灭菌与消毒器械消毒功效鉴定试验.docx

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1、灭菌与消毒器械消毒功效鉴定试验灭菌与消毒器械消毒功效鉴定试验2.1.5.1 干热灭菌柜2.5.1.1.1 目的测定干热灭菌柜(下简称灭菌柜)对细菌芽孢的杀灭效果，以验证其灭菌性 能是否符合设计规定。2.1.5.1.2 试验器材(1) 枯草杆菌黑色变种( ATCC 9372 )芽孢菌片。染菌载体( 10mm 10mm，以不锈钢片或玻片为代表，必要时可随灭菌对象，增用或改用其他载体)。 菌片上细菌芽孢在 1602 条件下，存活时间 3.9 min，杀灭时间 19 min，D 值为 1.3min1.9min。(2) 营养肉汤培养基(见：附 A )。(3) 活菌培养计数所需器材(见 2.1.1.2 )

2、。(4) 使用说明书中规定灭菌柜可以处理的物品( 装填灭菌柜，使达满载要 求 )。(5) 多点温度测定仪。2.1.5.1.3 柜内温度测定将温度测定仪的多个探头，分别放于灭菌柜的各层内、中、外不同部位。 在柜内摆放模拟的常规处理物品，至使用说明书规定灭菌时的最高量(满载)。 关闭柜门，开启电源，按灭菌柜设计程序进行灭菌。每 3 min，记录各点的温 度。试验重复 3 次，计算各点不同时间的平均温度，并在试验报告中以图表列 出。2.1.5.1.4 灭菌试验(1) 根据试验要求，制备枯草杆菌黑色变种芽孢悬液和芽孢样片。(2) 每次试验取 2 个菌片为一组，平放于无菌平皿内，勿重叠。加盖，分 置于灭

3、菌柜的各层，内、中、外不同部位。试验时，灭菌柜内除菌片样本外， 还应满载以模拟的常规处理物品。(3) 关闭柜门，开启电源，按灭菌柜设计程序进行灭菌。灭菌完毕，取出 平皿，将菌片取出接种于含 5.0ml 营养肉汤培养基试管中，置 37 培养箱内 作定性培养。72h 后观察结果。肉汤管混浊者表示有菌生长，判为阳性; 肉汤管澄清者表示无菌生长，继 续培养至第 7d，若仍无菌生长，判为阴性。对难以判定的肉汤管，取其中 0.2ml 悬液接种营养琼脂平板，用灭菌 L 棒涂抹匀，置 37 培养箱中培养。48 h 后涂片染色，在显微镜下观察菌落形 态，或进一步做其他试验，以判断生长者是否为试验菌。若有非试验菌

4、污染， 应查找原因重新进行试验。(4) 测试中，应同时设立定性和定量阳性对照组(菌片对照)与阴性对照组 (培养基对照)。(5) 定量阳性对照组，以同批试验用菌片放在室温下，待试验组灭菌接种后， 立即将该菌片 2 片分别移入含 5.0mlPBS 试管中，各振荡 80 次洗涤。按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数。(6) 定性阳性对照组，以同批试验用菌片放在室温下，待试验组灭菌接种 后，立即将试验菌片 2 片，分别接种于 5.0ml 营养肉汤培养基，放入培养箱 中, 作定性培养，观察细菌生长情况。(7) 阴性对照组，以空白样片 2 片，分别接种于 5.0ml 营养肉汤培养基，同 时将未接种

5、过的营养肉汤培养基放入培养箱中作定性培养，观察有无细菌生长。(8) 试验重复 5 次。(9) 在 5 次试验中，每次试验中阳性对照菌片的回收菌量均应达 5105cfu/片5106cfu/片；定性阳性对照组，细菌生长良好；阴性对照应 无菌生长。阳性或阴性对照若有不符合上述要求的结果，试验作废，重新进行。2.1.5.1.5 评价规定(1) 在 3 次测定温度的试验中，各点平均温度均达设计要求。(2) 在 5 次灭菌试验中，各次试验定量阳性对照的回收菌量均达 5105cfu/ 片5106cfu/ 片；定性阳性对照组，细菌生长良好；阴性对照组样本应无菌 生长。所有试验菌片均无细菌生长时，可判为干热灭菌

6、合格。2.1.5.1.6 注意事项(1) 干热灭菌效果检测，应使用枯草杆菌黑色变种芽孢，不得使用嗜热脂 肪杆菌芽孢，因在干热条件下，前者对干热的抗力较后者为强。(2) 灭菌柜柜室容积和加热装置的变化，均可影响消毒效果，故在这方面 的设计有所变动时，杀菌效果应重新测定。(3) 灭菌效果观察，样本检测稍有污染即可将灭菌成功的结果全部否定， 故试验时必须注意防止环境的污染和严格遵守无菌操作技术规定。(4) 柜室内满载与非满载，结果差别较大，故正式试验时必须在满载条件 下进行。2.1.5.2 红外线消毒碗柜2.1.5.2.1 目的检测红外线消毒碗柜 (下简称消毒碗柜) 对餐(饮)具的消毒效果，以验证

7、其杀灭微生物性能是否符合设计规定。2.1.5.2.2 试验器材(1) 大肠杆菌( 8099 )悬液。(1) 脊髓灰质炎病毒悬液。(2) 染菌玻片( 10mm10mm) 载体（必要时可随消毒对象，增用或改用其他载 体）(4) 活菌培养计数所需器材(见 2.1.1.3 )。(5) 病毒灭活试验所需试液、培养基与器材(见 2.1.1.10 )。(6) 食(饮)具(种类与数量按使用说明书规定，用于装填消毒碗柜进行满载 试验)(7) 多点温度测定仪2.1.5.2.3 柜内温度测定将温度测定仪的多个探头，分别放于消毒碗柜每层的内、外两点(大型碗柜 可在内、中、外 3 点放置)，摆放食(饮)具至使用说明书规

8、定的最高装载量(满 载)。关闭柜门，开启电源，按消毒碗柜规定程序进行消毒。每 3 min，记录各 点的温度。试验重复 3 次，计算各点不同时间的平均温度，并以表列出。2.1.5.2.4 大肠杆菌杀灭试验(1) 按 2.1.1.2 所示方法制备大肠杆菌菌片(载体为玻片)。(2)在消毒碗柜满载的情况下，将干燥大肠杆菌菌片置无菌平皿内，每平皿放 2 片，勿重叠。在消毒碗柜每层的内、外两个点各放一含菌片的平皿(大型碗柜可 在内、中、外各放一平皿)，打开平皿盖。(3) 关闭柜门，开启电源，按消毒碗柜原设计程序进行消毒。消毒完毕，按说 明书规定的时间打开柜门，取出平皿。将菌片移入含 5ml PBS 试管内

9、，按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数。(4) 在上述消毒试验时，将未消毒菌片，放置室温下，当消毒组试验完毕 后，取该菌片进行活菌培养计数，作为阳性对照。另将同批培养基与 PBS 等培 养，作为阴性对照 。(5) 试验重复 3 次，其平均杀灭率应按 2.1.1.7 的规定进行计算和表达。(6) 在 3 次试验中，每次阳性对照回收菌数均达 5105cfu/ 片5106cfu/片，阴性对照无菌生长，阳性和阴性对照组结果若不符上述要 求，试验作废，重新进行。2.1.5.2.5 脊髓灰质炎病毒灭活试验(1) 按 2.1.1.10.3 所示方法制备脊髓灰质炎病毒悬液。若无特殊要求， 用玻片为载体

10、。(2) 在消毒碗柜满载的情况下，将干燥的染有脊髓灰质炎病毒的载体置无 菌平皿内，每平皿放 2 片，勿重叠。在消毒碗柜每层的内、外两个点各放一含 染有脊髓灰质炎病毒载体的平皿(大型碗柜可在内、中、外各放一平皿)，打开 平皿盖。(3) 关闭柜门，开启电源，按原规定程序进行消毒。消毒完毕，按说明书 规定的时间，打开柜门，取出平皿。将载体移入含 1ml 细胞维持液的试管中。 振荡洗涤后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒的感染滴 度。（4）阳性对照，将未消毒的染有脊髓灰质炎病毒的载体 2 片，放置于消毒碗 柜外室温下。待试验组消毒完毕后，立即将载体移入含 1ml 细胞维持液

11、的试管 中。振打后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒的感染滴 度。脊髓灰质炎病毒的感染滴度应105 TCID50。（5）阴性对照，用不含脊髓灰质炎病毒的完全培养基作为阴性对照，以观察培 养基无污染，细胞是否生长良好。(6) 试验重复 3 次。(7) 根据各组的平均病毒感染滴度（TCID50 ），分别计算其对病毒的灭活 指数，病毒的灭活指数应达 4 个对数值。2.1.5.2.6 评价规定对消毒碗柜实验室试验所得消毒效果的评价，应以对微生物的杀灭效果为 准。当所测结果均达到以下要求者可判为合格：(1) 柜内最低温度点达到 120，并可持续 15min 以上。(2) 对大

12、肠杆菌，每次试验，阳性对照组回收菌数均达 5105cfu/ 片5106cfu/片，阴性对照无菌生长，对大肠杆菌的杀灭对数值，各点均 3.00 为消毒合格。(3) 对脊髓灰质炎病毒，每次试验，培养基无污染，细胞生长良好。脊髓灰质 炎病毒感染滴度（TCID50 ）105，灭活对数值 4.00。可判为消毒合格。2.1.5.2.7 注意事项(1) 消毒碗柜内满载与非满载，结果可有相当大差别，故正式试验必须在 满载条件下进行。(2) 不同大小的消毒碗柜，柜内装有红外线灯的功率或安装支数，均可影 响消毒效果，故在这方面的设计有所变动时，应重新测定。(3) 大肠杆菌杀灭试验注意事项见 2.1.1.7。(4)

13、 脊髓灰质炎病毒灭活试验注意事项见 2.1.1.10。2.1.5.3 微波灭菌柜2.1.5.3.1 目的测定微波灭菌柜（下简称灭菌柜）对微生物的杀灭效果，以验证其消毒或灭菌 性能是否符合原设计规定。2.1.5.3.2 试验器材(1) 金黄色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大肠杆菌( 8099 )、铜绿假单胞菌（ ATCC 15442 ）、龟分枝杆菌（ATCC93326）、枯草杆菌黑色变种( ATCC 9372 ) 芽孢等细菌或芽孢悬液。(2) 染菌载体( 10mm10mm，以布片或玻片为代表，必要时可随灭菌对象，增 用或改用其他载体)。(3) 微波漏能测试仪(检测灭菌柜微波有无泄漏)。(4

14、) 营养肉汤培养基：见附录 A。(3) 活菌培养计数所用器材(见 2.1.1.2 )。(5) 使用说明书中规定的处理的物品(装填灭菌柜，使达满载)。2.1.5.3.3 细菌及其芽孢和真菌杀灭试验操作程序（1）按 2.1.1.2 所示相关方法制备试验用细菌及其芽孢和真菌菌片。若 无特殊要求，菌片以布片为载体( 10mm10mm )。每一牛皮纸小袋装 2 个菌片。（2）按实用情况，在灭菌柜内模拟摆放常规处理物品至使用说明书中规定 的最高装载量 (满载)。将试验菌片放于柜室各层中央和四角的物品中间，每层 共放置 5 袋。放入试验菌片前，按使用方法，做预湿处理。柜室容量小者可适 当减少放置菌片数量。（

15、3）菌片布放完以后，关闭柜门，进行微波照射。至预定时间，停止照射， 打开柜门，取出物品和试验菌片。（4）消毒试验时，按 2.1.1.7 要求的方法，作定量杀菌效果的检测。灭 菌试验时，将取出的试验菌片移种于营养肉汤中，置温箱内作定性培养( 37 )。 培养 7d，若仍无菌生长，判为阴性。对难以判断的肉汤管，取其中 0.2 ml 悬 液接种营养琼脂平板，用灭菌 L 棒涂匀，置 37 培养箱培养。48 h 后涂片 染色显微镜下观察菌落形态，或进一步做其他试验，判断生长的是否为试验菌。 若为非试验菌，应重新进行试验。 （5）测试中，应同时设立定性和定量阳性对照组(菌片对照)与阴性对照组(培 养基对照

16、)。（6）定量阳性对照组，将同批试验用的菌片放在室温下，待消毒或灭菌试验组 达规定作用时间后，立即将该菌片 2 片分别移入含 5.0ml PBS 试管中，各振 荡 80 次。取洗液按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数。（7）定性阳性对照组，将同批试验用的菌片放在室温下，待灭菌试验组达 规定作用时间后，立即将该批试验用的菌片 2 片，分别接种于 5.0ml 营养肉 汤培养基，放入培养箱中作定性培养，观察细菌生长情况。（8）阴性对照组，在灭菌试验中，将同批试验用的菌片 2 片，分别接种于 5.0ml 营养肉汤培养基，同时将未接种过的营养肉汤培养基放入培养箱中作定 性培养，观察有无细菌生长。

17、在消毒试验中，则应对所用中和剂、稀释液和培 养基进行无菌检测，观察有无细菌污染。（9）试验重复 5 次。（10）在 5 次试验中，阳性对照组各次试验样片的回收菌量均应在 5105cfu/ 片5106cfu/片；定性阳性对照组，细菌生长良好；阴性对照组样本应无菌 生长。阳性或阴性对照若有不符合上述要求的结果，试验作废，重新进行。2.1.5.3.4 评价规定（1）在 5 次消毒试验中，每次试验中的阳性对照菌片，检测回收菌量均应达 5105cfu/片5 106cfu/ 片，阴性对照组应无菌生长，各次试验的杀灭对 数值均3.00。可判为消毒合格。（2）在 5 次灭菌试验中，每次试验中的定量阳性对照组，

18、检测回收菌量均达 5105cfu/片5106cfu/片；定性阳性对照组，细菌生长良好。阴性对照组 样本应无菌生长。所有试验菌片都无细菌生长时，可判为灭菌合格。2.1.5.3.5 注意事项(1) 微波强弱受电压影响很大。试验时，应注意电压是否符合说明书规定 值。波动较大时，应使用稳压电源。(2) 灭菌柜在消毒棉织品、金属、橡胶管等物品时，一定事先摸索被消毒 物品适宜的预湿水量，一方面可防止棉织品烧焦，金属物品对磁控管的破坏； 一方面可提高其杀菌效果。(3) 微波杀菌效果与样本的含水量密切有关。在使用中规定需预湿者，试 验时亦必须预湿，不可省略。(4) 微波消毒金属物品时，需用湿布将其包裹，特别是

19、对金属器械的尖端 部分，以防因尖端放电损坏磁控管。(5) 测试人员长时间受微波照射，对健康有害。试验时必须穿戴专用的防 护用具。测试的灭菌柜应先用微波漏能测试仪检测有无微波泄漏。2.1.5.4 紫外线灯2.1.5.4.1 目的测定紫外线灯(包括双灯管组合灯具) 辐照强度及对微生物的杀灭作用，以 验证其杀菌性能是否达到合格标准。2.1.5.4.2 试验器材(1) 金黄色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大肠杆菌( 8099 )、铜绿假单胞菌（ ATCC 15442 ）、枯草杆菌黑色变种( ATCC 9372 )芽孢、白色葡萄球菌 （8032，空气消毒时用）、等细菌及其芽孢和真菌悬液。(2) 染

20、菌载体( 10mm 10mm，以玻片为代表，必要时可随消毒对象，增用 或改用其他载体)。(3) 紫外线照度计(在计量标定有效期内，下简称照度计)。(4) 紫外线灯测定架(测定时，紫外线灯固定于测定架顶端。顶端高 2 m， 可上下移动。下简称测定架)。(5) 稳压器( 220V )（6）细菌及其芽孢和真菌杀灭试验所需器材(见 2.1.1.7，2.1.1.9 )。2.1.5.4.3 辐照强度测定(1) 将待测紫外线灯管固定于测定架，调节距离使灯管距其下方垂直中心放置 照度计处 1m。(2) 开启紫外线灯 5min 后，用照度计在灯管下方垂直距离 1m 的中心处 测量其辐照度值 ( W/cm2 )。

21、(3) 测量时，电压应稳定在 220V。(4) 普通型或低臭氧型直管紫外线灯( 30W )，在灯管下方垂直 1m 的中心 处，新灯管的辐照度值应90W/cm2。(5) 使用中的灯管，可在原装置处进行测定。测定位置仍在灯管下方垂直 距离 1m 的中心处。使用中灯管的辐照度值应70W/cm2，低于此值者应予更 换。(6) 多灯管组合灯具的测定方法和合格标准，同单支灯管。(7) 对异型(非直管型)、高强度型，或非 30W 功率等灯管的检测距离和辐 照度值合格标准，随产品用途和使用方法而定。原则上，应不低于产品使用说 明书注明的辐照度值，并按其推荐剂量即辐照度值乘以照射时间(s)进行杀菌 试验，证明能

22、满足应用所需效果者可判为实验室测试合格。(8) 辐照强度检测，每次鉴定抽查 10 支灯管，每支灯管重复测定 3 次。 各次数据均达标准可判辐照强度合格。2.1.5.4.4 细菌及其芽孢和真菌杀灭效果的测定(1) 按 2.1.1.2 所示方法制备细菌及其芽孢和真菌菌片。菌片以玻片为载体。(2) 试验时，确定菌片照射位置。若无特殊要求，30 W 灯管应在灯管下方垂直 距离 1 m 的中心处。(3) 将菌片平置于无菌平皿中，勿重叠。平皿放于测定架预先确定的照射位置 上进行照射。(4) 照射分为 3 个时间组。各组时间的设置应使能测出将试验细菌及其芽 孢和真菌杀灭对数值3.00 所需的最低剂量，否则应

23、调整时间，重新试验，直 至取得所需结果为止。(5) 将照射后样本送实验室进行活菌培养计数(见 2.1.1.2 )的测定。(6) 测试中，应同时设立阳性对照组(菌片对照)与阴性对照组(培养基对照)。(7) 阳性对照组，以试验用的同批菌片置室温下，待试验组消毒完毕后，立即 将该批菌片 2 片分别放入含 5.0ml PBS 试管中，电动混匀器震荡 20s 或各振 敲 80 次。取洗液按 2.1.1.2 所示方法进行活菌培养计数。(8) 阴性对照组，以同次实验用培养基或 PBS 接种培养基培养，观察有无 细菌生长。(9)试验重 3 次。每次试验中的阳性对照菌片，检测回收菌量均应在 5105cfu/片5

24、106cfu/片，阴性对照组应无菌生长，各次试验对细菌及其 芽孢和真菌的杀灭对数值均3.00。该照射时间可判为消毒合格所需照射的时 间。阳性或阴性对照组结果若不符上述要求，该次试验作废，重新进行。(10) 对异型(非直管型)、高强度型，或非 30W 功率等灯管的照射距离，随产 品用途和使用方法而定。2.1.5.4.5 评价规定在 3 次消毒试验中，对细菌及其芽孢和真菌，每次试验中的阳性对照菌片，检 测回收菌量均应达 5 105cfu/片5 106cfu/ 片，阴性对照应无菌生长， 各次试验的杀灭对数值均3。可判为消毒合格。2.1.5.4.6 臭氧产生量的测定紫外线灯产生的臭氧量不同可影响杀菌效

25、果和使用的安全，故应测定臭氧 浓度以便进行综合考虑。臭氧浓度测定方法见本规范理化鉴定技术。检测条件 应以产品使用说明中规定的使用方法、面积 (或容积)和时间为准，进行现场 (或模拟现场)测定。臭氧浓度应写明于使用说明书中，低臭氧紫外线灯产生的 臭氧浓度，应不超过国家规定的工作场所安全浓度( 0.3mg/m3 )。2.1.5.4.7 有效使用期的测定将灯管装设于测试架上，通电连续照射。每周测试一次辐照度值，直至低 于 70W/cm2 时为止。该样本连续照射的时间 ( h )，即为其有效使用时间 ( h )。随机抽样，重复测试 5 支灯管，取其最低值。2.1.5.4.8 注意事项 (1) 测试前应

26、先用酒精棉球擦除灯管上的灰尘和油垢，以免影响紫外线的 照射强度。(2) 杀菌试验时，应使紫外线直接照射拟消毒表面，否则不能反映该剂量 真实的杀菌效果。(3) 在紫外线灯下工作时，勿直视灯管，并穿戴防护眼镜、防护服、手套 等，以减少对测试人员的伤害。在有人工作环境中，空气中臭氧浓度不得超过 0.3mg/m3。(4) 测定辐照度值或进行杀菌试验时，应保持室内洁净无尘。2.1.5.5 紫外线消毒箱2.1.5.5.1 目的测定紫外线消毒箱(下简称消毒箱) 对物体表面微生物的杀灭效果，以验证 其杀菌性能是否符合原设计规定。2.1.5.5.2 试验器材（1）金黄色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大肠杆

27、菌( 8099 )、铜绿假单胞菌（ ATCC 15442 ）、枯草杆菌黑色变种( ATCC 9372 )芽孢、白色念珠菌( ATCC 10231 )、龟分枝杆菌脓肿亚种（ATCC93326）等悬液和脊髓灰质炎病毒悬液。（2）染菌载体( 10mm 10mm，以玻片为代表，必要时可随消毒对象，增用或 改用其他载体)。（3）紫外线照度计(在计量标定有效期内，下简称照度计)。（4）紫外线灯测定架见 2.1.5.4.2(3)（5）细菌及其芽孢、龟分枝杆菌和真菌杀灭试验所需器材(见 2.1.1.7，2.1.1.8，2.1.1.9)。（6）脊髓灰质炎病毒灭活试验所需试液、培养基和器材（见 2.1.1.10）

28、（7）使用说明书中规定消毒箱可处理的物品(装放于消毒箱，使达满载要求)。2.1.5.5.3 紫外线照射强度测定打开消毒箱的盖或门，将内装紫外线灯管取下，在紫外线灯测定架上按 2.1.6.4 测定其照射强度的辐照度值，以确定是否与产品质量标准或企业标准 中规定的相同。必要时，以与箱门(或盖) 一样大小的铝板，用胶带固定于消毒 箱的门框(或消毒箱盖)上。铝板中央处钻一直径为 15mm 小圆孔，开启箱内紫 外线灯，照射 5min，待稳定后，通过铝板上小圆孔用照度计测定射出紫外线的 辐照度值( W/cm2 )。2.1.5.5.4 对微生物杀灭效果的测定（1）细菌及其芽孢、龟分枝杆菌和真菌杀灭效果的测定

29、按 2.1.1.2 所示相关方法制备细菌及其芽孢和真菌菌片。菌片以玻片为载体。每次试验只测试一种微生物，以防交叉污染。试验用样片每 2 片为一组，平 放于无菌平皿中，勿重叠。箱内容积过小时，可将试验细菌及其芽孢和真菌直 接涂染于所设计消毒的物品表面进行试验，每 2 件为一组。根据消毒箱容积的大小，放入一定数量装有样片的平皿，或直接涂染的样 本，但消毒箱内应同时将所设计消毒的物品摆放至使用说明书中规定的最高装 载量(满载)。关闭消毒箱门(或盖)，打开紫外线灯，照射至规定时间。取出样本，按 2.1.1.3 所示方法进行活菌计数。对白色念珠菌的杀灭试 验，用沙堡琼脂培养基，对黑曲霉菌的杀灭试验，用胰

30、蛋白胨琼脂培养基，其 他方法和步骤均与细菌杀灭试验相同。阳性对照组，以试验用的同批菌片置室温下，待试验组菌片消毒达规定 作用时间后，立即将该批菌片 2 片分别放入含 5.0ml PBS 试管中，各振荡 80 下。取样液按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数。阴性对照组，用同批次试验用培养基或 PBS 接种培养基培养，观察有无 细菌生长。试验重复 3 次。阳性对照菌片每次试验回收的含菌量均应在 5105cfu/ 片5106cfu/片，阴性对照组样本应无菌生长，各次试验对细菌及其芽孢和 真菌的杀灭对数值均3.00。该照射时间可判为消毒合格所需照射的时间。阳 性或阴性对照组结果若不符上述要求，

31、该次试验作废，重新进行。（2）脊髓灰质炎病毒灭活试验按 2.1.1.10.3 所示方法制备脊髓灰质炎病毒悬液。若无特殊要求，用玻片 为载体。每次试验 2 片脊髓灰质炎病毒样片为一组，平放于无菌平皿中，勿重叠。箱 内容积过小时，可将脊髓灰质炎病毒直接涂染于所设计消毒的物品表面进行试 验，每 2 件为一组。根据消毒箱容积的大小，放入一定数量装有样片的平皿，或直接涂染的 样本，但消毒箱箱内应同时将所设计消毒的物品摆放至使用说明书中规定的最 高装载量(满载)。关闭消毒箱的门(或盖)，打开紫外线灯，照射至规定时间。将照射后将脊髓灰质炎病毒样片移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振打后， 取样按 2.1.

32、1.10 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒的滴度。将未消毒的脊髓灰质炎病毒样片 2 片，放置于消毒箱外室温下。待试验组消 毒完毕后，立即将脊髓灰质炎病毒样片移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振荡 后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒的感染滴度，作为 阳性对照。阴性对照，用不含脊髓灰质炎病毒的完全培养基作为阴性对照，以观察培养 基有无污染，细胞是否生长良好。试验重复 3 次。根据各组的平均病毒的感染滴度（TCID50 ），分别计算其对病毒的灭活对数 值。（3）评价规定在 3 次消毒试验中，对细菌及其芽孢和真菌，每次试验中的阳性对照菌片，检 测回收菌量均应达 5 105

33、 cfu/片5 106 cfu/ 片，阴性对照组样本应 无菌生长，各次试验的杀灭对数值均3.00。对脊髓灰质炎病毒，培养基无污 染，细胞生长良好，脊髓灰质炎病毒的感染滴度（TCID50 ）105，灭活对数值 4.00。可判为消毒合格。2.1.5.5.5 注意事项(1) 试验时，应注意箱内物品有无未被紫外线直接照到处(如被箱内支架遮 挡)。如实用中拟消毒物品有可能处于该位置，在染菌样片布点时应考虑观察该 部位的消毒效果。(2) 其他同 2.1.5.4.6。2.1.5.6 环氧乙烷灭菌器2.1.5.6.1 目的测定环氧乙烷灭菌器 (下简称灭菌器) 对细菌芽孢的杀灭能力，以验证其 灭菌性能是否符合原

34、设计规定。2.1.5.6.2 试验器材(1) 枯草杆菌黑色变种( ATCC 9372 )芽孢菌片。含菌量要求为 5 105cfu/片 5 106cfu/片(按活菌培养计数结果计)。 在环氧乙烷量为 600mg/L30mg/L，温度为 542，相对湿度为 60%10% 条件下，菌片上芽孢存活时间应 7.8min，杀灭时间58min，D 值为 2.6min5.8min。(2) 染菌载体( 10mm 10mm ，以布片为代表，必要时可随灭菌对象，增 用或改用其他载体。(3) 聚乙烯塑料袋( 封装菌片用，大小为 60mm 40mm ，厚 0.2min0.4mm )。(4) 活菌培养计数所需器材(见 2

35、.1.1.3 )。(5) 使用说明书中规定灭菌器可处理的物品(装填灭菌器，使达满载要求)。2.1.5.6.3 灭菌试验操作程序(1) 根据试验要求，制备枯草杆菌黑色变种芽孢悬液和菌片。菌片放入双 层聚乙烯塑料袋内密封包装，每袋 2 片。每次试验用 20 袋。(2) 将灭菌器上、中、下 3 层，每层内、中、外各设一点，共设 9 点。每 点物品中间布放 1 袋，共需 18 袋试验菌片。另将一袋（2 片）菌片放置在室温 条件下作为阳性对照。(3) 按使用说明书所规定的环氧乙烷浓度、作用时间、柜内的温度和相对 湿度，在满载条件下进行环氧乙烷灭菌处理。满载用物品，随灭菌器用途而定。 处理完毕，取出菌片，

36、分别移种于 5 ml 营养肉汤培养基中，置 37 培养箱内 培养，7d 后观察最终结果(定性培养检测)。对难以判断结果的营养肉汤管，取其中 0.2ml 悬液接种营养琼脂平板，用 无菌 L 棒涂抹均匀，置 37 培养箱内培养。48h 后涂片染色，显微镜下观察菌 落形态，或进一步做其他试验，判断有无生长或生长的是否为试验菌。若为非 试验菌，则应重新进行试验。(4) 测试中，应同时设立定性和定量阳性对照组与阴性对照组。(5) 定量阳性对照组，以同批试验用菌片置室温下，待消毒或灭菌试验组达规 定作用时间后，立即将该菌片 2 片分别放入含 5.0ml PBS 试管中，各振敲打 80 次。取洗液按 2.1

37、.1.3 所示方法进行活菌培养计数。(6) 定性阳性对照组，以同批试验用菌片置室温下，待灭菌试验组达规定 作用时间后，立即将该菌片 2 片，分别接种于 5.0ml 营养肉汤培养基，放入 温箱中作定性培养，观察有细菌生长情况。(7) 阴性对照组，以同批次试验用未染菌样片 2 片，分别接种于 5.0ml 营养 肉汤培养基，同时将未接种过的营养肉汤培养基放入培养箱中作定性培养，观 察有无细菌生长。(8) 试验重复 5 次。(9)在 5 次试验中，每次试验中的阳性对照菌片，回收菌量均应在 5105cfu/ 片5106cfu/片；定性阳性对照组，细菌生长良好；阴性对照应无菌生长。 阳性或阴性对照若有不符

38、合上述要求的结果，试验作废，重新进行。2.1.5.6.5 评价规定在 5 次灭菌试验中，每次试验中的定量阳性对照组，检测回收菌量均达 5 105 cfu/ 片5 106cfu/ 片； 定性阳性对照组，细菌生长良好。阴性 对照应无菌生长。所有试验菌片全部无细菌生长时，可判为灭菌合格。2.1.5.6.6 注意事项(1) 温度和相对湿度对环氧乙烷气体杀菌效果影响较大，故应严格控制试 验中的有关条件。(2) 环氧乙烷液体可溶解聚乙烯、聚氯乙烯等，不可将其液体滴落于此类 物品上。环氧乙烷不论液体或气体，均可损坏赛璐璐制品，试验时应予注意。(3) 环氧乙烷易燃易爆，操作现场应采取防火防爆措施，不得有明火作

39、业 及电火花发生。(4)吸入过多环氧乙烷气体，可引起头痛，呕吐等中毒症状，严重者可致肺 水肿等。工作环境中应有良好的通风。在每日 8h 工作中，环氧乙烷浓度应不 超过 1.82mg/m3 （1ppm），15min 工作中暴露浓度不超过 9.1mg/m3（5.0ppm）。 如出现中毒症状，需迅速离开现场。轻者呼吸新鲜空气，直到症状消除；重者 应及时送医院治疗。2.1.5.7 臭氧消毒柜2.1.5.7.1 目 的测定臭氧消毒柜(下简称消毒柜)对物体表面上微生物的杀灭效果，以验证 其杀菌性能是否符合原设计规定。2.1.5.7.2 试验器材(1) 金黄色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大肠杆菌(

40、8099 )、铜绿假单胞菌（ ATCC 15442 ）、白色念珠菌( ATCC 10231 )悬液和脊髓灰质炎病毒悬液。(2) 染菌载体(10mm 10mm，以布片或玻璃片为代表，必要时可随消毒对 象，增用或改用其他载体)。(3) 臭氧采样装置和浓度分析仪。(4) 细菌定量杀灭试验用器材( 见 2.1.1.7，2.1.1.9 )。(5) 脊髓灰质炎病毒灭活试验用试液、培养基和器材(见 2.1.1.10 )。(6) 温度与湿度计。2.1.5.7.3 臭氧浓度测定(1) 仪器测定:臭氧浓度可用臭氧分析仪测定。操作按仪器使用说明书规定 进行。(2) 化学滴定法测定:参考本规范理化鉴定实验技术。2.1

41、.5.7.4 杀灭微生物试验操作程序臭氧消毒柜的臭氧发生器臭氧发生量一般不可调，故试验时设 3 个作用时间组 时间分组见 2.1.1.7.3（1）。（1）细菌和真菌杀灭试验按 2.1.1.2 所示相关方法制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、 白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要时，可增设其他试验微生物。因臭氧在柜内扩散慢，分布不易均匀，故物品在柜内应摆放至使用说明书 中规定的最高装载量(满载)，以尽量接近实际应用时的情况。以 2 片菌片一组，置一无菌平皿中，勿重叠。试验时，将放有菌片的平皿盖 打开，分层布放，每层内、中、外各点分别放一组样本。按照使用说明书要求，调节柜内温度与相对湿度，并

42、记录备查，然后开启臭 氧发生器进行消毒。消毒至规定时间，取出菌片，按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数。 对白色念珠菌的杀灭试验，用沙堡琼脂培养基，对黑曲霉菌的杀灭试验，用麦 芽浸膏琼脂培养基，其他方法和步骤均与细菌杀灭试验相同。因臭氧气体熏蒸， 载体吸收的量少、分解快，可不必进行去除残留臭氧的处理。每组试验重复 3 次。将未消毒的菌片 2 片，放置于消毒碗柜外室温下。待试验组消毒完毕后， 同时进行活菌培养计数检测。取本次试验同批的 PBS 接种培养基培养，作为阴 性对照。对未固定装于消毒箱内的臭氧发生器(如冰箱臭氧消毒器)，其杀菌效果鉴 定，可按其用途，在相应的密闭柜内进行。柜的大小

43、应与所设计的杀菌有效范 围相近。（2）脊髓灰质炎病毒灭活试验按 2.1.1.10.3 所示方法制备脊髓灰质炎病毒悬液。若无特殊要求，用 玻片为载体。在消毒碗柜满载的情况下，将干燥的染有脊髓灰质炎病毒的载体置灭菌 平皿内，每平皿放 2 片，勿重叠。在消毒碗柜每层的内、外两个点各放一含染 有脊髓灰质炎病毒载体的平皿(大型碗柜可在内、中、外各放一平皿)，平皿盖 打开。关闭柜门，开启电源，按原规定程序进行消毒。消毒完毕，按说明书规 定的时间，打开柜门，取出平皿。将载体移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振 打后，取样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒滴度。将未消毒的染有脊髓灰质炎

44、病毒的载体 2 片，放置于消毒碗柜外室温下。待 试验组消毒完毕后，立即将载体移入含 1ml 细胞维持液的试管中。振打后，取 样按 2.1.1.10.4 所示方法检测残留脊髓灰质炎病毒滴度，作为阳性对照。阴性对照，用不含脊髓灰质炎病毒的完全培养基作为阴性对照，以观察培养 基有无污染，细胞是否生长良好。试验重复 3 次。根据各组的平均病毒感染滴度（TCID50 ），分别计算其对病毒的灭活对 数值。2.1.5.7.5 评价规定对细菌及其芽孢和真菌，在 3 次试验中，所设阳性对照组回收菌量在 5105cfu/片5106cfu/片，阴性对照无菌生长，试验组中每次试验细菌及其芽孢和真菌的杀灭对数值均3；对

45、脊髓灰质炎病毒，在 3 次试验中，所设 阳性对照组，脊髓灰质炎病毒滴度达 105 (TCID50)，阴性对照细胞无污染，试 验组中每次试验病毒滴度下降 4 个对数值者，该组作用时间可作为实验室试验 消毒合格的最短作用时间。若阳性或阴性对照组的结果与上述要求不符，试验作废，重新进行。2.1.5.7.6 注意事项(1) 对试验结果有怀疑时，可在试验时同步进行臭氧浓度测定，以便作进 一步的分析。(2) 每次试验完毕，应充分排除消毒柜内的臭氧气体，勿使有臭氧残留， 以免影响随后的试验。(3) 空气中 臭氧 浓度不得超过 0.3mg/m3，臭氧吸入过多，可使人中毒， 试验场所应保持通风良好。(4) 温度

46、和相对湿度均可影响臭氧气体对细菌的杀灭效果，试验时必须控 制好这些条件，使其前后一致。2.1.5.8 臭氧水消毒器2.1.5.8.1 目的检测臭氧水消毒器发生的臭氧水消毒剂对物品表面的消毒效果，以验证臭氧水 消毒剂对物品表面消毒的实用剂量。臭氧水消毒剂指应用臭氧消毒设备制备的含臭氧的水溶液，并以其作为消毒剂， 用于对物品表面等的消毒。2.1.5.8.2 试验器材(1) 金黄色葡萄球菌( ATCC 6538 )、大肠杆菌( 8099 )、铜绿假单胞菌（ ATCC 15442 ）、白色念珠菌( ATCC 10231 )悬液和脊髓灰质炎病毒悬液。(2) 染菌载体(10mm10mm，以布片为代表，必要

47、时可随消毒对象，增用或 改用其他载体)。(3) 臭氧采样装置。(4) 细菌定量杀灭试验用器材与培养基(见 2.1.1.7，2.1.1.9 )。(5) 脊髓灰质炎病毒灭活试验用试液、培养基和器材(见 2.1.1.10 )。(6) 温度与湿度计。(7) 500 ml 塑料杯。(8) 水流量计（1L/min10L/min）。(9) 不锈钢网。(10) 臭氧浓度测定用臭氧分析仪和化学滴定法用试剂、器材等。2.1.5.8.3 臭氧浓度测定臭氧浓度的测定方法分为化学滴定法和仪器测定法。仪器测定法按仪器使用说明书要求进行。（1）通过式臭氧消毒设备测定水样流出消毒设备后臭氧浓度由高到低的衰变曲线。测定时，若出

48、水流量 可调，设 3 个流量其中应包括该设备的最大流量和最小流量，若出水流量不可 调，则按说明书要求设 1 个流量，各流量水样流出消毒设备后，即刻测定水样 中臭氧含量，然后再将水样放 20 水浴中，设 5 个6 个时间段，分别测定 水样中臭氧含量，并绘制臭氧浓度衰变曲线。（2）暴气式臭氧消毒设备测定一定容量的水体中臭氧浓度由低到高，直到臭氧浓度达饱和时的浓度变化 曲线。按说明书要求，加入规定容量的水样，通入臭氧气体，设 5 个6 个时 间段（应测出臭氧浓度达饱和时的最短时间），分别测定水样中臭氧含量，并 绘制臭氧浓度变化曲线。2.1.5.8.4 杀灭微生物试验操作程序按臭氧设备制备臭氧水消毒剂

49、的方式分为暴气式与通过式两类。（1）暴气方式臭氧消毒设备制备臭氧水消毒剂的杀灭微生物试验按 2.1.1.2 所示相关方法制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、 枯草杆菌黑色变种芽孢、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要时，可增设其 他试验微生物。 有专用容器者，按说明书要求向专用容器内加入规定容量的无菌蒸馏水无专 用容器者，用容量3000ml 的烧杯，盛装 3000ml 无菌蒸馏水样，调水温至202若无专用容器但需在更大容量的水样中进行试验者，示消毒设备状况，按使用 说明书要求调整水样用量，并调水温至 202。将不锈钢网放盛水容器底部中央，染菌布片放不锈钢网表面，染菌布片上再 盖一不锈钢网片。连接微孔扩散装置与臭氧气源出口，开启臭氧消毒设备，开始消毒处理。待臭氧暴气浸泡消毒至规定作用时间（第一个作用时间应不少于