聚酰胺-胺型纳米载体在基因治疗中的研究进展.pdf

《聚酰胺-胺型纳米载体在基因治疗中的研究进展.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《聚酰胺-胺型纳米载体在基因治疗中的研究进展.pdf（4页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、聚酰胺一胺型纳米载体在基因治疗中的研究进展黄志军 易斌【摘要】聚酰胺胺型树枝状高聚物可与DNA形成纳米尺寸的聚电解质复合物，具有很高的稳定性和溶解性，因此被认为是较好的基因载体。现有研究对聚酰胺一胺型树枝状高聚物介导的基因入胞机制已经较为清楚，体外研究证实该载体基因转染效率高，转基因能长期、稳定表达，且细胞毒性小；体内研究则证实在尤文肉瘤防治、心脏移植、恶性疟疫苗和肺纤维化防治等诸多疾病的基因治疗领域有较好的前景。【关键词】聚酰胺一胺型树枝状高聚物；载体；基因治疗中图分类号：Q782：1131808 文献标识码：A 文章编号：1673-4181(2008)05-030804n理肝鄹in res

2、earch of polyamidoamine dendrimers躯gene carriers HUANG ghi-jun，YI BinThe ThirdXiangya Hospital,Central South University,咖地410013,China【Abstract】Polyamidoamine(PAMAM)dendrimers is considered a better genetic carrier for its ability toform with DNA a nano-sized polyelectrolyte complex of high stabilit

3、y and dissolubilityThe mechanism of PAMAMmediated gene endocytosis has been fairly clear and the researches in vitro have confirmed that PAMAM had higlltransfection efficiency and low eytotoxicityThe reseorcht朗,in vivo have further confirmed that PAMAM had a po-tential application foreground in the

4、field of gone therapy including in the prevention and treatment of ewings s小coma and pulmonary fibrosis，in heart transplantation,and in the preparation offalciparum malaria vaccine【Key words】Polyamidoamine dendrimem；Carrier,Gene therapy基因组计划的完成使人类对于自身的了解大大加深利用基因治疗手段解决人类疾病问题的愿望也愈来愈强烈，但载体作为基因治疗领域的核心因素

5、一直制约着该领域的进展。以往大多数载体存在以下缺陷：细胞毒性、低转移率、血清依赖性和适用范围受限等。而一种新型纳米材料聚酰胺一胺型树枝状高聚物(polyamidoamine dendrimers，PAMAMD或PAMAM)的出现为解决现存的难题提供了有效的手段。成为当前研究和应用的热点。l PAMAM树枝状高聚物的合成及特性美国密西根化学研究所的Tomalia等于1985年首先合成了一种树枝状高聚物(dendrimers)，这种高分子材料具有呈辐射状对称刚性球体结构。dendrlmers末端的胺基完全质子化成为带正电荷的一NH3+所以分子表面正电荷密度高，能与天然状态下存在的带负电荷的生物活性

6、物质发生静电相基金项目：教育部高等学校博士学科点基金新教师项目(20070533033)作者单位：410013长沙。中南大学湘雅三医院互作用。形成复合物。dendrimers的合成方法分为发散法和会聚法两种，前者更为常用。发散法是以氨、乙二胺及丙胺等作为核心分子，经逐级聚合反应向四周放射状生长，最终形成树枝状结构。每循环一次就在已形成的聚合物上增加一层，表面胺基团数倍增，分子质量呈指数性增大。会聚法主要涉及两个步骤：首先是一系列小分枝的反复耦合，生成树枝状结构：然后锚定一个核心分子，从而产生一个由多个树枝状结构组成的dendrimers。dendrimers作为纳米材料，从GO代到G10代直径

7、范围为1-13 nm。其中，PAMAM是研究最多的一种dendrimers分子，其合成技术成熟。性质确定。相当一部分已经商品化。该家族与许多重要蛋白质和生物大分子相似如G3、G4及G5 PAMAM的大小和形状就分别与胰岛素、细胞色素C及血红蛋白十分类似。G7一G10 PAMAM可与DNA形成纳米尺寸的聚电解质复合物，复合物具有很高的稳定性和溶解性，可以在细胞外和细胞内保护DNA。避免其受到酶类的降解因此是较好的基因载体。万方数据2 PAMAM介导的基因入胞机制将PAMAMD复合物加以放射性核素标记。结果证实其进入细胞的主要机制为胞吞作用。细胞代谢抑制剂(叠氮化钠)或胞吞抑制剂(如松孢菌素B)可

8、显著降低PAMAMDNA复合物的摄取率及转移基因的表达率。而溶酶体酸化抑制剂氯喹则可提高基因的转染效率。PAMAMDNA复合物进入细胞是通过其表面的阳离子与细胞膜上带有负电荷的糖蛋白及磷脂的相互作用。Jevprasesphant等2研究显示，阳离子PAMAM的渗透系数高于阴离子PAMAM。前者能降低上皮电阻抗，提高甘露醇的渗透系数，而经月桂酰修饰的阳离子PAMAM更能显著降低上皮电阻抗随着表面连接的月桂酰基增多，阳离子PAMAM的渗透系数越高。PAMAM进入上皮单层细胞是通过细胞旁通路和穿细胞通路两种形式。Kitchens等3近期研究认为PAMAM的通透性与细胞紧密连接的开放有关将PAMAM表

9、面加以改造有可能提升其跨细胞转运的能力。但也有研究报道阴离子PAMAM可快速穿越大鼠小肠而阳离子PAMAM由于和细胞膜的负电荷相互作用，导致与组织严重黏附，传递速率减低41。Arima等51合成了PAMAM与环糊精的复合物，发现二者具有协同效应，当PAMAM与q环糊精结合时表现出最大的基因转移能力与单用PAMAM或PAMAMd环糊精的物理混合物相比增加了100倍且优于脂质体。3 PAMAM在体外基因转移中的应用31 PAMAM基因转染效率的研究研究显示，PAMAM纳米载体在猴和人等哺乳动物的肿瘤细胞株中的基因转染率较裸DNA及脂质体等阳离子载体显著提高。赵维明等6】对比了G5PAMAMD、脂质

10、体和裸质粒在前列腺癌细胞系PC23的转染效率。结果发现，PC23阳性对照组(LipoDNA)及实验组(G5PAMAMDDNA)转染率为245与358，而裸质粒组为30如86相比差异显著(P001)。Teixeira等7报道分别载有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescentprotein，EGFP)及EGFP表达质粒的PAMAM在K562细胞转染率均达到98，而转染EGFP表达质粒的细胞，绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)持续表达时间长达10周。Choi等8】研究显示只有合成代数G5的完整PAMAM中才能介导明显的基因转染。以

11、大鼠胚胎成纤维细胞株为代表的细胞系中G5GIO代(NH3或EDA为核心分子)PAMAM载体介导的转染率随其代数增加而增加。也有实验证明。当G3 PAMAM与硫代磷酸酯寡核苷酸形成电荷比分别为l及20的复合物时，其基因转移率可分别提高4及50倍。Kono等：9j通过CVl细胞和非洲绿猴肾细胞株的观察发现，经过苯丙氨酸修饰的PAMAM G4具有更高的基因转移效率。Choi等LlO也报道精氨酸表面修饰可以提高PAMAM的基因转移能力。PAMAM可介导外源基因在宿主细胞染色体DNA中整合，从而获得转基因的长期、稳定表达。将B：半乳糖苷酶及新霉素抗性基因的表达质粒转染小鼠黑色素瘤细胞，发现PAMAM载体

12、转染所得的新霉素抗性克隆数较磷酸钙法及DEAEdextran法高出90倍，其中13的新霉素抗性克隆产生B：半乳糖苷酶。表明非选择基因已整合于转染细胞的基因组DNA之中并开始表达。传统非病毒载体在原代细胞系中表达率较低。但PAMAM可转染各种来源的原代细胞包括人成纤维细胞及人肺上皮细胞等。新近研究发现，PAMAM还能介导shRNA表达质粒转染原代培养的皮层细胞并能有效抑制目的基因的表达，其抑制效果优于脂质体、聚乙烯亚胺等阳离子转染剂。PAMAM的转染效率与细胞种类直接相关，可能与细胞生理状态变化有关。32 PAMAMDNA复合物研究PAMAM不改变DNA的结构且能保证DNA的活性，PAMAMDN

13、A复合物在较大的pH值范围内和不同的缓冲液条件下均稳定存在。只有采用离子清洁剂SDS(十二烷基硫酸钠)时才能解离PAMAMDNA复合物。PAMAMDNA复合物对限制性内切酶也很稳定这就使得DNA在体内存活时间延长。Evans等N2研究表明，G3、G4这类较小的尺寸更适宜与DNA的结合。有人用PAMAM分子与放射性标记的寡核苷酸复合物转染细胞，4 d后在细胞的DNA提取物中仍可检测出放射活性，尽管比转染后0时的放射性强度低，而单纯DNA转染组在转染后0时的放射性强度只有复合物组的1300，其放射活性也于24 h内完全消失，提示复合物不仅能促进细胞对DNA的摄取，还能延长DNA在细胞内的存留时间。

14、此外，PAMAM还具有保护反义寡核苷酸不被血清或组织细胞中各种补体及酶所降解的作用。Bielinska等”研究发现，PAMAM可以介导Luc反义寡核苷酸或表达Luc反义基因的质粒在体外抑制Luc的表达。其抑制效率取决于核苷酸浓度、PAMAMDNA电荷比以及PAMAM的层数。而万方数据垦匿生塑匡堂王垂盘查塑!生!Q旦箜!鲞笙!翅堕!曼i!型垦磐：唑!型!：!生：!：坠：!使用脂质体转染试剂Lipofectamine时常由于其细胞毒性反应，难以发挥持续作用14。PAMAM却未见类似的细胞毒性报道。4 n帆M在体内基因转移中的应用41 PAMAM体内分布及其细胞毒性经Wistar小鼠静脉或腹腔内注射

15、I必标记的G3及G4代PAMAM 60 rain后99的PAMAM从循环中被清除掉，主要分布于肝脏(6090)b。类似的分布模式在含阴离子的所谓半代PAMAM(25，35，55)也可以见到，但清除速率和肝脏分布的比例略有减少116。Roberts等17J用不同剂量的G3、G5、G7代PAMAM(5xlO石-5x10 mmolkg)处理Swiss-Webster小鼠，结果显示。G3代在。肾脏中聚集最多，48 h达高峰。而G5和G7代主要分布于胰腺，高峰分别为24 h和2 h。主要经肾脏排出体外。PAMAM的体内分布差异可能与PAMAM的代数及注射方式的选择有关。同时经7，30 d及6个月的观察。

16、未见小鼠在体重、行为、宏观或微观组织上的异常，但G7组有1只小鼠经5x10。mmolkg剂量处理后于24 h死亡。丁俊军等|8经股四头肌给Balbc小鼠注射G3代PAMAM与GFP基因的复合物采用流式细胞术、Western blot和间接免疫荧光方法检测GFP的表达量和分布。结果发现在注射后2 h7 d内。在小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和肌肉中均可检测到GFP，而在肾中表达量相对较高。进一步研究显示，经PAMAM携带的恶性疟DNA疫苗诱导的抗体反应水平明显高于单纯裸DNA疫苗所诱导的抗体水平但其能透过血脑屏障并在脑组织中高表达已超出疫苗载体的适用范围。但由于体内转染的PAMAM分子浓度通常仅在

17、10-9-10一o mmolkg范围之内远远低于毒性剂量，因此人们认为PAMAM分子具有在体内应用的潜力。42 PAMAM在动物模型基因治疗中的应用MaruyamaTabata等【19j首次构建了含有EB病毒(EpsteinBarr virus，EBV)质粒的载体PAMAMEBV。将尤文肉瘤A4573基因导人一些有免疫缺陷鼠的体内致肿瘤生长，然后在肿瘤内注入PAMAMEBV载体，结果发现肿瘤的生长明显受抑，鼠的生存时间也明显延长。此外，静脉内注射PAMAMEBV载体亦可抑制肝细胞肿瘤Huh7所致的免疫缺陷鼠体内的肿瘤生长。在小鼠心脏移植模型中，将编码报告基因B半乳糖苷酶的质粒与G5 PAMAM

18、形成复合物并进行冠状动脉灌注，移植后714 d B半乳糖苷酶表达量最大。而G5 PAMAM介导的IL-10基因表现出更广泛和更长的表达可以有效改善心脏移植术后存活情况驯。另有研究对比了PAMAM G5载体介导B半乳糖苷酶及vlL-10表达质粒和裸质粒的转染差异。结果发现PAMAM载体基因转移率提高1 000倍。同时DNA需要量亦减少至160 E 8|。KukowskaLatallo等21研究表明由G9 PAMAM介导的pCFl CAT质粒经脉管内途径导人。可在肺薄壁组织(主要是肺泡内)表达，比裸DNA的转染效率高20-40倍且重复导入复合物可延长氯霉素乙酰转移酶基因表达16 d之久。在博来霉素

19、诱导的小鼠肺纤维化模型中。静脉注射G9 PAMAM与转化生长因子81(transforming growth factor 81，TGF一81)反义寡核苷酸复合物后，肺纤维化明显减轻。优于裸TGF一81反义寡核苷酸的作用。5结语总之，PAMAM作为一种相对安全、无毒、高效的新型非生物载体在生物医学领域有着极为广阔的应用前景。它使医学领域的许多研究可以在纳米规模上进行操作。并由此引出了“纳米医学(nanomedicine)”这一概念。尽管如此，仍有诸多问题尚待探讨。尤其是对多种PAMAM的具体毒理、生物相容性以及体内分布均需要作进一步深入的研究w-m。相信随着纳米技术的不断发展PAMAM设计和合

20、成手段的不断完善其最终进入临床应用成为现实，为人类疾病治疗开辟新的思路。参考文献1Vasir JK,Labhasetwar VPolymeric nanopartieles for genedeliveryJExpert Opin Drug Deliv2006，3(3)：325-3442Jevprasesphant R Penny JAttwood D，et a1Engineering ofdendrimer surfaces to enhance transepithelial transport andreduce eytotoxicityJPharm Res，2003，20(10)：15

21、43-15503Kitchens KM，Kolhatkar RB，Swaan PW，et a1Transport of poly(amidoamine)dendrimers acr06s Caeo-2 eeU monolayers：Influence of size，charge and fluorescent iabelingJPharm Res，2006，23(12)：281828264Wiwattanapatapee R Cacreno-Gomez B，Malik N，et a1AnionicPAMAM dendrimers rapidly cro$8 adult nd intestin

22、e in vitro：apotentialoraldeliverysystem?JPhannRes,2000,17(跏991-9985Arima HKihara FHiraymnn Fe1a1Enhancement of geneexpression by polyamidoamine dendrimer conjugates with alpha，beta-，and gamnm-cyclodextrinsJBioeonjug Chem,2001，12(4)：476-484 ，6赵维明，徐勇，王燕铭，等新型基因载体G5PAMAMD在前列腺癌HSV-tkGCV自杀基因系统中的应用J中国癌症杂志，

23、2007。17(3)：225-2307reixeira LA,Frieke CH，Bonorino cB，et a1An efficient genetransfer system for hematopoietie cell line using transient andstable vectorsJJ Biotechnol，200l，88(2)：159165万方数据垦匪生塑匡兰王垂苤查塑!堡!Q旦筮21鲞签塑墼旦i唑鲤娶篮：堡!型跫2Q鲤：!尘：!：理!：89101112131415Choi Y，Thomas T，Kotlyar叶et a1Synthesis and functional

24、evaluation of DNAassembled polyamidoamlne dendrimer clustersforcancercell-specifictargetingJChemBiok2005。12(1)：35-43Kono k Akiyama H，Takahashi Tet a1Transfection activity 0fpolyamidoamine dendrimers having hydrophobic amino acidresidues in the peripheryJBioconjug Chem，2005，16(1)：208214Choi JS，Nam K，

25、Park JY，et a1Enhanced transfection efficiencyof PAMAM dendrimer by surface modification with L-arginineJJ Control Release，2004，99(3)：445-456磁m JB，Choi JS，Nam K，et a1Enhanced transfeetion of primarycortical cultures using arginine-grafted PAMAM dendrimer,PAMAM-AgEJJ Control Release，2006，114(1)：110-11

26、7Evans HM，Ahmad A，Ewert k et a1Structural polymorphism ofDNA-dendrimercomplexesJPhys Bey Let4 2003,91m 075501Bielinska AU，Yen A。Wu Huaihang,et a1Application 0flllembrane-based dendrimerDNA complexes for solid phasetransfection in vitro and in vivoJBiomaterials，2000，21(9)：877887Hong S，Bielinska AU，Me

27、cke凡et a1Interaction of叫y(amidoamine)dendrimers with supported lipid bilayers and cells：hole formation and the relation to transportJBieconjug Chem，2004，15(4)：774=782Malik N，Wiwattanapalapec RKlopseh凡et a1Dendrimers：relationship betwsen structure and biocompatibility in vitro，andprehminary studies 0

28、11 the biodistribution of 125I-klbeuedpolyamidoamine dendrimers in vivoJJ Control Release，2000，161718192021222331l65(121：133148Wflbur DS，Pathare PMHandin DK et a1Biotin reagents forantibody pretargeting3Synthesis。radioiedinationand evaluationofbiotinylatedstarburstdendrirnersJBioconjugChem,1998，9惭81

29、3825Roberts JC。Bhalgat Ml(Zera RTPreliminary biologicalevaluation ofpolyamidoamine(PAMAM)Starborst dendrimersJJ Biomed Mater Res，1996，30(1)：53-65丁俊军。郭晨莹，蔡肩良，等Starbumt TIM PolyamidoamineDendrimers介导的绿色荧光蛋白基阂在小鼠体内的表达分布及对恶性疟DNA疫苗ES312免疫原性的影响J中国医学科学院学报，200527(4)：499503Maruyama-Tabata H，Harada Y，Matsumur

30、a Tet a1Effectivesuicide gone therapy in vivo by EBVbased plasmid vector coupledwith polyamidoamine dendrimerJGene Ther，2000，7(1)：53-60Wang Yinong，Boros P，Liu Jianhua,et a1DNAdendrimercomplexes mediate gene transfer into murine cardiac transplantsex vivoJMol Ther，2000，2(6)：602-608Kukowska-oJF，Raczka

31、 E，Quintalla A，et a1Intravascularand endobronchial DNA defivery to muJine lung tissue using anovel,nonviralvectorJHumGeneTher,2000,11(1 0)=1385-1395Lee CC，MacKay JA，Frechet JM，et a1Designing dendrimers forbiologicalapplicationsJNatBiotechnot,2005，23(1雄1517-152&Yang Hu，Kao WJDendrimers for pharmaceut

32、ical and biomedicalappliemon8JJ Biomater Sci Polym Ed，2006，17(12)：3-19(收稿日期：2008-0527)(上接第293页)89101112131415【16韩雪峰，杨大平郭铁芳，等新型天然血管支架：猪胸主动脉脱细胞血管基质的制备J中国临床康复，2002，6(24)：36963696范恒华，张伯勋，梁向党，等脱细胞血管基质制备和异体移植的实验研究J中华外科杂志，2005，43(13)：870-874余喜讯。万昌秀陈槐卿生物性组织工程血管支架的制备及其内皮化研究JItJll大学学报(3-程科学版)，2005，37(6)：97101

33、殷猛，刘锦纷，藤里俊哉等超高压脱细胞技术制备组织工程带瓣血管支架J中国组织工程研究与临床康复，2008，12(19)：3605-3608Shinoka T，ShumTim D，Ma PX，et a1Creation of viablepulmonary artery autognffts through tissue engineeringJJ ThoracCardiovasc Surg,1998，115(3)：536-545；discussion 545536Niklsson LE，Gao J，Abbott WM，et a1Functional arteries grownin vitroJ

34、Science，1999，284(5413)：489-493Saboo S，Ouyang H，Goh JC，et aL Characterization of a novelpolymeric scaffold for potential application in tendonl_igmnenttissue engineeringEJTissue Eng，2006，12(1)：9199Opitz F，SchenkeL丑yland k Richter Wet a1Tissue engineerillgofovine aortic blood vessel substitutes using

35、applied shear stress andenzymaticallyderivedvascularsmoothmusclecellsJAnnBiomedEng，2004，32(2)：2122220Bfien FJ，Harley BA。Yarmas IV，et|1The effect of pore size17181920212223on cell adhesion in collagen-GAG scaffoldsJBiomaterials，2005，26(4)：433-441Fujita M，K6noshita Y，S砒o Eet a1Proliferation and differ

36、entia-tion of rat bone nlarrow stromal cells on poly(glyonlic acid)coHa-gcnspongeJTissueEng,200511(9一lo)：1346-1355He WeiYong TTec WE，et a1Fabrication and endothefializationof collagen-blended biodegradable polymer nanofibers：potentialvascular graft for blood vessel tissue engineeringJTissue Eng，2005

37、，l 1(910)：1574-1588Miller DcHaberstroh KMWebster TJMechanlsm(s)of increasedvaBcu1且F ceU adhesion on nanostructurecpoly(1actic-co-glycolieacid)ramsEJJ Biomed Mater Res A，200573(4)：476-484颜永年，刘海霞，熊卓，等细胞直接受控组装技术的实现与研究进展J科学通报，2005，50(11)：11591160Kinoehita&Konishi G，Takeuchi s，et a1Stereovectorcardiograminnde by stereolithographyJCardiology，1990，77(4)：269271Sodian凡Loebe M，Hein A，et a1Application of stereolithographyfor scaffold fabrication for tissue engineered heart valvesJASAl0 J，2002，48(1)：12-16鲜苏琴柴枫，赵铱民，等成骨细胞在快速成型技术构建的骨支架材料中粘附的实验研究J华西口腔医学杂志，2004，22(3)：248251(收稿日期：200805瑚)万方数据