胰腺癌基因治疗的现状与展望.pdf

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1、主堡匠妲窆E登苤查；!至!旦箍!鲞筮!塑坠i!旦!堕!堡i!i!z墨坚堡!丛!尘!塑!y!丛!：!胰腺癌基因治疗的现状与展望张太平赵玉沛相对于疾病的传统治疗方式，基因治疗是一个年轻而又充满活力的研究领域。从1989年美国科学家Rosenberg等开始第一个人类基因治疗临床试验至今，虽然仅有17年的历史，但基因治疗无论从基础研究到临床试验，都获得了长足进展u2。据基因医学杂志(J Gene Med)临床试验数据库统计，截至2006年7月31日，全球27个国家和地区已完成、正在进行或已经批准的基因治疗临床试验项目共1192项，主要集中在肿瘤(66)、遗传性疾病(98)和心血管疾病(83)等方面。通

2、过PubMed检索有关基因治疗的文献，结果显示1989年收录相关文献仅106篇，以后逐年增加，2000年起达每年3000篇左右，短短10余年增长约30倍。由此可以看出，基因治疗目前虽不完全成熟，但相关学者研究热情丝毫未减，仍在进行不懈的探索。对许多目前尚无有效治疗方法或疗效并不满意的疾病而言，基因治疗是其获得治愈的潜在希望。与其它腹部肿瘤相比，胰腺癌是最难早期发现、恶性程度最高和预后最差的肿瘤。根治性手术切除是胰腺癌病人获得长期存活的唯一希望。但80以上病人就诊时已失去了根治性切除的机会，而且胰腺癌对现有的化疗、放疗及免疫治疗均不敏感。大量的文献资料表明，在过去20年中其总的5年生存率无显著变

3、化，仍在5以下3。从1999年开始，德国、英国和美国陆续批准了8个胰腺癌基因治疗项目进入工期临床试验，3项已经完成，获得了有关安全性及有效性的初步数据(wwwwileycomukgenemedclinical)。本文就近年来基因治疗载体系统的发展，胰腺癌的分子生物学和在基因治疗中的应用做简要介绍，并对其前景加以展望。一、基因治疗的载体系统基因治疗的首要问题是寻找能将目的基因安全有效地导入细胞或体内，并根据治疗需要长期表达基金项目：本课题受国家自然科学基金资助(项目批准号：30571812)作者单位：100730北京市，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院外科专题笔谈的途径。目前常用的方式

4、有病毒载体，非病毒载体和物理方法。利用基因重组技术将目的基因组装到病毒载体，然后通过各种途径使其在体内表达有治疗作用的基因产物，是基因转移最常用的方法。已经进行的基因治疗临床试验中约70使用病毒载体，主要有逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒和腺相关病毒等36。1逆转录病毒载体：是第一个用于基因治疗的载体，目前占全部临床试验用载体的256。逆转录病毒是一种具有外壳的单链RNA病毒，基因组包括编码长末端重复序列(LTRs)，以及gag，pol，env和psi的基因。Gag和pol基因编码核心蛋白，env基因编码外壳蛋白，psi基因编码病毒的包装信号。当逆转录病毒感染宿主细胞后，病

5、毒内容物释放入细胞浆内，在反转录酶的作用下将RNA转录为DNA，并随机整合到宿主的染色体。当构建重组逆转录病毒载体时，病毒的gag，pol，env基因将被去除，代之以目的基因，形成复制缺陷的逆转录病毒载体，病毒的免疫原性明显降低。这种载体的包装能力为8 kb，当制备载体时，包装细胞系将提供被去除基因编码的蛋白，生产出有感染能力但不能进行复制的逆转录病毒颗粒。逆转录病毒载体的缺点是仅能感染处于分裂的细胞，而且能够制备的最大滴度是108病毒颗粒ml，难以满足大规模应用的需要。随着对逆转录病毒的深入研究，这些缺点有望得到改进68。这种改造使载体的感染谱明显扩大，载体颗粒的稳定性显著增加，有利于制备高

6、滴度病毒载体。由于逆转录病毒载体随机插入宿主细胞的染色体，用于基因治疗时，存在着破坏人体正常基因功能，以及激活原癌基因诱发肿瘤形成的危险性。2腺病毒载体：腺病毒载体也是基因治疗最常用的载体之一，占全部临床试验用载体的255。腺病毒是拥有二十面体蛋白外壳的线性双链DNA病毒，基因组大小约为36 kb，目前己发现的腺病毒血清型至少有46种，用于基因治疗的主要是5型腺病毒。腺病毒通过与靶细胞表面的柯萨奇腺病毒受万方数据主堡匪熙丛型盘查!芏!旦筮!鲞箜!塑堡堕里旦!P!i!堕!z塾堡!丛!虫!y!：!盟垒：；体(CAR)结合而被摄取进入胞内，并最终被转运至细胞核。病毒DNA在细胞核内以附加体形式存在，

7、并不整合到宿主细胞的染色体。但病毒可以在细胞核内复制和组装，造成细胞裂解释放出子代病毒。腺病毒载体的优点是感染谱广，可感染分裂和非分裂细胞；转导效率高；能够稳定地制备出高滴度的载体。但也存在着表达时间短，诱发机体免疫反应等缺点，当需要反复使用时可产生中和抗体，降低治疗效果。针对腺病毒载体的缺点，研究者不断对其进行改造，去除更多的病毒基因，以降低免疫原性，同时显著增加其包装目的基因的能力。腺病毒载体研究最重要的进展是辅助病毒依赖性腺病毒载体(H口Ads)的构建，该载体去除了所有的病毒基因，包装能力增加至30 kb，免疫原性下降，表达时间延长，显示了腺病毒载体在需长期表达的基因治疗中的应用前景。3

8、腺相关病毒载体：腺相关病毒(AAV)是一种单链DNA细小病毒，需要其它病毒(如腺病毒)基因产物的辅助才能进行复制。目前已经分离出8种AAV的血清型，其中对2型的研究最为广泛、详尽，并且已作为基因治疗载体应用于临床试验。AAV可以感染分裂和非分裂细胞，具有广泛的组织亲嗜性，重组AAV载体所携带的目的基因可以在脑、肝、肺、肌肉、角膜和胰腺等组织中长期表达9。目前尚未发现AAV有致病性，也不会诱发细胞免疫反应，其包装能力约为47 kb。在已进行的临床试验中，rAAV已将人类第凝血因子成功表达于血友病乙病人的肌肉和肝脏，目前正在进行有关肺囊性纤维化、肌肉萎缩和几种中枢神经系统疾病的临床试验，上述临床试

9、验已初步证明了rAAV的安全性。特别是1999年利用腺病毒载体基因治疗导致病人死亡，以及2002年发现以逆转录病毒为载体基因治疗联合免疫缺陷病人，诱发白血病样疾病后，基因治疗的安全性更加受到关注6。rAAV也成为最有希望的病毒载体之一，对其载体进行改造，研究不同血清型AAV的免疫及生物学特性，是近年来AAV载体的研究热点。主要进展有将AAV由单链改造为双链病毒，使其表达能力提高10100倍，以及将一个表达盒分为两个载体，增加其表达能力10。4慢病毒载体：慢病毒是逆转录病毒家族的成员，它可以在非分裂细胞中复制，如人类免疫缺陷病毒(HIV)和非病原性的马传染性贫血病毒(EIAV)等。经过基因工程改

10、造的慢病毒载体通常外壳蛋白已被水泡口炎病毒(VSV)的G蛋白所取代，研究较多的是来源于工型人类免疫缺陷病毒(HIVl)的慢病毒载体。通过去除长末端重复序列下游的调节元件可以使包装信号无法转录，从而制成自我灭活载体，进一步提高了载体的安全性。慢病毒载体具有免疫反应弱、感染谱广、长期表达和能容纳较大基因等优点，利用该载体进行的基因治疗已经进入临床试验。与逆转录病毒载体一样，慢病毒载体随机整合入宿主染色体，有诱发肿瘤的潜在风险。5单纯疱疹病毒(HSV)载体：单纯疱疹病毒载体可以通过去除部分或全部病毒的5个早期基因(ICP0，ICP4，ICP22，ICP27和ICP47)来制备，这些基因是病毒裂解感染

11、和其它全部病毒基因表达所需要的。但ICPo基因产物在具有细胞毒性的同时，还可以使目的基因高水平持续表达。在载体中保留有突变的ICPo基因，可以使载体有效表达目的基因，同时消除了细胞毒性。HSV是双链DNA病毒，重组HSV载体的包装能力可达40150 kb，位居病毒载体之首。其主要缺点是诱发免疫反应，而且不能长期表达。6非病毒载体：主要有裸DNA和脂质体。将裸DNA直接注入肿瘤或某些特定的组织是最简单的基因转移方法，在已进行的临床试验中约16病人采用此种方法，其缺点是易于被组织清除，转导效率较低。脂质体带正电荷，通过静电作用与带负电荷的DNA结合形成复合体，这种复合体的总电荷仍然为正电荷，可以与

12、细胞膜表面的负电荷结合进入细胞内。虽然非病毒载体相对简单、安全性好，但其在转导效率、特异性和长期表达等方面均不及病毒载体，有待进一步完善。二、胰腺癌的分子生物学有关胰腺癌分子生物学特点的研究在过去20年中取得了显著的进展，主要集中在原癌基因、抑癌基因和生长因子等3个方面351112。1原癌基因：基因突变可使原癌基因的生物活性增强从而诱发肿瘤。与胰腺癌相关的原癌基因主要有K_RAS和LSMl。kRAS编码的P21蛋白作用于细胞信号转导过程，调节细胞的生长、增生与分化。通过PCR扩增，7595的胰腺癌病人可在血、胆汁、粪便或穿刺标本中检测到KRAS突变，主要是位于12密码子的突变。因此K_RAS是

13、胰腺癌基因治疗的重要靶点之一。有文献报道LSMl在胰腺癌中的阳性率可达88，对于维持肿瘤的恶性表型非常重要。万方数据主堡匪胆2b型苤查；塑!至!旦筮!i鲞箜!塑暨垫旦!望!蔓!i!型塾堡!坠!堡垫!塑!y!：!i!盟鱼；2抑癌基因：抑癌基因的失活将使细胞增殖失去重要的负调节，从而使细胞生长失控向恶性化发展。已经发现的与胰腺癌发病相关的抑癌基因有p53、INK4家族和DPC4SMAD4。p53编码的蛋白作为转录因子调节着一系列重要基因的表达，包括细胞周期调节、凋亡、分化、DNA监测和修复。p53突变在胰腺癌中的比例为40100。p16是周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂INK4家族中最早发现的一

14、种抑癌基因，正常情况下p16基因产物与CDK4复合体结合，阻止视网膜母细胞瘤(RB)蛋白的活化。p16基因的失活将使CDK4复合体这一水平的抑制作用丧失，导致细胞生长失控。胰腺癌中约有40的病人p16失活。DPC4SMAD4编码的蛋白对细胞表面受体TGF_B超家族的信号转导具有关键作用。3050的胰腺癌病人有此基因缺失。3生长因子：生长因子及其受体对胰腺癌的侵袭性和预后有着重要影响。与胰腺癌相关的主要有纤维母细胞生长因子(FGF)，表皮生长因子受体(EGFR)及配体，转化生长因子(TGF-p)超家族及其受体。FGF家族包括19个同源多肽生长因子，参与组织修复、有丝分裂和血管形成时的细胞分化。F

15、GFl5，7在一些胰腺癌中过表达。EGFR在多种实质性上皮源性肿瘤中，如胰腺癌、乳腺癌和大肠癌等均有过度表达和异常活化，与肿瘤的有丝分裂、凋亡抑制、细胞迁移和转移、血管形成，以及对常规细胞毒性治疗的抵抗均密切相关。EGFR的天然配体是EGF和TGFQ，当配体与受体结合后，两个EGFR单体形成同源二聚体，或者与另一个ErbB受体家族的成员形成异源二聚体，接着细胞内酪氨酸激酶结合区自磷酸化，通过细胞内RasRaf_MAPK和P13KAKT等信号转导通路，调节细胞的生长与存活1 3I。除了常规的细胞转导之外，EGFR可以进入细胞核发挥转录因子的作用，上调细胞的增生能力，导致细胞的生长失控和恶性化。T

16、GF-p受体在胰腺癌中过表达，并且与预后差相关。虽然TGF-p信号在正常情况下抑制表皮细胞的生长，但胰腺癌细胞对这些信号已经失去了反应性。三、胰腺癌基因治疗的策略与相关研究肿瘤基因治疗可以通过调控细胞内遗传物质来消灭癌细胞，例如恢复抑癌基因的功能或抑制活化的原癌基因。目前常用的策略有反义基因治疗、自杀基因治疗、免疫调节基因治疗、抗血管形成基因治疗以及肿瘤裂解病毒基因治疗等311|。1反义基因治疗：这种策略的目的是阻止肿瘤相关基因的转录与翻译，反义寡核苷酸以互补的形式与特定的DNA或RNA序列结合，从而阻止DNA的转录或RNA的翻译，使肿瘤基因无法表达。其缺点主要是特异性有限，核酶和RNA干扰技

17、术的发展和应用，以及与病毒载体的结合，有望使反义基因治疗更加特异，并且在体内长期发挥作用。由于KRAs基因突变在胰腺癌中最常见，许多反义基因治疗以其为靶点，体外实验表明，利用脂质体转染针对KRAS的反义寡核苷酸可以抑制胰腺癌细胞株的生长。利用腺病毒为载体，将一种能够竞争性抑制RAS功能的HRAS突变体导入体内，可以抑制裸鼠胰腺癌肝转移瘤的生长1 4I。2自杀基因治疗：亦称为基因定向酶药物前体疗法，首先利用载体将编码某种特定酶的基因导入肿瘤细胞，然后给予能被该酶选择性活化的药物前体治疗。因为该酶仅在肿瘤细胞中表达，因此肿瘤细胞中可聚集高浓度具有毒性的药物，从而直接杀伤肿瘤细胞或通过旁观者效应导致

18、瘤细胞死亡。研究较多的自杀基因治疗系统有HSVTKGCV和CD5一FC，在体外及动物实验中均可抑制胰腺癌细胞的生长u 5。3免疫调节基因治疗：与其它肿瘤一样，胰腺癌细胞的免疫原性低，容易逃脱宿主的免疫监控。利用DNA重组技术，可以增强瘤细胞的免疫原性，使机体的免疫系统更好地发挥抗肿瘤作用。或者使抗原呈递细胞(APC)表达特异的肿瘤抗原，如突变的RAs多肽，将其呈递给T细胞以增强免疫反应。细胞因子本身也能够抑制肿瘤的生长，但全身应用细胞因子有明显的毒副作用，瘤内直接注射编码细胞因子基因的载体可以在治疗肿瘤的同时，避免静脉应用免疫调节剂的副作用。另一种策略是将细胞因子受体基因导入肿瘤细胞，然后给予

19、细胞因子治疗，经过修饰的瘤细胞对细胞因子的敏感性明显增强16。4抗血管形成基因治疗：血管形成是肿瘤生长和转移的关键步骤之一，抑制血管形成治疗可使肿瘤缩小或处于休眠状态。但目前应用的血管形成抑制剂属蛋白制剂，费用昂贵，半衰期短，需长期重复注射。利用病毒载体表达抗血管形成基因能够达到一次注射，体内长期表达的作用。动物实验表明，抗血管抑素和内皮抑素基因治疗可使胰腺癌种植瘤和转移瘤缩小1 7|。5肿瘤裂解病毒基因治疗：将野生型病毒通过万方数据空堡旦王8旦窆E型苤查!至!旦筮!鲞筮!塑垦堕翌旦!E堕!堕!i!￥曼!g!坐!尘!塑!y!：!i!盟!：!改造，使其仅能在肿瘤细胞中复制，从而造成瘤细胞的裂解，

20、但对正常的细胞没有影响，这是肿瘤基因治疗的一种新策略。目前研究较多的是腺病毒和单纯疱疹病毒，还有一些天然的肿瘤选择性复制病毒，如纽卡斯尔病病毒、呼肠孤病毒及自主性细小病毒等。Tk是HSV一1复制所必需的，其水平在肿瘤细胞中较高，因此去除了Tk基因的HSV-l可在肿瘤细胞中选择性复制并杀灭肿瘤细胞。选择性复制腺病毒ONYX-015是一种E1辟55KD基因缺失腺病毒，E1昏55KD蛋白可与P53蛋白结合并使其失活，这是腺病毒复制过程中的所需条件之一，因此0NYX-015可在有P53缺陷的肿瘤细胞中复制。通过超声内镜将ONYX_015瘤内注射与静脉应用健择联合治疗胰腺癌，21例进展期病人中2例对治疗

21、有部分反应，2例有轻微反应，6例病情稳定，其余11例病情继续发展1 8|。虽然结果并不理想，但至少证明了此种基因治疗策略的可行性。另外，替代有突变的抑癌基因如p53、sMAD4；导入在胰腺癌中缺失的生长抑素受体亚型基因，以及与细胞凋亡有关的死亡受体配体基因等方法，均对胰腺癌细胞和种植瘤的生长有抑制作用1 9。四、问题与展望过去17年间，基因治疗领域取得了显著的进展，基础研究和临床试验齐头并举，而且吸引了许多生物和制药公司的参与，成为孕育着巨大商机的产业，可能成为未来10年医药领域增长最快的方向之一。基因治疗的发展同样也经历了许多困难和挫折，真正用于临床治疗尚需时日，研究者和生物技术公司都应清楚

22、地认识目前存在的问题，切忌急功近利。现有载体的免疫原性、安全性、转导效率和组织特异性均需进一步研究和完善，这是基因治疗的共性问题。未来应用于临床的载体，可能是非病毒载体与不同病毒载体优点的组合，根据不同治疗需要量体裁衣，使目的基因仅在特定组织表达，并能有效地调控表达水平与时间，实现基因治疗的个体化。相对于单基因缺陷所导致的遗传性疾病，胰腺癌的基因治疗更加具有挑战性。胰腺癌的发生发展是多种基因改变、多步骤的复杂过程，因此单一基因治疗难以奏效。针对不同的目的基因，选择相应的载体；寻找在胰腺癌中特异表达的启动子；以及联合基因治疗应是今后努力的方向。胰腺癌分子生物学研究的深入，以及病毒载体学、免疫学和

23、细胞生物学等相关学科的进步，将有助于推动胰腺癌基因治疗的发展，使其真正成为胰腺癌临床治疗的重要组成部分。参考文献1 Edelstein ML，Abedi MR，wiXon J，et aIGene therapy clinical trials world研de 1 9892004 an overview J Gene Medicine，2004，6：5976022Bhattacharyya M，Lemoine NR Gene therapy developmentsfor pancreatic cancer Best Pract Res Clin Gastroenterol，2006，20：2

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