石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调查

资源描述

《石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调查_邹苗.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调查_邹苗.docx（52页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、分类号密级华中农业大学硕士学位论文石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调查 Investigations and Researches on Pathogenic E.coli and intestinal parasite of Elaphurus Davidianus in Shishou Milu National Nature Reserve 研究生 . 邹苗学号：2010302110213 指导教师：郭定宗教授指导小组：郭定宗教授丁明星教授邓干臻教授李家奎教授周东海副教授杨世锦髙级工

2、程师专业：临床兽医学研究方向：动物营养代谢病获得学位名称：农学硕士获得学位时间： 2014年 6月华中农业大学动物医学院二一四年六月华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文是否保密否如需保密，解密时间年月日独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果 .尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢

3、意。研究生签名：时间：年；月吝曰本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版 , 并提供目录检索和阋览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文（即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文）在解密后适用于本授权书 . 学位论文使用授权书签名曰期：逆，争

4、年厶月善曰签名曰期： -(年各月 I 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调查目录 m . i ABSTRACT . ： . iii 綱嫌 . v 第一部分文献综述 . 1 1麋鹿种群相关研究 . 1 1.1麋鹿的历史分布及数量 . 1 1.2中国麋鹿种群发展现状 . 1 1.3石首麋鹿保护区概况 . 2 1.3.1石首麋鹿自然保护区种群动态 . 3 1.3.2石首麋鹿栖息地生境变化研究 . 4 1.3.3石首麋鹿种群密度制约的困扰 . 6 2麋鹿疾病概述 . 6 2.1鹿科动物寄生虫疾病 . 7 2.1.1吸虫病 . 7 2.1

5、.2孢子虫病 . 8 2.1.3蜱虫病 . 8 2.2鹿科动物细菌疾病 . 9 2.2.1大肠杆菌病 . 9 2.2.2产气荚膜梭菌病 . 10 2.3其它鹿科动物疾病概述 . 11 2.3.1 驯鹿 . 11 2_3.2梅花鹿 . 12 2.4麋鹿疾病防控研究 . 13 第二部分石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌的分离鉴定 . 14 1材料与方法 . 14 1.1实验材料 . 14 I 华中农业大学 2014届硕士研究生学位（毕业）论文 1.1.1培养基及生化鉴定管 . 14 1.1.2药敏试纸 . .14 1.1.3实验动物 . 14 1.1.4 PCR试剂与扩增引物 . . . 15 1.

6、1.5 主要仪器 . 16 1.2实验方法 . . . 16 1.2.1细菌的分离纯化 . 16 1.2.2细菌的形态学观察 . 16 1.2.3分离菌株的生理生化试验 . 17 1.2.4分离菌株的 16SrRNAPCR鉴定 . 17 1.2.5分离菌株的小鼠致病性试验 . 18 1.2.6分离菌株的药敏试验 . 18 1.2.7分离细菌 PCR模板的制备 . 19 1.2.8毒力基因的 PCR检测 . 19 2结果 . 20 2.1死亡麋鹿剖检观察 . 20 2.2细菌形态观察 . 20 2.3细菌生化鉴定结果 . 21 2.4细菌 16s rDNA鉴定结果 . 22 2.5小鼠致病力试验

7、 . 22 2.6大肠杆菌毒力基因检测结果 . 22 2.7药敏试验结果 . 24 3讨论： . 24 第三部分石首保护区麋鹿消化道寄生虫感染调査 . 27 1材料与方法 . 27 1.1粪样采集及编号 . 27 1.2实验仪器 . 27 1.3检查方法 . 27 石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调査 1.3.1沉淀集卵法 . 27 1.3.2饱和食盐水浮聚法 . 27 1.3.3尼龙筛集卵法 . 28 1.3.4卵囊检测法 . 28 1.3.5虫卵形态记录与鉴别 . . 28 1.3.6虫卵计数 . 28 2结果 . 29 2.1麋鹿粪便中检出的寄生虫卵及其形态观察 . 2

8、9 2.2麋鹿粪便虫卵感染情况 . 31 2.3麋鹿消化道寄生虫种类及感染强度 . 32 2.4麋鹿前后盘吸虫 EPG计数 . . . . . 32 3讨论 . 33 . 35 it . 41 石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调査摘要湖北石首麋鹿国家级自然保护区是我国三大麋鹿保护基地之一，区内麋鹿全部实现自然放养，现已形成全球最大的野生麋鹿种群。但在 2010年前后，由于疫病的爆发，区内麋鹿出现大规模死亡（张林源等， 2011)。本研究针对保护区内麋鹿致病菌及寄生虫的感染情况，对保护区内麋鹿的潜在病原进行调查，旨在为麋鹿疾病防控工作提供一定依据。大肠杆菌为条件致病

9、菌，在麋鹿机体免疫力下降时，会对麋鹿的健康构成威胁。本研究通过染色镜检、生化鉴定、 16SrDNAPCR、小鼠毒力试验等方法从麋鹿心、肝、脾、肺等病料中分离到 15株致病性大肠杆菌。采用 Kirby-Bauer纸片法，选用 14种常用抗生素对分离得到的 15株致病性大肠杆菌进行药敏试验，结果显示，分离到的 15株大肠杆菌对庆大霉素、卡那霉素、头孢唾林的高敏度均达到了 100%; 其次是对氯霉素、新霉素以及链霉素，高敏度均超过 60%;耐药性方面，对克林霉素和磺胺嘧啶的耐药度分别为 80%和 60%。本研究为麋鹿致病性大肠杆菌的快速鉴定提供了方法，同时对针对该病治疗药物的选择有一定

10、指导作用。此外，本研究基于相关文献报道，使用粘附素类、铁转运系统类、血清类、毒素类的 fimH、kps II、 papC、 tsh、 iss、 iucD、 irp2、 cvi/cva、 vat、 sta、 traTa、 ompA 等基因的相应引物对 15株分离到致病性大肠杆菌进行了毒力基因的 PCR扩增检测。按照扩增频率排列依次为 ompA(100.00%)、 traTa(80.00%)、 iss(80.00%)、 iucD(60.00%)、 irp2(53.33%)、 sta(33.33%)、 vat(20.00%)，其中 ompA、 traTa、iss、 irp2 等基因的扩增频率较

11、高。本次对麋鹿致病性大肠杆菌毒力基因的研究，为进一步探讨麋鹿大肠杆菌病的致病机理奠定了基础。寄生虫病为野生动物的常见疾病，由于保护区内麋鹿所处自然环境复杂，寄生虫病病原种类繁多且分布广泛，当感染数量到达一定程度后，寄生虫病常造成麋鹿机体消瘦及机体免疫力下降，严重时甚至造成其大量死亡（沈华， 2007)。本课题采用沉淀集卵法、饱和食盐水浮聚法、饱和糖水离心法、抗酸染色法等对保护区内 145 份麋鹿粪便进行了肠道寄生虫卵的检测。结果显示：寄生虫卵的总体检出率方面，华中农业大学 2014届硕士研究生学位（毕业）论文吸虫卵最高，达 67.58%;线虫卵、绦虫卵和球虫卵相对较少

12、，分别为 17.24%、 15.86% 及 13.80%。前后盘吸虫卵的检出率高达 53.10%,其次为带绦虫卵、蛔虫卵、艾美尔球虫卵，分别为 15.86%、13.10%和 8.28%。关键词：麋鹿 ;致病性大肠杆菌 ;毒力基因 ;寄生虫石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调査 ABSTRACT Hubei Shishou Milu National Nature Reserve, one of the three bases of Pere David*s deer in China, has the worldfs largest wild deer population

13、s. But after 2010, the outbreaks of epidemic diseases lead to mass deaths of Pere Davidfs deer (Zhang Linyuan , 2011). This study surveyed the potential pathogens by isolating and identifying the pathogenic bacterium and parasite of Pere Davids deer， and designed to provide a reference for disease p

14、revention. E. coli as a conditioned pathogen , always pose a threat to the health of Pere Davids deer. Tissue samples were collected and plated onto agar media on this study. As a result, 15 pathogenic Escherichia coli in Pere Davidfs deer were isolated and identified by bacterial culture, biochemic

15、al assays and pathogenic test. According to the Kirby-Bauer disk diffusion method, drugs resistance of 15 pathogenic isolates were tested using 14 antibiotics. The highest sensitivity rate of 6 drugs was over 60%, which were gentamicin, kanamycin, cephalosporins, chloramphenicol, neomycin and strept

16、omycin.As for penicillin, vancomycin, clindamycin and sulfadiazine, they showed little effect on retarding bacterial growth. This study would provide reference for clinical use of drugs for Pere Davids deer. Besides, for exploring the pathogenesis of 15 pathogenic Escherichia coli in Pere Davids dee

17、r, 12 virulence genes (fimH, kps II? papC, tsh iss， iucD，irp2, vat and sat) which reported by Ewers .C were chosen to detect the virulence factors of the isolated Escherichia coli. Arranged in order of frequency according to a华中农业大学 2014届硕士研究生学位（毕业）论文 Paranphistomum cervi T.pisiformis and Eimeriid

18、ae were deteted in the highest frequence. Besides, schistosomiasis and Cryptosporidium were never detected in all 145 fecal samples. Key words: Pere Davids deer, pathogenic Escherichia coli, virulence genes, parasitic diseases iv 石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调査缩略词表英文缩写英文全称中文名称 CFU Colony forming uni

19、t 菌落形成单位 E.coii Escherichia coii 大肠埃希氏菌 O-F Oxidation-fermentationtest (葡萄糖）氧化发酵试验 MH Muller Hinton Agar MH琼脂 TSA Tryptic Soy Agar 胰蛋白胨大豆琼月旨 SS Salmonella-Shigella AgarSS琼脂 EMB Eosin Methylene Blue Agar伊红 -美兰琼脂 PCR Polymerase chain reaction聚合酶链式反应 rRNA Ribosomal RNA 核糖体 RNA dNTP 2 -deoxynuleoside 5

20、-triphosplate 脱氧核苷三磷酸 s, min,h Second, minute, hour 秒钟，分钟，小时 u L, mL? L Microliter, milliliter, liter 微升，毫升，升口 g， mg，g Microgram, milligram, gram 微克，毫克，克 EPG Eggs per gram 每克（粪便）含虫卵数石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调查第一部分文献综述 1麋鹿种群相关研究 1.1麋鹿的历史分布及数量依据现已发掘的麋鹿角化石和骨骼化石，麋鹿起源于早更新世（张林源等， 1998 ; Nowak， 1999)，

21、繁盛于 10000年 3000年以前的全新世中期。同样根据已发掘的第四世麋鹿化石分析，麋鹿曾广泛于长江中下游流域，即湖南、湖北、安徽、江西、浙江、江苏等地区。此外，向西分布至山西的汾河流域，北达东北的黑龙江流域。从人类历史记载来看，麋鹿最早见于周朝孟子中的相关篇目。由于气温和栖息地等自然因素的变化及人为活动的不断干扰，野生麋鹿种群迅速衰落，至元朝末年，近乎灭绝（曹克清， 1988)。另一方面，人工饲养麋鹿的种群依然残留，至清朝末年，主要饲养于北京南海子皇家猎苑，即现在的北京麋鹿苑旧址。自法国传教士大卫（ Armand David)于 1865首次将麋鹿运往欧洲起，麋鹿种群在中

22、国本土宣告灭绝。 20世纪初期，英国乌邦寺曾先后从其他欧洲国家动物园收集到的 18头麋鹿，成为当时全球仅存的麋鹿种群。随着乌邦寺麋鹿种群的不断扩大，自 1994年开始，麋鹿种群被输出到全世界各个地区。到上个世纪 90年代，全球 20 多个国家的 160个地点生活着 1700余头麋鹿。整体来看， 20世纪 80年代前，全世界麋鹿数量增长缓慢。随着中英麋鹿重引进项目的开展，麋鹿种群数量发生了急速增长，截止目前，全世界的麋鹿总数超过了 4000头。因而，麋鹿已被从 CITES (华盛顿公约）附录中移除，但 IUCN红皮书仍将其列为野外灭绝种。 1.2中国麋鹿种群发展现状目前，麋鹿在中国已

23、经形成三大种群和数十个小种群，其主要分布于 “ 一苑二区 ” ，即侧重于实验研究的北京麋鹿苑博物馆，以及旨在实现麋鹿自然种群恢复的江苏大丰和湖北石首两个国家级自然保护区。此外，河南原阳的麋鹿散养基地及天津、 1 华中农业大学 2014届硕士研究生学位（毕业）论文武汉、海口、昆明、广州等地动物园先后从北京麋鹿苑引进少量麋鹿，但至今没有形成一定规模的种群。麋鹿三大主分布区中（表 1)，纬度最高（ 39。 46)的北京麋鹿苑面积最小（ 55hm2)，由于年降水量少（ 600mm)及年均气温低（ 13.1 C)，苑内植被种类相对较少，麋鹿主要采食其中 11科 19种（属）的

24、植物（王轶， 2011)，从 1992年起，麋鹿苑开始定期向全国各地输出麋鹿，维持 120头左右的规模，以缓解草场压力和降低种群密度，同时也促进了麋鹿的迁地保护。大丰麋鹿保护区拥有最大的麋鹿种群规模和最大的保护面积，但由于地处渤海之滨，冬季植被较少，需要人工补饲，种群多为半散养状态。相比之下，石首麋鹿自然保护区位于长江中游地区，气候适中，植被丰富，具备自然放养条件，现己形成三个纯野生状态的自然种 it、 . 群。表 1中国麋鹿神群主要分布区域情况 Table 1 Statistics of part of the Pere Davids deers distribution po

25、int of China 湖北石首保护区北京麋鹿苑江苏大丰保护区地理坐标 11233 E 29491 11626 E 3946 N 12049 E 3305 N 区域面积 (hm2) 1570 55 78000 引种年份 1993/1994/2002 1985/1987 1986 年降水量 (mm) 1200 600 1000 年平均气温 16.5 13.1 14.1 平均海拔 (m) 35.2 31.5 1.5 种群数量（头） 1100 120 1200 词养状态散养（野生）圈养半散养 1.3石首麋鹿保护区概况石首麋鹿自然保护区成立于 1991年 10月，于 1993、 19

26、94年和 2002年分先后分 3批引进麋鹿 94头（ 28占 66早）。保护区成立初期（ 1994-1997年 )，麋鹿种群数量稳步上升，死亡率维持在 5%左右。 1998年，长江特大洪水导致保护区内部分麋 2 石首保护区麋鹿致病性大肠杆菌分离鉴定与寄生虫感染调查鹿外逸和溺亡，死亡率超出 15%，区内麋鹿首次出现负增长。同时，保护区外通过自然扩散形成了面积分别为 2.3和 11万亩的三合垸、杨坡坦两个野生麋鹿种群，其初始种群数量分别为 26头（ 5 $ 21早）和 11头（ 2古 9早）。 2000年前后，面积为 5.3 万亩的六合垸地区出现种群规模为 13头（ 5 i，

27、7早）的第三个野生种群。此外， 2009 年 1月，湖南洞庭湖区观测到 28只野生麋鹿群。杨道德等（ 2007)通过分析 1998、 2003及 2006年保护区内外的麋鹿数量及其性比得出， 1998年前后通过自然扩散所形成的野化种群增长率（ 0.267)高于保护区内的麋鹿种群增长率（ 0.226),性比变化趋势均为向 1:1靠近，目前，区内、外麋鹿种群的性比均接近 1:1。蒋志刚等 (2006) 指出：麋鹿保护区域内建立两个以上的繁殖亚种，对保存麋鹿种群的多样性有重要意义。 .繁殖亚群的组建，应确保繁殖公鹿和雌鹿的数量尽可能接近，从而有效避免近亲繁殖，维持种群的遗传异质性。最新

28、数据（截止 2013年 5月底）显示，核心保护区外（杨坡坦、三合垸）的麋鹿数量已经超过保护区内的种群数量。 1.3.1石首麋鹿自然保护区种群动态湖北石首麇鹿种群自 1993年自北京麋鹿苑重引入以来，保持了稳定増长。其年均出生率和年均增长率分别为 26. 8%和 21. 7%，最高出生率达 35. 7%。相比于石首麋鹿保护区（图1)，江苏大丰保护区的麋鹿种群（图 2)的年均出生率和年均增长率明显更低 ;而两地在 2006年之前的年均死亡率无显著差异。杨道德等 (2007)，用指数增长模型拟合发现， 1998年石首麋鹿保护区内的散养麋鹿种群及外逸到保护区外形成的自然野化麋鹿种群

29、均呈指数增长，其瞬时增长率分别为 . 226和 0.267, 后者增速明显高于前者；同期大丰麋鹿保护区的麋鹿种群瞬时增长率为 0.184,低于石首麋鹿保护区内、外的麋鹿种群增长速度。在大丰麋鹿保护区外的麋鹿种群数量增速低于区内的种群，苏继申等（ 2003)分析指出，这与区外食物短缺及受修路、开荒、围垦、建场等人为活动影响有关。 3 华中农业大学 2014届硕士研究生学位（毕业）论文 0.00% 石首麋鹿种群动态（ 1994-2006) 40.00% 199419951996199719981999 2000 20012002 2003 2004 2005 2006 - 增长率出

30、生率死亡率图 1石首自然保护区麋鹿种群动态 Fig.l the population dynamics of Pere Davidfs deer in Shishou National Nature Reserve 大丰麋鹿种群动态（ 1987-2006) 增长率出生率 *死亡率图 2大丰自然保护区麋鹿种群动态 Fig.2 the population dynamics of Pere Davids deer in Shishou and Dafeng 1.3.2石首麋鹿栖息地生境变化研究石首麋鹿自然保护区位于江汉平原南部，与洞庭湖平原隔江相望，地处长江与天鹅洲长江故道夹角处，总

32、5)。区内有维管束植物 267种，其中麋鹿采食 129 种，另人工种植有冬小麦供麋鹿在枯草期采食。相较之下，赵小雷等（ 2010)对江苏大丰麋鹿保护区的滩涂湿地植被群落进行了调查， 34个采样地的结果显示，共有植物 5科 11属 11种，可划分为 5个群落类型，显然植被种类更少。保护区自 1991年建立以来，自然因素和人为影响导致了区内土地利用发生了较大变化。张垚等（ 2013)利用 3S技术（遥感技术， RS、地理信息系统， GIS、全球定位系统， GPS)石首麋鹿保护区 1987 2010年土地利用的动态变化进行了研究，结果表明： 1987 2005年间，保护区内林地和

33、耕地面积明显增加，水域、草地和沼泽有所减少。 2006 2010年间，沼泽面积持续减少，耕地、林地面积有所回落，草地面积尤其是旱生植物面积大幅增加，详细数据见图 3。草地面积特别是旱生植物面积的变化，突出反应了保护区在设立初期，湿地环境得到了较好的保护， 2005年之后，土壤旱化导致湿地退化现象严重，进而将直接威胁到种群日渐扩大的麋鹿的生存。另一方面，由于天鹅洲故道围堤的修建以及三峡大坝的蓄水，保护区段水位较 1998年前相比，降低了 3 4m。水域的变化，积极方面表现在确保了麋鹿栖息地在汛期免于洪灾；消极方面则导致了水生植物大量减少以及保护区内沟渠缺水无法形成贯通从而导致

34、水体污染加剧，增加了麋鹿遭受病菌感染的风险。 900. 00 800. 00 700. 00 600. 00 500. 00 400. 00 300. 00 200. 00 100. 00 0. 00 永域公故臌务祀地忭地雜具它！地 1987 國 2006 园 2010 图 3石首麋鹿保护区生境变化 Fig.3 the habitat change of Shishou Milu National Nature Reserve 5 华中农业大学 2014届硕士研究生学位（毕业）论文 1.3.3石首糜鹿种群密度制约的困扰麋鹿重引进项目开展以来，国内麋鹿种群数量快速增长，麋鹿特别是野

35、生种群 . 的保护工作已经面临到了许多新的问题。首先，麋鹿种群数量的过快发展己经超出了保护区的容量（蒋志刚等， 2001),栖息地的食物和空间的缺乏会更易导致麋鹿的营养不良和流行病的扩散（杨道德，马建章等， 2007)。其次，随着麋鹿种群数量的扩大，拥有实际交配权的雄性麋鹿数量大大增加，加上缺乏天敌捕食和近亲繁殖等因素（张树苗， 2009)，自然对优良基因的选择在很大程度上被削弱了，基因退化将导致麋鹿种群品质整体下滑。再次，急剧变化的气候环境也是制约麋鹿种群的一大因素，石首保护区外围三合垸的野生麋鹿种群在 2010年 3月出现了大规模死亡，死亡率高达 22.8%，张林源等

36、（ 2011)对此进行的调査发现，病原为环境中常在的条件致病菌，魏氏梭菌和嗜水气单胞菌，麋鹿死亡的原因可能是外部气候环境的剧烈变化所致。此外，保护区地处长江中游水域，在三峡大坝修筑之前，保护区内的麋鹿种群经历了 1998年特大洪水影响，损失惨重，并且在每年的丰水期，区内大部分被江水淹没，麋鹿活动区域大大缩减，这也是制约石首麋鹿种群的又一大因素。而在西方国家，由于麋鹿不属于保护动物行列，养殖场会将处于亚健康生理状态的麋鹿及时淘汰，这种调整种群结构的举措是目前国内外通用的做法（蒋志刚等， 1997),从保护麋鹿的长远角度来看，这也是不失为应对麋鹿种群密度制约问题的一项良策。 2麋鹿疾病概述就发病频率来看，圈养条件下，影响麋鹿繁殖的首要因素是难产，难产率高达 8% (宋世孝， 1993)。半散养条件下，影响麋鹿种群数量的主要疾病是致病菌导致的出血性肠炎。散养状态下，除了出血性肠炎等疾病，寄生虫病也是影响麋鹿种群数量的重要因素之一。国外关于麋鹿疾病的报道相对较少。在传染病方面，恶性卡热 (Malignant catarrhal fever)是危害麋鹿生存最主要的病毒性疾病之一

展开阅读全文