提取测定淡水藻中叶绿素a的方法研究_万修志_第1章绪论_9_23.docx

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1、山东建筑大学硕士学位论文 第 1 章绪论 1.1概述 藻类是一种单细胞或多细胞的较低等植物，个体大小一般在 2-200um， 体 内含有叶绿素、叶黄素和胡萝卜素等物质。根据光合色素、个体形态、细胞结 构和生殖方式等将藻类分成 11个门，分别为蓝藻门、红藻门、裸藻门、绿藻门、 轮藻门、金藻门、硅藻门、甲藻门、褐藻门、黄藻门、隐藻门。 藻类通过光合作用吸收二氧化碳，并以盐类做养料而生长。在氮、磷等养 料物质丰富和流动缓慢的水中，阳光充足、水温较高时，藻类极易繁殖。藻类 在繁殖和生长的过程中要消耗大量的氧气，到了夜间由于缺氧极易造成藻类死 亡，而死亡的藻类常被分解成有毒物质，从而影响水的可利用性。藻

2、类进一步 过量繁殖会形成水华，水质更加恶化。当水华严重时，水面形成厚厚的蓝绿色 湖靛，散发出难闻的气味，破坏了健康平衡的水生生态系统。 早在十九世纪， Francis第一次报道动物因为饮用含蓝藻的水而死亡的事件 1 之后，国内外由于藻毒素引起的水生动物、鸟类、畜类甚至人类死亡的事件屡 次发生 M。 Schwimmer曾经报道了多起北美洲的湖泊、水库和池塘水因为藻毒 素而致使动物和 人中毒的事件 5。 Carmichael将淡水中有毒性的藻类确定为以下 7个属，即鱼腥藻属、微囊藻属、胶刺藻属、束丝藻属、腔球藻属、节球藻属和念 珠藻属 6。目前，世界上蓝藻水华发生的频率与严重程度都呈现迅猛的增长趋

3、 势，发生的地点遍布全球各地 71。欧洲、非洲、北美洲和南美洲的水源分别存 在不同程度的富营养化现象，亚太地区的水源处于富营养化状态 8的更多。 90 年代以来，我国淡水水体的富营养化状态更加严重， 60%的天然淡水湖泊有不 同程度的富营养化污染现象。除了云南滇池、江苏太湖和安徽巢湖三大淡水湖 泊 (国务院己经将这三个湖定为治理的重点 )已发生严重的淡水水华污染外，长 江、黄河中下游的许多湖泊和水库中也都相继发生了不同程度的蓝藻水华污染 现象并检测到了藻毒素的存在。目前，全国每年都有许多自来水厂因蓝藻暴发 而造成水源污染而被迫减产或停产，对市民的饮用水安全供给构成了越来越严 重的烕胁。面对天然

4、淡水水体富营养化程度日益加剧和蓝藻水华暴发越来越频 繁的局势，如何控制蓝藻的过量繁殖生长和有效去除藻毒素己成为我国乃至世 界环境科学领域的一个难题。其中，藻类的生物量测定是藻类生长、生理、生 山东建筑大学硕士学位论文 化、生态等方面研究的必要手段，其测定方法很多，有测干重法、叶绿素法、 浊度法、最大比生长速率法等，应用最多的是测叶绿素 a法。 叶绿素 a是水生态调查中必不可少的调查项目，是反映浮游植物生物量乃 至初级生产力水平的最直接有效的指标。浮游生物和水藻等活体生物的分布和 数量可以反映该区域的生态状况。浮游植物长期以来就被用作水质的生物指标， 特别对于大量水体及大面积水域而言，测定浮游植

5、物的物种和数量，对水质评 价有着更为重要的实用意义。研究人员可以根据对浮游生物和水藻的总数和分 布的了解，就可以得出有关该水域水质状况、生物构成以及生态状况等信息， 而叶绿素是现场观测中必不可少的测量参数。 本课题主要针对引黄供水系统的藻类污染特征，进行水质污染特性识别， 以及在线监测水藻等关键技术的研究，并在济南引黄供水系统进行应用示范。 探寻淡水藻中叶绿素 a的提取及测定新方法，使方法简便快捷、灵敏度高、准 确度好，且易于现场操作，最终实现在线监测。本课题的研究与应用将为引黄 供水系统水质风险识别及饮用水安全保障能力评估指标体系的构建提供有力的 技术支撑，因此本项目具有显著的经济、社会和环

6、境效益。 1.2叶绿素 a提取及测定方法进展 1.2.1叶绿素 a提取方法进展 目前应用较多的叶绿素 a提取方法主要有：直接浸泡提取法，浸泡研磨提取 法和超声波浸泡提取法。 1.2.1.1直接浸泡提取法 将藻类直接放入提取剂中浸泡提取叶绿素 a， 是最简单、也是应用最广泛的 提取方法之一，提取液再经分光光度法或者荧光法进行测定。常用的光合色素 提取试剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、 DMF等，其中丙酮是目前最常 使用于定量 测定叶绿素 a浓度的提取液，对各个种类浮游植物的叶绿素 a均有综合能力很强 的提取效果。 1.甲醇 (Methanol) 虽然目前国内外在色素提取溶剂的选择上最常用的仍然是丙酮

7、，但丙酮也 不是万能的，例如在提取某些蓝藻和绿藻时就不如甲醇，并且甲醇对某些浮游 植物色素的提取比丙酮更迅速、更完全。但是 1985年 Bowles和 Hains研究发现对 于某些淡水藻如蓝藻中的铜绿微囊藻、鱼腥藻、绿藻小球藻和硅藻来说，纯丙 山东建筑大学硕士学位论文 酮或丙酮：甲醇 =1 : 1的混合液的提取效率明显高于 90%或者纯甲醇。之后研究 人员还发现不同提取试剂对不同色素的提取效率有差异，而且没有一种复合试 剂对所有色素都适用。 1999年 Zapata和 Garrido在研究色谱一致性时发现用甲醇 提取极性色素时，会产生更尖锐的色谱峰 9。研究发现大多数色素在使用丙酮： 甲醇 =

8、1 : 1的混合液或 90%丙酮为提取溶剂处理样品的提取效果较好。所以，目 前在研究色素提取过程中，甲醇已经很少被作为主要的提取溶剂使用。 2. 乙醇 (Ethanol) 在迄今已知的色素提取溶剂中，乙醇是最安全的提取溶剂，但多被用于提取 淡水浮游植物的色素，对海洋浮游植物的提取应用较少。 1978年 Moed等研究表 明乙醇与甲醇提取效率相似，但 Arvola认为乙醇略差于甲醇 1Q。 1984年Sartory 和 Grobbelaar研究发现 90%乙醇和加入沸腾的纯甲醇提取一些淡水浮游植物叶 绿素时效果明显优于 90%丙酮和丙酮 -DMSO等体积混合溶液。 1987年 Jespersen

9、 等在提取淡水浮游植物色素时，发现室温提取 6h时乙醇的提取效率与甲醇相当， 但当提取大型海藻时，就必须 使用更长时间甚至要加热。而 2000年陈宇炜等用 80C90% 热乙醇于 80C 水浴萃取淡水浮游植物并与 Lorenzen单色丙酮提取法进 行比较，热乙醇法的测定结果明显高于丙酮法，而且标准偏差也较低。章宗涉、 张如美等人认为应该用乙醇代替丙酮提取叶绿素 a， 其两者提取效果相似且乙醇 的安全性高。 3. 丙酮 (Acetone) 1940年， Mackinney首先提出用丙酮做提取剂，并给出了叶绿素 a和 b的消光 系数，对叶绿素 a的提取做出了重大突破。 1941年，他又用 80%丙

10、酮作溶剂提取 燕麦和锦葵中的叶绿素 a和 b， 并研究出从 425-680nm波长下的叶绿素 a和b的消光 系数，并得出以下结论：叶绿素 a的最大吸收峰为 663nm， 叶绿素 b的最大吸收 峰为 645nm。 1949年， Amon用 80%的丙酮来提取菠菜苗的叶绿素并进行分光光 度法的测定，迄今为止，这个方法在国内外仍被广泛应用。 1952年，Richard等 用丙酮将样品浸泡 911测得叶绿素 a、 b和 c。 1960年 Vemon用 80%丙酮作溶剂用分 光光度法测定叶绿素 a、 叶绿素 b和脱镁叶绿素 a、 脱镁叶绿素b， 并得出了计算 公式。后来又经 Humphrey和 Woot

11、on在 1966年证实 90%两酮是提取海洋浮游植物 中叶绿素的一种理想溶剂。 1966年国际海洋研究科学委员会 (SCOR-UN-ESCO) 推荐使用将样品浸泡于 90%丙酮中低温过夜提取的方法 11，用丙酮和 90%丙酮 山东建筑大学硕士学位论文 作溶剂，测定叶绿素 a、 b和 c的吸收光谱的方法被广泛采纳， Jeffery和 Humphrey 研究出了计算叶绿素的光谱经验公式，并被后人所证实。到目前为止，以 90%丙 酮为溶剂的方法仍然在广泛使用。 4. 二甲基亚砜 (Dimethylsulfoxide,DMSO) 1979年 Hiscox等用 65 C的 DMSO浸泡提取天竺葵、柠檬和

12、豌豆的叶片以及 欧洲赤松松针的叶绿素，提取结果与 90%丙酮研磨法相当，并且叶绿素在 DMSO 中可稳定 5d以上。此法操作简单，溶剂浸透性强，引起了研究者的广泛关注。1976 年 ShoafSlLium的研究表明从硅藻和蓝藻中提取叶绿素时，发现 DMSO与 90%丙 酮的提取效果相当，但在提取绿藻时 DMSO表现得就比 90%丙酮优秀，对不同 种的绿藻 DMSO提取效率比 90%丙酮高 2到 60倍。 1980年 Bumison在光谱分析中 发现将样品在 65 C DMSO中浸泡后用 90%丙酮淋洗的效果比 90%丙酮研磨或只 使用 DMSO研磨的效果好得多，且 DMSO与 90%丙酮研磨法

13、间的偏差很小，混合 液用超声波处理后叶绿素测量值会增加 1/3。 20世纪 80年代此法在我国开始应用。 1984年胡文玉等用 DMSO在 65 C提取 菠菜叶的叶绿素的光谱与 90%丙酮提取液的结果基本一致，吸收峰完全相符， 与Arnon法一样灵敏。但有人研究证明 65 C时叶绿素受高温破坏使测量值偏低， 而且 DMSO提取液与丙酮提取液的吸收光谱 有差异 12，用丙酮法公式计算叶绿 素含量不妥。由于 DMSO气味难闻，粘度大，温度在 19 C下易结晶，限制了该 法的进一步推广。 5. N， N-二甲基甲酰胺 (N， N-dimethylformamide,DMF) 1968年 Volk和

14、Bishop使用 DMF从好酸性微细藻 Cyanidium中提取叶绿素。 1980年 Moran将 DMF用于黄瓜子叶叶绿素的提取，测定了叶绿素 a在 DMF中的光 谱图及 664.5nm处的消光系数，结果表明叶绿素能在 DMF中长期稳定存在，并且 用 DMF浸泡提取和研磨提取结果相差很小。研究者认为与 90%丙酮研磨法相比， 对于叶绿素含量较低的样品， DMF仍是一种提取效果非常出色的溶剂 。 Moran 和 Porth研究证明用 DMF提取测定完整植物细胞的叶绿素能取的很好的效果 13。 1982年 Moran测定了 DMF中的叶绿素 a、 b最大吸收波长的消光系数，并给出了 定量计算叶绿

15、素 a、 b和总叶绿素的公式 14。 DMF提取叶绿素的提取液和丙酮提 取叶绿素的提取液光学性质及其相似，可采用同样的测定条件进行分析 15。 DMF在提取淡水浮游植物时与甲醇、丙酮、 DMSO结果相似，但明显要比 90% 山东建筑大学硕士学位论文 丙酮高。 Suzuki等人用人工培养的藻和海洋浮游植物为提取对象，将 DMF和丙 酮在不同实验条件下的提取效果进行了全面的比较，为进一步推广该方法做出 了贡献。 1991年 Heyward用分光光度法分析微藻色素 DMF提取液时，发现它在 4C暗 处可存放 20d， 而叶绿素 a纯品在 5 C的 DMF溶剂中至少稳定 1个月。这表明叶绿 素在 DM

16、F中性质稳定。另外薄层色谱实验证明叶绿素的 DMF溶液在 5。或 -25。 可以稳定至少 24d。 1993年， Suzuki开始应用 DMF于 HPLC分析海洋藻类光合色 素，之后这种方法逐步推广开来。 1997年于志刚等在提取测定大型海洋叶绿素 a的新方法中提出丙酮提取液 的叶绿素浓度计算公式可直接用于 DMF提取液 16。 2001年潘欣等在研究 DMF提取微型藻叶绿素 a方法的改进中提出 DMF废水 浴短时间处理提取微藻细胞叶绿素 a是一种简单、快速、高效的提取方法 11。 6.混合溶剂 DMSO-丙酮： 1979年 Stauffer等认为 DMSO-丙酮的混合物更容易将叶绿素 从厚壁

17、细胞中提取出来。后来又有 研究人员对其进行了验证，而且证实 DMSO- 丙酮混合液的消光系数和光谱与 90%丙酮、 DMF相似。 1992年 Webb等在分析 Alberta的湖水时，同时使用 DMSO-90%丙酮 (2 : 3)、 DMF和 95%乙醇作提取剂， 分别用分光光度法和 HPLC进行测定，结果表明乙醇和 DMSO-丙酮适合提取硅 藻和蓝绿藻的叶绿素 a。 乙醇 -丙酮： 1984年陈福明等提出将丙酮、无水乙醇和蒸馏水按 4.5 : 4.5 : 1 比例混合配成混合液， 40 C黑暗条件下直接提取样品，按照 Arnon丙酮公式计算 叶绿素含量。但该法提取时间较长，提取液不稳定，受光

18、易氧化从而使测定值偏 低。 1985年张宪政将丙酮和无水乙醇等量混合直接提取样品，结果表明此法与 丙酮法吸收光谱一致，可以使用 Arnon公式进行计算 17。此法比前种混合液法 稳定，不易受光氧化，后人对此结果进行了验证。有人按照丙酮：乙醇 =2: 1 的比例混合直接提取农作物叶片效果比用 95%乙醇提取好。 2001年洪法水等在 提取菠菜叶的叶绿素时发现丙酮和乙醇等不同比例的混合提取效果比丙酮、乙 醇单独提取的效率略高，并进一步推测丙酮乙醇混合液提取叶绿素存在协同 效 应，而且在两者等摩尔混合时效果最好。这种协同萃取效应的机理有待进一步 山东建筑大学硕士学位论文 氯仿 -乙醇 (2 : 1)

19、、氯仿、溶于氢氧化钠溶液 (0.35mol/L)的吡啶 (2.1mol/L)、 溶于 85%甲醇的 2%氢氧化钾和 1.5mm I/L联二亚硫酸钠溶液以及溶于 85%甲醇 1.5mm l/L联二亚硫酸钠溶液等作为色素提取剂都曾被使用过，但由于自身的种 种缺陷未能广泛应用。 1.2.1.2浸泡研磨提取法 浸泡研磨提取法主要是用溶剂浸泡后，再通过研磨机械破碎植物细胞，使 溶剂更易进入细胞提取叶绿素 a。 早期的研磨法是使用聚四氟乙烯小锤在玻璃的 搅拌器中以 500r/min的转速将藻类细胞捣碎，让溶剂浸入。这种方法提取效率 低，溶剂容易损失，因而没有得到推广。 较常使用的研磨方法还有人工在玛瑙研钵

20、中研磨和在 20r/s的玻璃珠搅拌器 中研磨提取色素的方法 18。 1.2.1.3超声波浸泡提取法 超声波浸泡提取法主要是先通过超声波来破坏楦物细胞，然后用溶剂提取 色素。 1999年比利时科学家 Hilaire Thomas发明的 “ 克藻星 ” 系列产品，其主要目 的是解决开放性水域中的水藻问题。整个产品的特点集中体现为：一是对水藻 的快速杀灭；二是对藻类生长的抑制 19。 超声波浸泡在狭小的空间内可产生 20,000个大气压的压力，并可产生穿越 几个微米的震动波，产生的瞬间高温可达 10,000K。 1975年 Alliger使用超声波在 溶剂中形成破坏空穴使细胞破裂。研究者发现超声仪的

21、探针传输功率为 73.5W.cm-1时效果不如研磨法，而当功率达到 398W.cm4时效果优于研磨法。传 输功率大小很大程度上会影响提取时间的长短。使用大功率超声仪超声 lOmin 的操作会导致提取液温度上升和色素降解。 综上所述，将 DMF提取后的溶液再进行超声提取是最佳的提取方法，所有色 素的提取率几乎达到 100%。但由于 DMF的毒性太大，在测量大量样品时如海洋 调查中，还是最常用 90%丙酮提取。 因此，推荐超声波破碎与混合溶剂法联合使用。先将滤膜保存在液氮中增加 提取效率。再将滤膜放入溶剂中 C浸泡 24h后，用超声破碎进一步破坏藻细胞。 破碎过程要一直处于低温避光环境里以保证降解

22、的最小化。 浮游植物组成种类变化多样，细胞和色素特性也有所不同，很难定论哪一种 是最佳的提取方法。在研究者的不断努力下，色素提取手段和效率也会不断丰富 山东建筑大学硕士学位论文 和提尚。 1.2.2叶绿素 a测定方法研究现状 目前，测定浮游植物叶绿素 a的方法主要有高效液相色谱法 (HPLC法 )、分光 光度法和荧光光度法等。 国内外在该领域采用的叶绿素 a测定方法是国家环保总局水和废水监测分 析方法推荐的分光光度法，其优点： 灵敏度高； 仪器设备简单，操作简 便； 应用广泛。缺点 .准确度相对不高，研磨时丙酮极易挥发，对环境造成 污染。 荧光法测定水体中叶绿素 a的灵敏度、精密度和准确度较好

23、，而且具有简便 快捷的特点。缺点是有可能受非光合作用的影响、参数多。 1. HPLC法测定叶绿素 a含量发展现状 在 20世纪 70、 80年代薄层色谱分析发展的较为迅速，这使浮游植物的标 志色素可轻易分离，但是由于此项技术专业性太强、效率较低而没有被广泛应 用。 随着高效液相色谱在色谱分离方面的发展，尤其是反相色谱的发展，使高 效液相色谱在 20世纪 80年代得到快速发展，从此时起叶绿素就可以不受其降 解产物影响进行准确的定量分析。 HPLC方法可以从混合的浮游藻类种群中分 离 20多种类胡萝卜素。 到上世纪 90年代后使用单体 C8和聚合 C18柱以及含有吡啶成分的流动相 使分离色素的数目

24、大为增加，一次进样可分离 50多种色素及其衍生物。 Bianchi等人对 1990年在哈德逊河、 1995年在墨西哥湾和 1997年在波罗的海 研究中报道了用 HPLC方法对大型海藻的叶绿素分析。研究了大型海藻的色素组 成和比例，并以色素作为标识物表明大型海藻在食物链中的流向。 2. 分光光度法测定叶绿素 a含量发展现状 1999年汪志国、王静等 人用双波长分光光度法同时测定叶绿素 a、 b。 介绍 了同时测定叶绿素 a、 b的双波长分光光度法。该法不进行预分离，直接测定， 操作简便，结果与先分离、再以强氧化剂消解后分别测定镁离子浓度进而推算 叶绿素 a、 b浓度的原子吸收法有一定可比性，本法

25、具有进一步推广应用的价值 20 0 2002年张芯、刘洪林等人通过对用分光光度计测定叶绿素 a含量的两种方法 山东建筑大学硕士学位论文 的比较，选择出一种准确、合理的分析方法。针对该分析方法关于比色时间、 检测下限及最大取样量的确定问题进行了探讨 21。 2002年彭文彬、刘红瑛等人利用两种分光光度法测定浮游植物叶绿素 a的比 对试验，表明两种分光光度法具有相同的精密度，但是单色法更具有较好的稳 定性和理论的符合性 22。 2003年吴志旭、张雅燕通过单因子重复水平试验和提取时间进行探讨，证 明对分光光度法测定叶绿素 a方法改进后即在样品经过冷冻、 50 C热丙酮快速提 取并防止 2h后进行测

26、定，此方法与改进前无有显著性差异，但是改进后的方法 简化了操作过程，大大缩短了提取时间 23。 2003年戴荣继等人用丙 酮水溶液自浮游生物浓缩样萃取色素，用分光光度 计测定萃取物的吸光度。叶绿素自细胞内提出的难度 ,不同藻类差异相当大，为 了将色素完全萃出 ,通常需要用组织研磨器机械的破坏细胞。 2005年林少君等人采用反复冻融一浸提方法提取叶绿素 a， 即将过滤水样的 滤膜于 -20 C冰箱内和室温下反复冻融 3 5次后，放进 90丙酮溶液中浸提 20h。 此方法误差小，稳定性好，结果比较准确并且操作安全 24。 2007年潘玲玲等人以植物叶片为材料，利用双波长双光束紫外可见分光光 度计，

27、用最大决定系数增量回归算法，研究了叶片叶绿素 a、 b及 SPAD值同时、 快速测量方法。结果表明，研究了仪器波长误差和带宽变化对测定结果的影响， 发现波长偏移超过 0.2 nm， 误差快速增大，且波长向长波方向偏移时对测量的影 响要大于向短波方向偏移的影响；仪器带宽变大，预测误差也就越大 25。 3. 荧光法测定叶绿素 a含量发展现状 1973年 ,首次利用机载激光荧光计实现了海藻浓度及其分布的现场 测量。系统采用脉冲燃料激光器作为激发光源，通过测量海水表层叶绿素 a所发 出的荧光强度，获得有关海藻分布的信息，能够探测到 mg/m3量级的叶绿素 a含 量。基于激光诱导焚光 (17)和 _曼

28、(11311011)散射机理的机载和船载激光雷达遥 测系统引起了人们极大兴趣，并相应出现了有关这方面的研究报道。 1979年， Yentsch首次提出采用光谱荧光信号 (SFS)探测藻类群落结构。从此， SFS法广泛用于对单一藻类培养物的研究，探求光照和营养状况对藻类色素的 影响和估测天然藻类群落组成。但 SFS是不稳定的，虽然通过用 DCMU处理浮 游植物分子能部分抑制荧光的变化，但很难自动地分析藻类群落的结构。 山东建筑大学硕士 学位论文 1995年， B.Ruth通过对池塘 (面积 4800m2， 水深 4m)中自然状态下生长的海 藻叶绿素 a浓度的测量，来估测流入到池塘中的除草剂的浓度

29、，并与人工培植的 海藻生长状态进行比较。在测量过程中采用连续波 He-Ne激光器 (波长 632.8mn) 作为激发光源，以声光调制器作为高速光开关调制激发光。用光纤束传输激发 光及海藻叶绿素 a发出的荧光，用光电倍增管测量接受到的荧光强度，从而得到 海藻浓度的大小。测量结果表明，在相对较短时间内能够估计出除草剂对海藻 的影响。由于测量主要是基于光合作用，因此适用于池塘中人工培植的海藻和 自然状态下生长的海藻浓度的监控。 1997年， D.Mckee等报道了一种新型的能同时测量叶绿素荧光、光线衰减 及大角度散射的组合式仪器。该仪器包括三个光学传感器 (荧光计、浊度计和浑 浊度仪 )以及配套子系

30、统包括微处理单元、数据存储单元和能量供给单元，并且 全部密封在不锈钢管壳内，能潜入水中工作。三个光学传感器共用一个脉冲氙 灯作光源。在苏格兰西海岸进行的现场试验表明，该组合仪器具有良好的线性 关系、较高的分辨率和较大的动态范围。 1997年 ， JJ.Cullen等利用安装在浮标上的辐射计现场测量由太阳光激发的 叶绿素荧光辐射，研究海水表面附近叶绿素、荧光、光合作用及辐射之间的关 系。 1997年， K.Wild-Alien等利用装备有颜色传感器和荧光计的海上浮筒，同时 测量海水的颜色和叶绿素浓度。通过荧光计测得叶绿素的荧光分布来估测叶绿 素的浓度，并用样品叶绿素进行标定。 2002年， M.

31、Beutler等人研制出了多波长激发荧光的叶绿素浓度现场测量仪， 整个仪器置于放入水中的圆筒内，能在几秒钟的时间内对 5种藻类叶绿素浓度分 别进行测量，并把测量结 果与 HPLC测得的结果进行比较，实验证明这种方法是 有效的。 国内应用活体荧光法对水中海藻状态进行监测的研究始于 80年代末。 1989年，国家海洋局第二海洋研究所应用荧光高度成像光谱仪 (FLI)遥感所 测的叶绿素 a的浓度值与现场船测资料以及美国空间中心的机载海洋激光雷达 所测值有很好的相关关系，并得到叶绿素浓度分布图。 1996年，中国科学院海洋研究所报道了 一种适用于各种船只的海水叶绿素 含量走航自动测定系统。其设计方案是

32、：用水泵从船底连续汲取海水，现场海 山东建筑大学硕士学位论文 水连续和稳定地进入荧光光度计样品室，测定海水中浮游植物活体细胞的荧光 强度，测定结果经模数转换由主计算机记录。 1998年，青岛海洋大学的研究人员依据激光感生荧光原理和叶绿素分子的 荧光光谱特性，研制了一套激发波长为 532nm的海洋激光雷达系统 (BLOL)， 用 于海洋表层叶绿素分子浓度的快速测量。 1999年，燕山大学的王玉田教授依据海藻色素的荧光特性，研究了扁藻、 小球藻、盐藻、角毛藻、小新月藻、叉鞭金藻等海藻的识别方法。 2004年，唐尧基等人以 N， N-二甲基甲酰胺为萃取剂，利 用荧光激发 -发射波 长差 237nm，

33、 建立了同步荧光法测定海水中叶绿素 a含量的新方法，线性范围在 0 200.0ng/L， 检出限为 1.5ng/L， 回收率在 95.0% 102.5%之间 26。 2005年，哈尔滨工业大学王书涛等人提出一种基于小波变换的测量海藻中 叶绿素 a/b的全光纤荧光光谱在线测量系统。实验证明该系统具有结构简单、探 头无源、小型化、所得光谱变形小等特点。为监测海洋生态环境提供了一种新 的方法 27。 2005年金海龙等人用特征光激发低浓度海藻，发现了混合海藻的荧光激发 光谱满足线性叠加特性。根据光谱分析理论，用特征激发波长的荧光发射光谱 取二阶导数，对激发波长为 440nm的荧光发射光谱进行分析，发

34、现有两个极小 值点，根据这个特点可以区别含叶绿素 b、 c的海藻 28。 2008年苏荣国，梁生康基于浮游植物活体叶绿素荧光激发光谱建立了硅藻 和甲藻的识别技术，建立了浮游植物荧光特性谱库，识别两个门类的混合样品 18个，识别正确率为 78%，回收率大于 76%29。 目前，国内外应用活体荧光法现场监测浮游植物状态的仪器基本上是激光 雷达系统把传统的实验室荧光测量仪器改装后用在船体 上或是水下拖体上，这 些方法设备复杂笨重、测量误差大，而且电缆传输方式使光电不能真正兼容。 随着科学技术的发展，光纤传感和传输技术不断完善，人类进入信息时代，现 代信息技术在国民经济和社会生活的各个领域得到了广泛的

35、应用，光纤技术、 计算机和信息处理技术的发展使活体荧光法在海藻状态监测方面的深层次应用 变为可能，提取海藻受激励光照射所发出的荧光信号，并结合模式识别技术， 可以形成高精度的海藻种类自动识别系统，不仅可以辨识单一海藻的成分和浓 度，而且能高精度地完成混合海藻中各种海藻的定性和定量检测，为监测和控 -10- 山东建筑大学硕士学位论文 制海洋污染提供了一种新的检测手段 28。 4. 其它方法 最近又有基于光声效应的光声光谱法测定植物叶绿素 (陈秉初等， 1993)， 其原理是样品吸收了经强度调制的入射能量，通过无辐射方式将吸收的能量转 变成热能，热能以热波形式在样品和周围气体中转变成声能，形成光信

36、号。通 过光信号的强弱和入射能量，就可测定叶绿素的含量。研究人员以刺槐的叶片 为样品用光声光谱法和 Arnno法测定叶绿素，结果表明 Amno法测的叶绿素 a和 b 的含量分别于 647nm和 426nm处的光声信号强度具有明显的相关性。但由于光声 光谱与乙醚中的叶绿素吸收谱相比有红移现象，光合放氧对光声信号有影响， 色素干扰等问题，此法没有得到广泛应用，有待进一步研究。 目前还有利用海洋多波段扫描仪航空遥感测定海面叶绿素浓度的新技术， 2001年中国科学院研制了新型海洋多波段扫描仪，并对黄渤海海区进行遥感测 定，并与实测数据进行了比较，结果令人满意 (朱乾坤等， 2001)。现在，可以 现场

37、测定叶绿素的光学探头已有生产并且在不断改进。它的最大优点是快速简 便，便于现场操作和读数。此法不必 使用溶剂提取色素，因此缩短了测量时间， 但准确度和精密度较差。此法多用在准确度和精密度要求不高的大面积海域快 速测定。 1.3选题依据以及研究的主要内容和目的 1.3.1选题依据 黄河水是河口地区的重要资源，也是胜利油田开发建设的 “ 生命线 ” ，同时 黄河是我国第二大河，由于所处地域关系，又是水资源相对比较紧张的河流， 它的水资源利用率是全国大河最高的。自从中国工业持续发展以来，黄河水连 续数年出现污染，给地处黄河最下游的河口地区造成了严重的影响，引起了广 泛关注。 由于受到富营养化的影响，

38、许多以湖泊水库为水源的自来水厂原水含有不 用程度的藻类。严重时，原水藻密度高达 1 8个 /L以上，藻类还会分泌藻毒素 威胁供水水质的安全。 近年来，随着湖泊富营养化和世界各地的淡水水华频频发生 ,由此而引起的 人畜中毒甚至死亡的事件时有报道。淡水藻中产生藻毒素最多的是蓝藻，蓝藻 是绝大部分富营养化水体中的优势藻类，包括微囊藻、项圈藻、颤藻、节球藻 -11- 山东建筑大学硕士学位论文 和念珠藻等属，许多藻种能产生藻毒素。依据藻类毒素的作用方式，可 归类为 肝毒素 (如微囊藻毒素）、神经毒素 (如类毒素）、皮肤刺激物或其他毒素。其中， 肝毒素和神经毒素都是由在地表水中普遍存在的蓝藻分泌的，因此这

39、些毒素与供 水水质相关，尤其是在长期暴露的情况下，即使是低剂量的肝毒素也有相当大 的危害。大部分肝毒素 (所有的七肽环）都是微囊藻毒素，已知至少有 50种微囊 藻毒素，最早确认其化学结构的微囊藻毒素是 MC-LR。 因此水体中藻类的去除 已经成为水处理中急需解决的问题。基于以上原因，本课题拟对水体中水藻的 含量进行分析测定研究，以便开展藻细胞的常规监测，保证供水安全。 1.3.2课题研究的主要内容 1.3.2.1淡水藻中叶绿素 a的提取方法研究 1. 提取溶剂的选择：固定温度和提取时间，选用不同的提取剂如 90%丙酮、 DMF、 乙醇、乙醚以及不同比例混合液提取叶绿素 a， 选取最佳提取剂。

40、2. 提取温度的选择：固定提取剂和提取时间，在不同的温度条件下提取，选 择最佳提取温度。 3. 提取时间的选择：固定提取剂和提取温度，在不同的时间条件下提取，选 择最佳提取时间。 4. 提取方式的选择：比较研磨法、超声法、直接浸泡法，选择最佳提取方式。 1.3.2.2淡水藻中叶绿素 3的测定方法研究 本课题主要是利用荧光法进行淡水藻中叶绿素 a的新测定方法研究。寻找最 佳测定条件，探究简便快捷、灵敏度高、准确度好的测定方法。 1.3.3课题研究的目的 1. 探寻淡水藻中叶绿素 a的提取及测定新方法，使方法简便快捷、灵敏度高、 准确度好，且易于现场操作，最终实现在线监测。 2. 通过对引黄水库水

41、中藻的种类和含量分析研究，了解藻类污染状况和影 响因素，为水厂安全运行提供理论指导及技术支持。 -12- 山东建筑大学硕士学位论文 1.4技术路线 技术路线见下图 1.1 图 1.1技术路线 -13- 山东建筑大学硕士学位论文 1.5创新点 1. 在提取过程中采用超声波提取方式， 2个小时的提取时间，与之前的 8-10 小时的提取时间相比，大大的缩减了提取叶绿素 a的时间，提高了工作效率。 2. 研究利用同步荧光法和导数同步荧光法测定叶绿素 a， 比较了这两种测 定方法相对于分光光度法的优越性。证明了荧光法具有快速、简便，不需要复 杂的前处理，检出限低，回收率高等特点。 _ 山东建筑大学硕士学

42、位论文 _ 第 2章淡水藻中叶绿素 a提取方法研究 摘要：从中国科学院水生生物研究所买进小球藻种，接种在 BG11培养液中，放 置在人工气候箱中培养，分别用乙醇、 90%丙酮、乙醇：丙酮 (1 : 1)、乙醇：丙 酮(2 : 1)、乙醇：丙酮 (1 : 2)在不同温度、不同破碎方式下提取叶绿素 a， 然后 测定在不同波长下的吸光度值，并计算出叶绿素 a含量。实验研究结果表明，用 丙酮：乙醇 =1 : 1混合液做提取剂，在 21C， 超声波提取，提取效果好。和国家 环保局编写的水和废水监测分析方法中的分析方法 (以后文中简称为丙酮研 磨法 )比较，超声波提取法具有提取速度快、时间短、产率高、环保

43、等优点。 关键词：小球藻，叶绿素 a， 分光光度法，提取方法 2.1引言 藻类是一类极其古老的微小原核生物，长期的进化形成了极强的生态竞争 优势。 .藻类和其它一些水生植物的大量繁殖，破 坏了水体的生态平衡。在一般 条件下，藻类的生长历程要经历延滞期、对数期、稳定期和下降期四个时期。 在适合藻类生成的环境条件下，即可获得最大生长率，并以指数级迅速生长。 藻类的过量繁殖会导致本地物种迁移、生存环境破坏，而且溶解氧过量和过快 地消耗，甚至会改变生物地球化学循环。藻类含有叶绿素，能通过光合作用将 无机物转化为有机物。藻类细胞壁表面含有的氧、氮和硫对金属离子有相当强 的亲和性，从而能对金属离子进行吸附

44、 3()_31。藻类还具有超强的繁殖能力， 其尽可能多地繁衍后代，从而使产毒菌株密度增加，形成种类 少、数量多的藻 类水华现象。水华藻在水面堆积，持续时间长，散发霉味和腥臭味，严重影响 生态景观，使水体透明度下降，溶解氧含量和水体生物多样性降低，当水体中 的营养素被藻类耗尽时，藻类大量死亡。藻类死亡腐败后被微生物分解，消耗 大量溶解氧，亦产生藻毒素、大量羟胺及硫化氢等有毒物质直接危害水生动物。 进而使湖泊变浅、淤塞，最后成为沼泽地 32_33，最终影响人类生活。 随着现代社会的高速发展和人口膨胀，湖泊、水库等水体的营养负荷急剧 增加与积累，致使浮游藻类及其它水生生物异常繁殖，造成水体的富营养化， 严重影 响了水环境质量。浮游藻类中的叶绿素是衡量水体富营养化的重要指标， 其主要组成成份为叶绿素 a， 准确测定叶绿素 a的含量，对评价、预测水体富营 养化状况具有重要意义。目前，测定叶绿素 a多以分光光度法为主 34。叶绿素提 -15-