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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流张明毕业论文.精品文档.国内图书分类号： 密级：国际图书分类号： 学号：803142学位论文大白菜抗白斑病的QTL分析张 明导 师 姓 名：张俊华 教授一级学科：植物保护申请学位级别：农学硕士二级学科：植物病理学论文提交日期： 年 月 日答辩日期： 年 月 日学位授予单位：东北农业大学答辩委员会主席： 教授年 月 日Classified Index: U.D.C:Dissertation for the Master DegreeConstruction of Molecular Genetic Map and QTL Analysis of

2、 P.capsellae Resistance in Chinese CabbageCandidate:Supervisor:Academic Degree Applied for:Speciality:Date of Oral Examination:University:Zhang MingProf. Zhang JunhuaMaster of AgriculturePlant PathologyNortheast Agricultural University目 录CONTENTS独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以

3、标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位

4、论文作者签名： 日期： 年 月 日导师签名： 日期： 年 月 日摘 要大白菜原产地是中国，是中国蔬菜栽培中分布最广、种植面积最大的蔬菜之一，也是中国出口创汇的主要蔬菜之一。特别在北方高寒地区，大白菜是城乡人民秋、冬、春三季食用的露地生产蔬菜，也是黑龙江省最主要的秋菜，每年种植面积达9万hm2以上，占每年蔬菜上市总量的40%左右，在人民日常生活中起到重要的作用。大白菜对某些疾病有明显疗效，特别是对于胸闷胀饱、肠热便秘、酒精中毒及消化不良等症有较好疗效。大白菜除含有一定量的脂肪、蛋白质和糖外，还含有较多粗纤维及磷、钙和多种维生素，其中维生素C含量则更高。大白菜的钙和维生素C的含量是同季节的苹果、梨

5、等主要水果的5倍左右，如果每天成人食用300g至400g大白菜，就可以满足人体对各种维生素的需要。大白菜白斑病是白菜类蔬菜发生较普遍的一种病害，近年来有逐年加重的趋势。该病害主要危害叶片，在叶上产生斑点，影响光合作用，从而降低产量。该病在白菜整个生长期均可发生。严重时叶片病斑融合成大的病斑，叶片逐渐枯黄脱落，对品质和产量影响很大。一般发病率为3%30%，严重地块可达80%以上，损失严重。本研究以高抗大白菜白斑病的大白菜高代自交系A154-3和高感大白菜白斑病的高代自交系P9903为父母本杂交的F2代248个单株作为图谱构建的群体，利用AFLP分子标记技术构建分子遗传图谱，并在此基础上对大白菜白

6、斑病抗性基因进行QTL分析。本试验对抗病亲本A154-3、感病亲本P9903、F1代及F2群体进行苗期人工接种白斑病菌。接种后的F1代发病程度介于抗病亲本和感病亲本之间。F2代248个单株病情从0级至9级都有分布，出现了一定的分化。根据本试验采用的F2代单株抗病类型划分标准，得出本研究中F2代抗病株数与感病株数之比为130:118，接近1:1。对F2群体的病情级数数据进行统计分析做出频率分布图，并用SPSS 13.0程序进行正态检验，结果表明，F2代单株人工接种白斑病菌后症状表现为连续变异，且基本符合正态分布，其偏度为0.1631，小于0.5，峰度为-0.9127。初步认定大白菜对白斑病的抗性

7、为不完全显性，具有加性效应，适于进行QTL定位。在AFLP标记研究中，利用亲本筛选引物，预扩增时采用 E00/M00 组合，选择扩增时采用E+3/M+3 组合，筛选了100 对引物，得到了34 对条带清晰、差异带多的引物用来扩增群体。通过对群体的AFLP分析，得到了248个 AFLP多态性位点，经Mapmaker/EXP3.0b软件处理，构建了包含13个连锁群，由 124个遗传标记组成的大白菜分子遗传图谱。该图谱覆盖长度为635.5cM，平均图距5.1cM 。每个连锁群上的标记数在316之间，平均图距在2.38.8cM之间，连锁群长度在7.0105.1cM 之间。同时又对F2代群体标记的来源进

8、行了分析，结果表明：用于构建图谱的124个AFLP标记中，来自A154-3的标记有67个，占54.03%，来自P9903的标记有57个，占45.97%。利用Windows QTL Cartographer V2.0软件和复合区间作图法进行分析，共检测到6个抗白斑病菌的QTLs位点。分别命名为R01、R02、R03、R04、R05和R06。R01、R02、R03和R04被定位于连锁群LG5 上，其中R01能解释表型变异的3.32%， R02能解释表型变异的3.98%， R03能解释表型变异的3.60%， R04能解释表型变异的3.09%。R05和R06被定位在LG13上，R05能解释表型变异的3

9、7.68%，R06能解释表型变异的35.40%，6个位点的总贡献率为87.07%，因此推断大白菜抗白斑病菌抗性为不完全显性基因控制，至少受6对以上显性基因的控制，支持数量性状基因控制白斑病抗性的观点。这一研究成果为开展大白菜白斑病抗性分子标记辅助育种提供了理论基础。关键词 大白菜 ；分子遗传图谱 ；扩增片段长度多态性（AFLP）；数量性状位点（QTL） ；大白菜白斑病菌Construction of Molecular Genetic Map and QTL Analysis of P.capsellae Resistance in Chinese CabbageAbstractChinese

10、 cabbage originated in China, it is one of vegetables which are distributed widely and are planted in the largest area in China. Chinese cabbage is the most important vegetable in Heilongjiang province, it is planted in the more than 90,000 hm2.its yield is about 40 percent of the total annual marke

11、t vegetable, and it plays an important role in peoples daily life.Consumption of Chinese cabbage has significant effects on certain diseases, especially has a good effect for typhoid constipation, chest tightness, swelling saturation, indigestion and alcoholism embolism. In addition Chinese cabbage

12、contains not only a certain amount of protein, fat and sugar, but also crude fiber and calcium, phosphorus and vitamins. Contents of Calcium and vitamin C of Chinese cabbage is 5 times higher than apples and pears. If an adult eats 300-400 grams of cabbage every day, a variety of vitamins from Chine

13、se cabbage can meet the needs of the human body. Chinese cabbage Pseudocercosporella spot disease is a more common disease in brassica vegetable.It becomes more aggravated in the recent year.The pathogen mainly hazards host leaves, It can produce spots in leaves, have a bad effect on photosynthesis,

14、 and reduce the yield. The disease can affect the host throughout the growing season，It can have a great influence on the quality and yield. Generally its incidence rate is from 3% to 30%, even more than 80% in severe land. In this study, A population of F2 generation including 248 individual plants

15、 was derived from the cross between the resistance lines A154-3 and the susceptible lines P9903. In this paper, the AFLP markers were employed in constructing a molecular genetic map and mapping QTL controlling P.capsellae resistance in Chinese cabbage. The resistance indentificaton to P.capsellae a

16、t seedling stage in greenhouse by artificial inoculation in controlled condition was done, we studied the P.capsellae resistance reaction of P1, P2, F1 and F2 and the heredity regulation. The disease index of F1 was below the mean of parents and was between A154-3 and P9903. The resistance of F1 to

17、P.capsellae was close to A154-3. The detection of the figure of frequency distribution, skew degree(0.1631) and peak degree (-0.9127) demonstrated that the disease index coincided with normal distribution. So we concluded that the P.capsellae resistance of Chinese cabbage was controlled by incomplet

18、e dominant genes and additive effect was important, and the F2 population could use to set up the genetic linkage map and locate Quantitative trait. In this study, Three-four pairs of optimum primers were selected from 100 pair of primers by parents. E00/M00 primer combination was used in pre-amplif

19、ication and E+3/M+3 primer combination was used in amplification. A molecular genetic map of Chinese cabbage was constructed by the analysis of 255 AFLP markers with Mapmaker/EXP 3.0b software, a total of 124 AFLP markers were mapped to 13 linkage groups, covering 635.5 cM with an average distance o

20、f 5.1 cM between loci. The number of markers in every linkage group varied from 3 to 16, average interval distance from 2.3to 8.8 cM and the total map distance from 7.0 to 105.1 cM.Further investigation on the source of markers from two parents was carried out. Among 118 AFLP markers used in map con

21、struction, 67(54.03%) markers derived from parent A154-3, and 53(45.97%) from another parent P9903. 6QTLs controlling P.capsellae resistance at artificial inoculation were identified with Windows QTL Cartographer V2.0 software and Interval Mapping method. 6QTLs named R01, R02, R03 , R04, R05and R06

22、identified to be related to P.capsellae resistance at seedling stage in greenhouse by artificial inoculation. R01 was located on linkage group LG5 with the explanation of 3.32% variation. R02 was located on linkage group LG5, it could explain 3.98% of the variation. R03 was located on linkage group

23、LG5 with the explanation of 3.60% variation. R04 was located on linkage group LG5, it could explain3.09% of the variation. R05 was located on linkage group LG13, it could explain37.68% of the variation. R06 was located on linkage group LG13, it could explain35.40% of the variation. So we concluded t

24、hat the P.capsellae resistance of Chinese cabbage was controlled by at least six pairs of dominant genes and the dominance was incomplete. QTL analysis results could be applied in marker-assisted selecting (MAS) for Chinese breeding. And it also provided theoretical base for improvement of P.capsell

25、ae resistance in Chinese cabbage. Keywords Chinese Cabbage ；Molecular genetic map ；AFLP ；Quantitative trait loci(QTL) ；Pseudocercosporella capsellae Candidate: Zhang Ming Speciality: Plant pathology Supervisor: Prof. Zhang Junhua1 引言1.1 研究目的与意义大白菜（Brassica campestris L.ssp.pekinensis(Lour.)Olsson）是十

26、字花科（Cruciferae）,芸薹属(Brassica)的一个亚种。其原产地是中国，是我国主栽的蔬菜作物之一，在蔬菜周年供应中占有很重要地位。大白菜因其风味清新，营养丰富，而深受人们的喜爱。特别是在北方高寒地区，是城乡人民秋、冬、春三季食用的露地生产蔬菜。在黑龙江省大白菜是最主要的秋菜，每年种植面积达9万多公顷，占全年蔬菜上市总量的40%左右，在人民日常生活中起着举足轻重的作用。大白菜对某些疾病有明显疗效，特别是对于胸闷胀饱、肠热便秘、酒精中毒及消化不良等症有较好疗效。大白菜除含有一定量的脂肪蛋白质、和糖外，还含有较多粗纤维及磷、钙和多种维生素，维生素C含量更高。因而对大白菜的深入研究有很大

27、的经济和现实意义。我国的大白菜还可远销海外，进一步增加经济效益。牛心大白菜适于加工朝鲜辣白菜、酸菜，市场前景看好。大白菜白斑病是白菜类蔬菜发生较普遍的一种病害，近年来有逐年加重的趋势。该病害主要危害叶片，在叶上产生斑点，影响光合作用，从而降低产量。该病在白菜整个生长期均可发生。严重时叶片病斑融合成大的病斑，叶片逐渐枯黄脱落，对品质和产量影响很大。一般发病率为3%30%，严重地块可达80%以上，损失严重。本试验以高抗白斑病菌的大白菜高代自交系A154-3和高感白斑病菌的大白菜高代自交系P9903为父母本杂交的F2代248个单株作为图谱构建的群体，采用AFLP标记构建大白菜分子遗传图谱。在此基础上

28、利用Windows QTL Cartographer V2.0软件对大白菜抗白斑病菌性状进行QTL定位，分析其遗传效应，并初步探讨大白菜白斑病抗性的分子基础，建立大白菜白斑病抗性育种分子标记辅助选择系统，提高大白菜的育种效率。建立大白菜抗白斑病菌育种分子标记辅助选择系统并应用于育种实践，将最直接地为我国白菜抗病育种提供一批育种新材料与种质创新技术，可加快白菜抗病优质新品种的选育速度。利用分子标记辅助育种技术所选育的抗白斑病菌的大白菜新品系，将会在大白菜抗病新品种选育中发挥巨大作用。由于新品种提高了抗病性，在我国北方地区可以提早播种，早秋收获，延长大白菜加工期，扩大北菜南运，进一步增加播种面积，

29、提高农民经济效益。抗病品种可推广到国外，增强我国大白菜品种在国际市场上的竞争力，增加出口创汇。由于新品种提高了抗病性，可以减少农药的使用量，减少对土壤环境、产品的污染，为生产绿色大白菜奠定基础。对发展绿色生态环境起到推动作用，具有重要社会效益和生态效益。1.2 文献综述1.2.1大白菜白斑病的研究进展大白菜白斑病是白菜类蔬菜发生较普遍的一种病害，近年来有逐年加重的趋势。东北、华北、华东、华南和西南等区均有分布。该病害除为害白菜外，还可侵染十字花科的许多其他蔬菜，如甘蓝、油菜、花椰菜、萝卜、芥菜、小青菜、乌塌菜等，是一种分布广、寄生多的病害（王迪轩等，2006）。主要危害大白菜叶片，在叶上产生斑

30、点，影响光合作用，从而降低产量。大白菜整个生长期均可受害，尤以9、10月份发病较多。严重时叶片长满病斑，叶片逐渐枯黄脱落，对品质和产量影响很大，一般发病率为3%30%，严重地块可达80%以上，减产23成 ，损失严重。同时大白菜白斑病常与霜霉病同时发生，引起叶片早期枯死，直接影响了秋白菜的产量和品质 （陈秀环，2000）。1.2.1.1症状 大白菜白斑病主要危害叶片，从植株基部的成熟叶片开始发病，逐渐向上部叶片发展。发病初期叶面上出现灰褐色微小的圆形斑点，以后逐渐扩大成圆形、卵形或不正圆形病斑，中央变成灰白色，病斑直径310 mm，有不明显的轮纹，边缘有苍白色或淡黄绿色的晕圈，稍凹陷。空气潮湿时

31、在病斑背面产生淡灰色的霉状物，即病菌的分生孢子和分生孢子梗（唐绍远，1985）。后期病斑呈半透明状，组织变薄，容易破裂穿孔。发病严重时，多数病斑常彼此合并成不规则形的大病斑，最后叶片枯黄，逐一脱落。1.2.1.2病原病原菌为Pseudocercosporella capsellae( Ell.&Ev. ) Deighton，称为芥假小尾孢，属无性菌类真菌。异名Cercospora allbomaculans（Ell.et Ev）Sacc.其有性态为Leptosphaeriaolericola Sacc.称油菜小球腔菌，属于囊菌门真菌。菌丝体蔓延于寄主细胞间，无色，有隔膜。分生孢子梗210簇生，

32、从叶背的气孔伸出，线形，大小712.622.7um，无色，单胞，直或稍弯曲，顶端着生分生孢子1个。分生孢子无色，细长，线形或鞭状，直或稍弯曲，有隔膜34个，大小406522.5 um（江扬先，2005）。该菌在PDA培养基上只长菌丝，不长孢子 。分生孢子在7-9水滴中，即可萌发，最适萌发温度为18-25（于晓霞，2009）。在25温度条件下，孢子浓度为光学显微镜下（1040）平均每视野9-10个孢子，观察24-72h，以48h后1%蔗糖溶液萌发率最高（84.62%），1%白菜汁液次之（61.17%），对照无菌水为23.4%。该病菌主要侵染大白菜、小白菜、油菜、芜菁、萝卜、花椰菜、甘蓝、青花菜、

33、羽衣甘蓝、芥菜及蔊菜等（王迪轩等，2006）。1.2.1.3发病条件(1温度大白菜白斑病在528均可发病，最适宜的温度为1123，大白菜白斑病属低温病害。所以，在我国海拔高、冷凉的地方，发病相当严重。 (2)湿度当相对湿度在60以上时，有利于分生孢子产生和萌发，侵染植株发病。大白菜白斑病对湿度要求不是很高。如果温度在1120，昼夜温差大，又多雨，或结露多，造成的温暖潮湿的环境发病重，病害容易流行。 (3)种子带菌播种带菌的种子，为病害的发生流行提供菌源。 (4) 品种选种抗病品种，发病可减轻；相反，种植感病品种，发病就重。种植早熟品种或白帮品种容易发病，种植晚熟品种或青帮品种发病轻。 (5)栽

34、培管理连作病地发病重。一般播种早、种植过密、肥料又不足、植株生长势弱，发病也重。1.2.1.4侵染循环病菌主要以菌丝体，特别是分生孢子梗基部的菌丝块随病叶遗落在土表越冬，也可以菌丝体在菜株的病部越冬。在环境条件适合时产生分生孢子，成熟后随风飞散，落于感病的寄主上发芽侵入，引起初次侵染。侵入后菌丝体在寄主组织内蔓延，环境条件适宜时，在病部长出分生孢子，引起再次侵染。分生孢子也可以附着在种子上传播。大白菜白斑病一般在8月中、下旬开始发生，9月份发病最盛，10月以后病害逐渐减少。秋季多雨潮湿，发病常严重（张永志，1995）。1.2.1.5抗性鉴定（1）苗期抗病性鉴定魏毓棠在前人的研究基础上，制定了一

35、套大白菜白斑病苗期鉴定技术。由于大白菜白斑病菌兼性寄生能力强，在普通培养基上难诱发出分生孢子，他们采用白菜汁组合培养基（白菜叶煎汁200g、VB0.01g、蔗糖20g、琼脂15g，煮融加水定容1000ml）灭菌后，制成平板，待平板冷却后，再在其表面浮加经过表面灭菌的新鲜大白菜叶片（直径5-7cm）数片，接种此叶片，20-25培养7d，可产生较多分生孢子。用软毛笔轻轻扫下分生孢子，以0.5%蔗糖水液配成孢子悬浮液，其孢子浓度约为1.4106个/ml、喷雾接种于大白菜4真叶龄的苗上，事后覆盖塑料薄膜保湿48-72h，温度18-20，观察记载发病情况。初步研究表明，品种间存在一定的抗性差异。表现感病

36、的品种有福山包头、城阳青、丹东中花心、翻心白、翻心黄、鹌鹑囤及胶三叶等。表现抗病的品种有沈农青丰、山海关青麻叶、通化大白菜、鲁白3号等。（2）抗性生理生化的研究大白菜白斑病对大白菜的危害程度，受很多因素的影响。除了受环境条件的影响外，还受品种抗病性、不同世代抗病性的影响。不同抗性的亲本所配的不同组合及世代抗性不同的原因可能是因为存在着与抗性相关的生理生化性状的差异。传统的大白菜白斑病的鉴定方法时间较长，且对环境条件要求较严格，主要根据肉眼观察植株的症状，人为的规定病情指数，来决定植株的抗病程度，这样往往也会出现一定的误差。通过找出与大白菜抗白斑病相关的生理生化性状，就可以在苗期分析这些性状，以

37、此来鉴定抗白斑病的能力，克服了室内人工控制接种鉴定方法的不足。同时，通过生理生化分析将会不断揭示植物抗白斑病的内在原因。通过生理生化性状分析，间接鉴定大白菜品种对白斑病的抗性，为生理生化育种奠定理论基础。李春燕等人对大白菜抗白斑病的生理生化相关性状进行研究，采用4个大白菜高代自交系（2个高抗亲本，2个感病亲本），按照Griffing双列杂交遗传交配设计方法配制F。全部材料进行苗期人工接种抗病性鉴定。其中用4个亲本进行了性状相关分析及筛选，用P，F来研究抗病性及其相关的生理生化的规律。结果表明过氧化氢酶活性同抗病性呈极显著负相关，可溶性糖、谷氨酸、丙氨酸、精氨酸同抗病性达到极显著正相关。过氧化氢

38、酶活性同抗病性呈极显著负相关的主要原因是过氧化氢在氧化酶的作用下能够氧化成食子酚、愈创木酚、邻苯二酚、对苯二酚等，而酚类又可氧化成醌类，醌类毒性很强，能钝化病原物的呼吸酶，阻碍病原物的生长，其次酚类化合物是细胞形成本质素的前体，可形成木质素，促进细胞壁木质化，以抵抗病菌侵染，过氧化氢酶是催化分解过氧化氢反应的酶，因此它同抗病性呈极显著负相关。氨基酸同抗病性达到极显著正相关的主要原因是氨基酸同酚类化合物能发生缩合反应而形成对微生物有毒的产物，氨基酸对病原物的直接的抑制作用可能性不大，它可能是合成病原菌抑制剂的基础物质，尤其是谷氨酸，是合成许多氨基酸的前体，至于这3种氨基酸是如何合成病原菌抑制剂的

39、原理，还有待于进一步研究。1.2.1.6大白菜白斑病的遗传研究进展魏毓棠等人于1988年至1990年，采用44完全双列杂交的方法，对大白菜苗期、成株期抗白斑病的遗传变异规律进行了研究。研究表明大白菜抗白斑病菌的抗性受4对以上基因控制，为不完全显性，回交效应显著，正反交差异不显著呈现核遗传，细胞质作用不显著。一般配合力(G.C.A)和特殊配合力（S.C.A）均较重要，符合“加性-显性”模型，加性效应是主要的。这种抗性表现亲代和子代间存在极显著正相关，苗期人工接种鉴定和田间成株抗性鉴定发病趋势一致的，呈现出数量性状遗传的特点。1.2.1.7 大白菜白斑病的防治方法（1）选用抗病品种。大白菜品种对白

40、班病菌的抗性存在一定的差异，可选用抗病品种是防治大白菜白斑病的最经济有效的措施。防治白斑病的大白菜品种，可选用旱熟5号(新株系)、春夏王、改良青杂3号、辽白7号、吉研5号、津绿55、津绿75、津绿64、绿星70、天正秋白1号、小青口、大青口、辽白1号、疏心青白口等较抗病。（2）清除初侵染源种子消毒可用50的温水侵种20min后，移入冷水中冷却，晾干播种;或选用相当于种子重量0.3%的25%瑞毒霉可湿性粉剂、0. 4%的7 5%百菌清可湿性粉剂拌种。收获后，清洁田园，深翻晒上，把病株和病叶埋入上中，消灭过冬菌源。（3）加强栽培管理科学管理肥、水。施足底肥，增施磷钾肥。前期小水勤浇，中、后期稳水、

41、足水灌溉。追肥前重后轻，即莲坐期每亩施碳铵30千克；包心中、后期，随水带肥，亩施碳铵20千克;最后一次，随水带肥，亩施碳铵510千克。这样，可促使植株生长健壮，增强抗病力。雨后注意排水，严防田间积水，并及时中耕松上(到外叶封行不能动锄为止)，提高土壤温度，抑制发病。（4）农业措施实行轮作，与非十字花科蔬菜轮作23年。采用高垄(高1518cm)、短畦(长10m)栽培模式，适当迟播，切勿过旱抢种；重发病区，最好适当迟播。（5）农药防治防治白斑病，应从莲坐期发病时(病株率5%10%)开始打药为好。喷施25%嘧菌酯悬浮剂1500倍液或40%多.硫悬浮剂600倍液或50%多霉威可湿性粉剂800倍液、65

42、%甲硫霉威可湿性粉剂1000倍液、50%多菌灵可湿性粉剂500倍液、20%丙环唑微乳剂3500倍液、70%锰锌乙铝可湿性粉剂500倍液、50%异菌脲可湿性粉剂1000倍液，或50%多菌灵可湿性粉剂+5%井冈霉素水剂1：1.5混合后稀释700倍液，每667没噴药液50-60L，间隔15d左右1次，共防2-3次。1.2.2 分子标记技术分子标记（DNA标记）是遗传标记的一种类型，可以明确反映基因组中任何座位上的相对差异的生物特征（方宣钧等，2001）。DNA标记是在形态标记（morphological markers）、细胞学标记（cytological markers）和生化标记（biochem

43、ical markers）之后产生的的一种较为理想的遗传标记，它能直接反映植物DNA水平上的遗传多态性，甚至可以区别单个核苷酸的差异，是遗传标记上的一个飞跃。DNA分子标记对隐性农艺性状的选择十分有利，主要表现在其不受基因表达的影响，可在任何组织、任何发育阶段进行检测，而且大多数分子标记呈现共显性。同时基因组DNA的变异非常丰富，分子标记的数量几乎是无限的，而且所有生物的检测程序基本一致。因此，分子标记技术的发展和应用为植物标记辅助育种提供了一条崭新的途径。分子标记与传统的遗传标记相比具有很多优点：变异类型丰富，多态性高。不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁，表现为“中性”。 数量极多

44、，遍及整个基因组。不受组织、器官、环境条件和发育时期的限制，具有很高的稳定性，直接以DNA的形式表现。许多分子标记表现为共显性，能够鉴别纯合基因型与杂合基因型。广义上讲，分子标记包括两类，即同工酶标记和DNA标记。狭义的分子标记仅指DNA标记。1.2.2.1 同工酶标记同工酶是指催化同一反应而结构不同的一簇酶，是一类底物相似或完全相同的酶分子形式。它们既由等位基因决定，又受到非等位基因的控制。前者称为“等位酶”。因不同的同工酶形式在电荷和分子量等方面的存在差异，采用凝胶电泳技术将它们分开，在专一的底物和特殊的染料染色的情况下，在胶柱中会出现同工酶谱，可以通过光学扫描技术和相应的计算机分析软件进

45、行定量分析它们的差异。鉴于同工酶作为生物基因表达的产物，其受到严格的遗传控制，因此同工酶可以作为物种的遗传标记，其可应用在物种和亲缘关系的鉴定、新物种的寻找和开发、植物的发育生物学分析等方面，在分子标记的发展中起到重要作用（赵坚义，1998）。同一生物的不同发育期会表现出不同的同工酶酶谱，主要由于同工酶是基因表达的产物，受到生物在发育过程中基因表达的时序控制，这就会给物种间关系的研究造成了一定的干扰。这就导致同工酶分析在植物的研究上受到发育阶段和环境条件的影响，在研究中特别强调取材的一致性。同工酶的应用受到一定的限制主要是同工酶只能反映一部分功能基因（外显子）的情况，而对大部分功能基因和大量非

46、功能基因无法表现。因此在分子标记辅助育种、QTL（数量性状基因定位）制图、遗传多样性、分子进化等需要大量标记的研究中，同工酶标记逐渐为DNA标记所取代。尽管如此，同工酶分子标记以其共显性表达、重复性强，操作简便等优点使其仍在种群遗传、分子进化、适应的分子基础、功能基因的克隆等方面具有DNA标记所不可替代的作用。1.2.2.2 DNA分子标记1980年兴起的分子标记技术到目前已经经历了30余年历史，在这30余年中一些新的分子标记技术不断问世，并被广泛应用于各个研究领域。不同学者根据不同的分类标准，将分子标记技术分为不同的类型，如王斌（2000）以检测技术和检测对象为基础将分子标记技术分为以传统分

47、子杂交技术为基础、以PCR为基础、以重复序列为基础以及以mRNA为基础的4种类型。王志林等（2001）把分子标记技术分为以分子杂交为基础的，以PCR为基础的和以芯片技术为基础的3个类型；方宣钧等（2002）依据DNA多态性的检测手段，将DNA标记分为4大类：基于DNA-DNA杂交的DNA标记、基于单核苷酸多态性的DNA标记。尽管分类的依据不同，但各种分子标记技术都具有不同的特点，针对不同的研究目标，可以选用不同的分子标记技术，以达到高效和可靠的选择目的。几种常用的分子标记技术如下。1）限制性片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）RFLP技术是Grodzicker于1974年创立的，是研究最早的分子标记技术，具有重复性好、稳定可靠、标记数量多、呈共显性标记等特点，已应用于遗传育种、连锁图的构建、基因定位、数量性状基因座分析、杂种优势遗传成因剖析、资源评估、物种起源等方面的研究中。其技术原理是基于限制性核酸内切酶酶切消化核酸以及标记的DNA探针能与任何序列相似的片段杂交，通过片段长度的变异检测多态性。由于RFLP但RF