可使survivin上升”】，而用survivin反义 1 3寡核苷酸3q及非甾体抗炎药(NSAIDs试剂)则均可诱导肿瘤细胞survivin的表达下调，并且诱导细胞的凋亡【3 7。38】 14总之，进一步了解APc(COx2)，Survivin及PTEN之间表达的相关性，以及用NSAIDs制剂及 15特异性RNAi干扰Survivin的表达，了解其可能对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响，以期为进一步阐明其作用机制和为防治大肠癌提供理想的方 ，；法和途径，有着十分重要的理论和实践意义4 参考文献 171 Fire A，Xu S，Montgomery MK

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