冻干皮上划痕用鼠疫活菌苗制造及检定规程.doc

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1、冻干皮上划痕用鼠疫活菌苗制造及检定规程冻干皮上划痕用鼠疫活菌苗制造及检定规程本品系采用鼠疫菌弱毒菌株，经培育后冻干制成。用于预防鼠疫。1 1 菌种菌种1.1 菌种来源用弱毒的 EV 菌株，由中国药品生物制品检定所分发或经同意。1.2 菌种检定冻干菌种在生产前每年需要检查一次培养特性、生化特性、噬菌体裂解试验及安全性。1.2.1 培养特性在琼脂平皿上，37培育 4448 小时之菌落应为粗糙型，在肉汤中液面有薄菌膜，管底有沉淀物，肉汤透明。1.2.2 生化特性应分解葡萄糖，产酸不产气，石蕊牛乳轻度变红，在甘油培养基内不产酸不产气。1.2.3 噬菌体裂解试验将 EV 菌种涂于琼脂平皿上，加滴度为 1

2、0-6 以上的鼠疫噬菌体 1 滴，于 28培育 4448 小时，在噬菌体流过的地方应无本菌生长。1.2.4 安全试验用体重 300400g 豚鼠 3 只，每只皮下注射 120 亿菌（2830培育 4448 小时的培养物）。在注射后第 6 天解剖1 只，第 21 天解剖 2 只，检查注射部位、脾、肝、肺，并用脾、肝、肺及心血进行培育。其中心血和肺培育应无本菌生长。肉眼检查病变，注射部位可见充血，浸润变为脓疡，肝和脾可有丘疹状结节，肺部不应有鼠疫特异病变为安全试验合格。肺部如有显著病变时，应用同量豚鼠复试，若仍有显著病变时，菌种应废弃。1.2.5 免疫力试验用体得 200250g 的豚鼠 10 只

3、，每只皮下注射 70 万菌（2830培育 4448 小时的培养物）一次。于 2025 天后进行攻击，每只皮下感染鼠疫强毒菌 200 个 MLD。同时用 3组豚鼠作对照，每组 3 只，各组豚鼠皮下分别注射 0.5、1 及 2个 MLD 的毒菌。免疫组及对照组至少观察 25 天。免疫动物存活不少于 8 只，而对照动物注射 1 个及 2 个 MLD 全部死亡时，免疫力试验为合格。1.3 菌种保存菌种应冻干保存，冻干菌种保存于 28暗处。2 2 菌苗制造菌苗制造2.1 制造鼠疫活菌苗之实验室在生产期间应专用，不得作其他细菌工作，绝对禁止保存鼠疫毒菌。2.2 制造用培养基制造菌种可用 pH6.8 7.2

4、 的厚氏琼脂培养基或其他适宜的培养基。2.3 原液制造2.3.1 第 1 代菌种启开干燥菌种加入生理盐水溶解后，接种于厚氏琼脂培养基上，于 2830培育 4448 小时为第 1 代。放 28保存可使用半个月。2.3.2 第 2 代菌种用生理盐水将第 1 工菌种洗下，接种足够量的种子瓶，于2830培育 4448 小时为第 2 代，供大批生产用。不得用第3 代菌种生产。2.3.3 大量接种第 2 代菌种经肉眼检查无杂菌后，加入适量生理盐水洗下菌苔，制成均匀的菌悬液，用此菌悬液接种培养瓶，于2830培育 4448 小时后，逐瓶肉眼检查，有杂菌者废弃。2.3.4 采集用由蔗糖、明胶、硫脲、味精及尿素组

5、成的保护液洗下菌苔（洗菌前将凝固水倒去）或将菌苔刮入上述保护液内，制成原液。每瓶原液均应按生物制品无菌试验规程进行纯菌试验，不得有杂菌生长。2.3.5 合并、稀释、分装用 4 层纱布或绢布将纯菌试验合格之原液过滤合并，按中国细菌浊度标准比浊后用保护液稀释，使稀释后每人份含菌数7 亿9 亿。然后按 10 或 20 人份分装于安瓿，并进行冻干。采集至冻干，原液不得超过 7 天，合并后的原液应按生物制品无菌试验规程进行纯菌试验。2.4 菌苗分批同一日培育的原液于同一次冷冻干燥者为 1 批。如 1 批有数瓶，应分亚批。3 3 冻干冻干菌苗分装后应立即在-30以下进行冷冻。干燥时间可根据水含量及活菌数来

6、决定。干燥完毕后进行真空封口，亦可充氮封口。4 4 成品检定成品检定4.1 物理性状检查本品为白色或淡黄色疏松体。用真空测定器检查安瓿应为真空。菌苗水分含量不得超过 3%。加入生理盐水后应在半分钟内溶解成均匀悬液。4.2 浓度测定菌苗经稀释后，按中国细菌浊度标准（7 亿/ml）测定浓度。皮上划痕用菌苗每人份含菌数为 7 亿9 亿。4.3 活菌数测定由生产部门会同质量检定部门进行。每亚批取 3 支安瓿，加生理盐水溶解后，混匀比浊，稀释至 10 亿/ml。再按 10 倍系列稀释至 10-6。用 10-6 稀释度悬液接种 5 个平皿，每个平皿接种 0.1ml。涂匀后放 2830培育 23 天，计算活

7、菌数。冻干后活菌率不少于 45%为合格。如低于 45%时可复试，如仍不合格则该批菌苗应废弃。4.4 纯菌试验每批菌苗按生物制品无菌试验规程进行。5 5 菌落、菌形检查菌落、菌形检查应呈典型粗糙型菌落，涂片镜检，为革兰氏阴性杆菌。4.6 安全试验由生产部门会同质量检定部门进行。每亚批菌苗取 2 支安瓿，用生理盐水溶解后，用体重 300400g 豚鼠 2 只，每只皮下注射 120 亿菌，第 6 天称豚鼠体重（不应比原体重减轻 1/5以上）并取其中 1 只解剖，另 1 只观察到 21 天解剖。检查项目及要求均同 1.2.4 项。4.7 免疫力试验每 10 批菌苗抽检，10 批以下者每 35 年至少检查 1 次。由生产部门会同质量检定部门进行。用体重 250300g 豚鼠 10只，每只皮下注射 5000 万菌，注射后 2025 天以 200 个 MLD的鼠疫毒菌进行皮下攻击。同时有 3 组豚鼠作对照，每组 3 只，分别于各组豚鼠皮下注射 0.5、1 和 2 个 MLD。各组动物于注射后，观察 25 天。免疫动物活存不少于 8 只，而对照动物注射 1个和 2 个 MLD 全部死亡时，免疫力试验为合格。5 5 保存与效期保存与效期应保存于 28暗处。自冻干后活菌数检定合格之日起效期为 1 年。