核酶在疾病基因治疗中的应用研究进展.pdf

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1、中国畜牧兽医 2011年第38卷第4期 兽医临床 217核酶在疾病基因治疗中的应用研究进展崔力凡，吴国华张强(中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 730046)摘要：核酶是一类具有催化活性的小RNA分子，可以特异性地识别并结合目标基因mRNA，使该mRNA断裂失活，从而阻断或降低目标基因的表达，起到基因沉默的作用。此外。核酶不会对细胞基因组产生任何副作用，因此核酶作为一种既安全又有效的分子生物学工具受到越来越多研究者的关注。核酶的这一特性可用于基因治疗针对某些病原或肿瘤的基因设计特异性核酶，并将其导入细胞以阻断或降低这些基因在细胞内的表达，最终达到抑制病原增殖、肿瘤扩散的目的。作者就近几年

2、核酶在人类和动物疾病治疗中的应用研究进展作一综述。关键词：核酶；RNA；基因治疗中图分类号：Q522 文献标识码：A 文章编号：16717236(2011)04一0217一04在自然界中，有相当一部分RNA具有催化作用，这些RNA被称为核酶(ribozyme)。核酶的发现，不仅颠覆了酶的本质是蛋白质这一概念，还引出了“RNA世界”的假说；该假说认为RNA在生命进化的早期阶段具有非常重要的作用。20世纪80年代初，由科罗拉多大学的Cech在研究四膜虫rRNA前体的剪接时发现其26S RNA具有自我催化活性，由此提出了核酶的概念；时隔不久，耶鲁大学的A1tman在大肠杆菌中发现了RNase P。C

3、ech和Altman于1989年共同获得了诺贝尔化学奖(洪卫国等，2000)。核酶主要分为以下几类：I类内含子，也称第1型自我剪接(selfsplicing)核酶；类内含子，也称第2型自我剪接核酶；自我剪切型核酶，包括发夹状核酶、锤头状核酶、丁型肝炎病毒(HDV)核酶及链孢霉线粒体vsRNA自我剪切核酶等；异体(分子间)剪切型核酶，如RNase P(Haseloff等，1989)。其中锤头状核酶和发夹状核酶结构较其他核酶简单，也是目前研究较多的两种核酶。锤头状核酶活性中心由11个保守的核苷酸和数目不等的非保守核苷酸序列组成，即：5GAAA(N)nNUH(N)nCUGA(N)nGA3，它能结合含

4、有NUH序列的底物RNA，其中N代表A、C、G，但更偏好G；H代表C、U、A，但更偏好C。在其活性中心两端含有收稿日期：2010lO一18作者简介：崔力凡(1984一)，男，新疆人，硕士生，研究方向：动物病毒分子生物学。通信作者：张强(1972一)，副研究员，硕士生导师，主要从事动物病毒分子免疫研究。E-mail：qzhan91616sohucom基金项目：甘肃省重大专项(092NKDA032)；农业部转基因生物新品种培育重大专项(2009zX08008一010B)。与底物RNA结合位点NUH两侧互补的序列。经变构、化学修饰、催化中心与金属离子相互作用等一系列变化，核酶的三级结构最终形成，在同

5、时具备适合的底物及核酶正确折叠的条件下，核酶发挥其催化活性，切割底物RNA，使底物RNA断裂失活。随着生物技术的进步及研究的不断深入，核酶的潜在应用价值已被越来越多的研究者关注。1核酶在人类疾病治疗中构应用11核酶对病毒性疾病的治疗111 对艾滋病的治疗 获得性免疫缺陷综合症(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)又称艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的，HIV主要攻击T淋巴细胞，破坏机体的免疫系统，使抗病能力降低甚至丧失，最终导致死亡。迄今为止尚无一种十分有效的方法治疗艾滋病，而核酶算

6、是治疗艾滋病的一种理想的基因治疗药物。Wongstaal等(1998)利用一发卡型核酶抑制HIv-1基因表达，并率先进入一斯临床试验；用带有发夹状核酶的载体体外转染患者的T细胞，然后再将这些T细胞重新输入到患者体内，结果显示患者体内HIv-1的滴度降低。在近期的二期临床试验中，Mitsuyasu等(2009)用逆转录病毒载体将抗HIV核酶导入到造血干细胞中，然后将造血干细胞注入到74名感染HIV的患者体内，结果有38名患者携带了该种疗法所使用的完整拷贝。研究结果发现，CCR5(chemokine(c-c motif)receptor 5)是HIV一1 R5毒株的重要细胞复合受体之一，该受体在H

7、IV一1感染初期起着重要的作用，但是它的缺失对宿主而言是无关紧要的，因此万方数据218 兽医临床 中国畜牧兽医 2011年第38卷第4期CCR5可作为核酶切割的理想靶点。Feng等(2000)针对HIV一1 R5毒株设计了发夹状核酶，并用重组腺相关病毒载体(rAAV)将其转入到PMl细胞中，经筛选得到R514核酶，试验结果显示表达R514核酶的PMl细胞中p24抗原的表达量降低了90以上，细胞中的CCR5 mRNA及细胞表面的CCR5显著减少，表明核酶有效地保护了被HIV一1R5毒株感染的细胞。Li等(2005)将1个抗CCR5的核酶基因克隆入含有U6 Pol启动子的复制缺陷型慢病毒载体中，然

8、后用此载体转染CD34+造血祖细胞，结果证明这种组合载体能长期抑制HIV的复制。除HIv-1 CCR5外，5 7长末端重复序列(10ngterminalrepeat，LTR)及前导序列、f口基因、声oZ基因、驷g基因、P挖u基因、挖P，基因、r已口基因等都可作为核酶作用的靶基因(张丽娜等，2007)。因此，该方法提供了一种既安全又有希望的治疗此种传染病的基因疗法。112 核酶对乙型肝炎的治疗 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)属嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，是一种逆转录病毒；其生活史可简单概括为HBV进入肝细胞一在宿主酶作用下以负链DNA为模板合成正链DNA

9、一形成共价闭合环状DNA(cccDNA)一在宿主RNA聚合酶作用下合成mRNA(亦称前基因组RNA，pgRNA)一在HBV逆转录酶作用下合成负链DNA一在HBV DNA聚合酶作用下合成正链DNA一形成子代闭合环状DNA。由于HBV的复制必须经过RNA的过程，所以可设计特异性核酶用于切割RNA，从而阻断HBV的复制过程。Fritz等(1992)合成了针对HBV pgRNA的3个不同的核酶，来直接作用于经体外转录获得的HBV的pgRNA，结果显示这3个核酶都能准确地切割底物RNA，表明HBV RNA易被核酶切割。栾中华等(2005)将HDV核酶基因序列构建到原核载体中，并转染细胞，通过ELISA检

10、测和定量PCR测定载体的抑制效果，结果筛选出了两种抑制效率高的HDV核酶，抑制率达68。王传玺等(2007)将HDV核酶基因转入重组逆转录病毒载体pMSCVU6中，运用脂质体转染细胞，嘌呤霉素筛选稳定细胞株等方法，成功构建了重组逆转录病毒载体，在包装细胞系中能生产高滴度的逆转录病毒，能有效抑制HepG2215细胞内HBV的复制，为HBV的基因治疗提供了试验数据。Wang等(2010)在含有多聚人血清白蛋白(pHSA)及不含pHSA的情况下，将携带HDV核酶的helper-free重组逆转录病毒载体转入人肝癌细胞中，结果显示在pHSA存在的情况下，此种载体的转导能力高于不含pHSA时的转导能力。

11、而且，在含有pHSA的情况下HBsAg和HBeAg的水平明显降低。该研究说明，携带有HDV核酶的重组逆转录病毒载体在以HepG2215为转染目标时具有特异性的HBV切割活性。12核酶的抗肿瘤作用121 针对多药耐药性基因设计核酶 多药耐药性(multidrug resistnce，MDR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物表现出耐药性，同时对其他许多结构不同、作用靶点亦不相同的化疗药物也表现出交叉耐药的现象，是通过化疗药物治疗肿瘤急需突破的一大难题。Hiroyuki(1993)设计了一个能特异性切割MBRl mRNA序列第179位密码子的锤头状核酶，并在体外对MDRl mRNA进行切割，结果显示该锤头

12、状核酶是一种潜在的有用工具，它可切割MDRl mRNA且使MDR恢复显性。Wang等(2003)设计并合成一个抗MDRl的锤头状核酶，并由一个含有RNA聚合酶启动子的逆转录病毒载体将其输送到Pgpoverproducing人肝癌细胞系HepG2中；运用实时定量PCR、半定量RTPCR及Western blotting等方法检测了HepG2多药耐药性细胞系和转染了锤头状核酶的HepG2；此外，还尝试用MTT分析检测了这些转染了核酶细胞的敏感度，以及运用若丹明123(Rhl23)测试Pgp的功能；结果显示转染了锤头状核酶的细胞变得对阿霉素敏感，并伴随MDRl表达量的降低。这说明无论用逆转录病毒载体

13、还是用脂质体转染抗MDRl的核酶都有可能有选择的适用于MDR的治疗。Gao等(2007)在体外成功地使重组人核酶的pEGFPRZmuc仅在乳腺癌细胞中表达，而在非乳腺癌细胞中不表达；化学敏感性评估结果显示在经转染的细胞中，对阿霉素的抗药性降低了15倍，对长春花碱的抗药性降低了32倍，表明在体外培养的人乳腺癌细胞中pEGFPRZmuc逆转MDR是有效的且具有选择性。122 针对血管内皮生长因子基因设计核酶 血管内皮生长因子(vascular epitheliaI growth factor，VEGF)是一种重要的促血管生成调控因子。目前万方数据中围畜牧兽医 2011年第38卷第4期 兽医临床 2

14、19为止，研究者发现它具有最强大的功能，并且作用也最直接(Tischer等，1991)。研究结果表明，肿瘤的生成和转移与新血管的增生呈正相关，肿瘤组织若在无血管侵入的状态下，就会由于缺乏营养供给而坏死。因此，抑制VEGF成为治疗肿瘤的重要手段。李晶等(2005)首先对VEGF的mRNA进行二级结构分析，然后根据mRNA二级结构设计了4个锤头状核酶，并将这4个核酶连接到pGval载体上。经体外转录和试管内切割筛选出3个有效的核酶，而这3个核酶的切割位点都位于VEGF mRNA二级结构的暴露区；再将筛选出的3个有效核酶表达质粒与VEGFLUC模板质粒瞬时共转染人SMMC一7721肝癌细胞，结果显示

15、这3种核酶和VEGFLUC水平分别降低到对照的814，566和691；表明这3个锤头状核酶在RNA水平可有效地抑制VEGF。刘春宇(2007)针对人VEGF设计了发夹状核酶，并构建载体pcDNA31+RZ；然后用该载体转染ECV304细胞，用RTPCR、MTT法、流式细胞术及ELISA方法检测该发夹状核酶在细胞中对VEGF是否有效；结果显示核酶基因能在ECV304细胞中转录，并能明显下调VEGF的表达，说明这种抗人VEGF的发夹状核酶在细胞水平能抑制VEGF的表达，为通过核酶抑制VEGF的表达来治疗肿瘤提供了进一步的试验依据。2核酶在动物疾病治疗中的应用21核酶对动物病毒病的治疗 王敏华等(1

16、994)将抗猪瘟病毒基因组P80编码区的锤头状核酶基因插入到质粒pBluescript中，构成pBHR重组质粒，又将羊金属巯因启动子(oMT-promoter)插入到pBHR中，成功构建重组质粒poMHR。王敏华等(1996)将重组质粒pMH R3。通过显微注射的方法导入兔原核胚的雄原核中，将导入基因胚移植给受体兔，最终得到6只整合有外源目的基因的转基因兔中，有4只能完全或部分抵抗HCV弱毒攻击。ZOU等(2003)针对鹅副黏病毒F基因设计了锤头状核酶RzF598，并将该核酶基因连入真核表达载体pcDNA3上，然后用该重组质粒转染鸡胚成纤维细胞，以pcDNA3空质粒和无效突变体dRzF598重

17、组质粒作对照；结果显示转染成功并表达了核酶RzF598的细胞对病毒的抵抗能力大大提高，细胞成活率高达80以上，而对照组细胞的成活率仅5左右。可见，核酶应用于兽医学研究已有一定成效。22核酶对动物寄生虫病的治疗 近几年，随着核酶在动物病毒病治疗中研究的深入，许多人开始尝试将核酶应用于动物寄生虫病的研究当中。陈丽凤等(2007)为研究犬贾第虫滋养体核仁功能性蛋白KRRl对贾第虫preRNA合成的影响，用犬贾第虫病毒(Giardia canis virus，GCV)作为转染载体，将两端携带反义KRRl基因的锤头状核酶插入到载体中，构建出两种重组质粒KRzS和KRzL；然后用实时荧光定量RTPCR法检

18、测核酶对KRRl基因mRNA的切割活性；结果显示KRzS、KRzL转录体对KRRl基因体外转录RNA切割效率分别为74o和811，而对照组仅为12O，说明贾第虫病毒介导的锤头状核酶能有效切割KRRl基因的体外转录体。曹利静等(2008)根据蓝氏贾第虫能量代谢中的关键酶丙酮酸磷酸双激酶(pyruvatephosphate dikinase，PPDK)的基因序列设计并合成了其特异性反义锤头状核酶，并将其连接到犬贾第虫(GCV)病毒载体上，构建了重组载体pGCV634H52174，用该载体的体外转录产物转染贾第虫滋养体，然后用RTPCR检测核酶对靶mRNA的切割作用，结果显示该重组载体的体外转录产物

19、对虫体细胞内编码PPDK的mRNA有切割作用。3小结与展望核酶能切割致病基因的mRNA，通过使其mRNA断裂来抑制这些致病基因的翻译及表达，从而达到预防及治疗疾病的目的；而且核酶具有高度的特异性，它只对能与其互补的mRNA发挥切割作用，而对宿主细胞没有任何副作用，因此它是极安全的基因治疗工具。然而，要将核酶真正应用于临床治疗，还有许多问题有待解决：核酶的本质是RNA分子，极易被RNA酶降解，因此，如何能提高核酶的稳定性成为备受关注的热点问题。目前主要是通过化学修饰方法在核酶的骨架上添加基团(如甲氧基、烯丙基等)来提高其稳定性，而不影响其催化活性。要使核酶发挥最佳的催化活性，必须解决时间和空间问

20、题，既要使核酶在合适的时间表达，还要使核酶及其切割底物在细胞的某一特定空间相互作用，目前这还没有找到解决这一问题十分有效的途径。核酶的催化作用还依赖于病毒的滴度(邹建，2003)。在病毒滴度低(45 l0910 TCIDs。)的时候其切割活性明显，病毒滴度较高(55 l0910TCID。)时，其切割活性显著降低，这可能和反义RNA浓度有一定关系。综上所述，核酶是一种十分有前景的基因治疗工具，将会在未来的疾病治疗中万方数据 220 兽医临床 中国畜牧兽医 2011年第38卷第4期发挥巨大的作用。参考文献1王传玺，韩金祥，鲁艳芹，等重组HDV核酶逆转录病毒的生产及对HBV抑制效率的测定J山东大学学

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30、，35(9)：80l805AdVance in Study on Gene Therapy of Diseases by Ri bozymesCUI Lifan，WU Guo-hua，ZHANG Qiang(Lanzhou Vete“nary Research lnstitute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046，China)AbStnd：Ribozymes are cataIytically active smaU RNA molecules，which can specifically recognize and

31、 bind mRNA of thetarget gene，and make it fractured and inactivated，thereby blocking or reducing the expression of target genes，and play a role asgene silencing Besides，ribozymes do not have any adverse effect to cell genomes，so ribozymes as a safe and effective molecularbiology tool are increasin91y

32、 concerned These properties of ribozymes can be used for gene therapy For certain pathogens ortumor genes，design specific“bozymes and import them into cens to block or reduce the expression of these genes in cells，ultimately inhibiting pathogen multiplication and tumor proliferatiom This article has reviewed the study progress on the treatmentof hun协n and animal disease using ribozymes in recent yearsKey words：ribozyme；RNA；gene therapy万方数据