国家自然科学基金标书范本.doc

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1、 国家自然科学基金申请书申请代码：C03030206受理部门： 收件日期：受理编号：第 22 页 版本1.005.687国家自然科学基金申 请 书您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:中 方法: Word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中 (如果您是Word97用户，继续执行以下步骤) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击启用宏按钮，即可开始填写本文档或打印了资助类别：面上项目亚类说明：自由申请项目附注说明： 项目名称：ERM蛋白在晚期糖基化终产物致内皮细胞损伤中的作用申 请 者：黄巧冰 电

2、话： 020-61648186 依托单位：南方医科大学 通讯地址：广州白云区同和沙太南路南方医科大学基础医学院 邮政编码：510515 单位电话：020-61648169/13794424121 电子邮件：bing 申报日期： 2007年3月25日国家自然科学基金委员会基本信息r9fNKlIO申 请 者 信 息姓名性别女出生年月1963年2月民族汉族学位博士职称敘授传真020-87277521 个人网页 工作单位南方医科大学 /基础医学院病理生理教研室在研项目批准号 依托单位信息名称代 码51051501 联系人余克强 电子邮件yukq 电话020-61648169/13794424121 网

3、站地址 合作单位信息单 位 名 称代 码 项 目 基 本 信 息项目名称资助类别面上项目 亚类说明自由申请项目 附注说明 申请代码C03030206:内分泌学及代谢病C030204:病理生理学基地类别 预计研究年限2008年1月 2010年12月研究属性基础研究 申请经费34.4000万元摘 要(限400字)：内皮细胞功能损伤致血管通透性增加是糖尿病性微血管病发生的重要机制，晚期糖基化终产物（advanced glycation end product, AGE）的聚积对内皮细胞的损伤作用是主要原因。ERM作为细胞膜蛋白和胞内骨架蛋白的重要连接蛋白，在内皮细胞形态和功能变化中起重要作用。本研究

4、通过培养细胞、游离微血管和整体动物模型，利用免疫组化、蛋白磷酸化检测、激酶特异性抑制剂、激酶无活性突变体重组腺病毒感染技术、RNAi干扰技术和和通透性测定等方法，在细胞、组织和整体水平研究AGE对内皮细胞ERM蛋白磷酸化水平的影响以及与内皮细胞形态和屏障功能的关系，鉴定AGE调控ERM磷酸化的上游信号通路以及ERM磷酸化位点，阐明ERM蛋白在AGE所致内皮细胞功能变化以及微血管损伤的信号通路及其机制。关 键 词(用分号分开，最多5个)糖尿病性微血管病； ERM 蛋白； 晚期糖基化蛋白终产物；内皮细胞；通透性 项目组主要成员（注: 项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写

5、此栏。）编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）11978-9-8 男博士生硕士南方医科大学 020-62789102 cbin2001 分子生物学实验 10 21979-10-27 男助教硕士南方医科大学 020-62789102 lq791027 细胞学检测 10 31978-7-23 女博士生硕士南方医科大学 020-62789102 lanblue723 分子生物学实验 10 41970-1-6 女实验员其他南方医科大学 020-62789102 shock 微血管分离通透性测定 10 51980-2-22 男博士生硕士南方医科大学 020-62

6、789102 smu868 动物模型制备 8 6789总人数高级中级初级博士后博士生硕士生6123说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。经费申请表 （金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费27.7000主要用于实验材料费1.科研业务费4.7000（1）测试/计算/分析费2.0使用共聚焦显微镜的费用和细胞及微血管三维重建分析（2）能源/动力费1.0000交纳水电费（3）会议费/差旅费0.7000参加国内学术会议（4）出版物/文献/信息传播费1.0000（5）其它2.实验材料费21.0000（1）原材料/试剂/药

7、品购置费13.5000细胞株，各种抗体，关键酶的激动剂和抑制剂，荧光标记蛋白，其它分子生物学制剂，动物（2）其它7.5000RNAi的设计、体外转录和载体构建等3.仪器设备费2.0000（1）购置2.0000细胞培养和观察器皿，通透性测量小皿，显微外科器械（2）试制4.实验室改装费5.协作费二.国际合作与交流费2.70001.项目组成员出国合作交流1.2000参加全美实验生物学年会2.境外专家来华合作交流1.5000拟邀请加州大学Davis分校的袁源教授访问实验室三.劳务费2.0聘请临时工四.管理费2.0000合 计34.4000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部

8、门匹配）其他经费来源合计0.0000报告正文1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）（基础研究需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；应用研究需结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。）根据国家卫生部公布的资料，我国糖尿病患者的人数在最近十年内增加了一倍，目前已有超过4千万人之众，而且患病年龄愊趋年轳，成为危害人民健庳的醍大兤共卪生闦题糖尿病及其并发痏正圠严重地消耗着宝贵的卫生资源，给个人、家庭、社会带来沉重的负担。虽然提供好的临床护理可以提高糖尿病病人的生活质量，但糖尿病并发症所致的发病率和病死率没有明显改善。一、糖尿病性微血管病

9、的发生是患者并发心血管疾病的主要起因糖尿病患者的主要死因为心血管并发症，如糖尿病性心脏病、糖尿病视网膜病、糖尿病性肾病和糖尿病性神经病变等并发症的发生发展与糖尿病性微血管病密切相关1。糖尿病性微血管病指的是在各种病因的作用下，微循环水平上微血管、微血流和微血管周围的细胞发生形态改变和/或功能紊乱。糖尿病引起的微血管病属于慢性微血管病，其发生机制尚未阐明，目前认为主要：1. 与糖尿病高血糖代谢过程中产生的大量自由基而引发的氧化应激有关；2. 与糖尿病时的高血糖、高游离脂肪酸导致内皮细胞损伤和微血管功能障碍有关2。内皮细胞结构和功能受损是糖尿病发病的始动环节，由此所致的血管通透性的增高是糖尿病微血

10、管并发症的一个标志性事件，是其发生的最初表现和导致其他后续改变的病理基础3。二、晚期糖基化终产物在糖尿病微血管病内皮细胞功能变化中的作用在糖尿病微血管病的发生过程中，高血糖所引起的蛋白质非酶糖基化形成的晚期糖基化终产物（advanced glycation end product, AGE）的作用已引起广泛的重视。AGE是一组在蛋白质赖氨酸的氨基部分和还原糖的醛基之间发生非酶性糖基化反应生成的终产物的总称4 。血管内皮细胞和巨噬细胞表面均有AGE受体（receptor of AGE, RAGE），当AGE与RAGE结合后，可以引起氧化应激和相关细胞信号转导通路的激活，导致细胞的功能变化。巨噬细

11、胞主要发挥清道夫的作用，吞噬和清除AGE。内皮细胞的RAGE与AGE结合后，通过一系列信号转导机制，引起内皮细胞的收缩，导致内皮细胞的功能障碍甚至损伤，屏障功能受损，血管通透性升高5。本课题组在广东省自然科学基金团队项目（资助号）的资助下，对AGE损伤血管内皮细胞的作用和机制进行了初步的探讨。发现AGE以时间和剂量依赖的方式引起内皮细胞骨架肌动蛋白F-actin和G-actin形态和紧密连接蛋白结构的改变，并导致单层内皮细胞通透性的明显升高；可溶性RAGE的抗体可阻抑AGE诱导的细胞骨架和细胞间连接结构变化和单层内皮细胞通透性升高；研究还进一步证明p38 MAPK 参与了AGE介导的内皮细胞功

12、能障碍的信号转导过程，其中p38 MAPK的和亚型发挥主要作用6 。但研究也提示MAPK等信号并不直接导致F-actin的功能改变，AGE对内皮细胞功能的影响还需要其它连接蛋白的中介来实现 7。三、ERM蛋白在内皮细胞功能调节中的作用ERM是同属于血红蛋白4.1超家族的三种蛋白，分别是Ezrin（埃兹蛋白）、Radixin（根蛋白）和Moesin（膜突蛋白，以下均以英文称呼）。ERM是细胞膜蛋白和胞内骨架蛋白的重要连接蛋白，并且参与了多个信号转导的过程，因此在正常细胞活动，包括细胞形态变化、粘附和运动及其血管通透性调节中起重要作用。ERM蛋白的结构和功能有高度同源性，在氨基末端有一个同源性很高

13、的FERM功能域（FERM domain），在羧基末端的不同氨基酸位置上有一个关键的、与其激活有关的苏氨酸磷酸化位点，其中Ezrin是T567，Radixin是T564，Moesin是T558。ERM功能调节的一个重要环节就是苏氨酸残基的磷酸化。非磷酸化ERM通过细胞内相互作用呈折叠构像，掩藏了与其它分子的结合位点。苏氨酸磷酸化后引起构像的改变，暴露结合位点。由于暴露的羧基末端尾部具有肌动蛋白细胞骨架结合位点（F-actin binding site），故通过ERM蛋白的桥接作用，可将肌动蛋白微丝与细胞膜相连，从而产生一系列的细胞功能，如细胞形态的改变、细胞运动、粘附、有丝分裂、细胞极性等8，

14、9。可以这样理解，氨基末端酪氨酸的磷酸化启动了ERM与浆膜配体即胞外信号的传入，而羧基末端苏氨酸的磷酸化则激活了与actin等的结合，导致细胞功能的进一步变化。直接导致ERM磷酸化的激酶在许多细胞中还未鉴定出来，但普遍认为Rho GTPase 家族是其中重要的参与者。对中性粒细胞的研究证实，Rho GTPase 对ERM功能的调节是动态的，Rho家族的三个主要成分 Rho、Rac 及cdc42中，Rho A激活ERM磷酸化起到正调节的作用，而Rac GTP 抑制ERM的磷酸化而起到负调节的作用10，11 。对内皮细胞的功能研究提示，Rho GTP 介导内皮细胞肌动肌球蛋白的收缩，引起通透性的增

15、高；而Rac GTP则可能通过维持细胞间连接的完整性而保护内皮细胞的屏障功能12。由此可以推测，在内皮细胞Rho GTP 通过使ERM磷酸化导致肌动肌球蛋白的收缩，引起细胞屏障功能的障碍。但是，到目前为止，还没有明确证据证明Rho GTP 通过其下游Rho激酶（Rho kinase，ROCK）直接导致ERM的磷酸化。研究还提示丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号转导通路也参与介导ERM的苏氨酸磷酸化。Turner的实验室等用p38抑制剂PD169316和SB202190预处理小肠上皮细胞，可以抑制由钠葡萄糖共转移所介导的Erzi

16、nT567位点的磷酸化13，14。研究还提示，在Rho GTPase 介导的信号传导通路中，MAPK家族是重要的下游底物。活化的Rho家族成员协同Raf通过一系列激酶活性逐级放大导致ERK1/2和p38的激活，构成一条新的信号通路15。四、ERM蛋白在AGE介导的内皮细胞功能变化中的可能作用ERM蛋白广泛存在于各种细胞类型，其细胞功能和信号调节已在各种上皮细胞、白细胞等模型中被广泛研究，被关注的主要蛋白成分是ezrin。可以推测ERM在维持内皮细胞结构和功能中也起重要作用。已有研究证明，内皮细胞表达的主要ERM成分是Moesin16。对于ERM蛋白、特别是Moesin在内皮细胞形态和功能调节中

17、的作用鲜见报道。至今为止只有Koss M等报道了TNF-介导内皮细胞通透性的升高需要ERM的参与。该研究提示，TNF-通过导致ERM羧基末端苏氨酸的磷酸化引起血管内皮细胞屏障功能的障碍，通透性增加16。研究还提示ERM的苏氨酸磷酸化主要通过蛋白激酶C（PKC）、Rho GTPase 和MAPK如p38等信号通路所介导，但对这些通路的关系未作进一步的探讨。有关ERM介导AGE引起的细胞功能变化，只有Bach等在肾小管上皮细胞模型上的实验提示细胞内的AGE可与ERM中的Ezrin直接结合，从而影响ERM蛋白的磷酸化激活，影响细胞骨架结构重排，致肾小管上皮细胞的异常黏附和附着，表现为肾小管通透性增加

18、，蛋白尿形成17。由于大部分的文献都证明AGE作用于血管内皮细胞主要是通过其受体发挥作用7,18,19，而且糖尿病所致AGE的增多主要表现在血浆水平的升高，内皮细胞又是首当其冲受到影响的靶细胞20。因此，我们推测糖尿病病人血浆中升高的AGE与内皮细胞表面的受体（RAGE）结合，激活Rho GTPase中的Rho，并进一步活化ROCK， ROCK可能直接磷酸化激活ERM。AGE与受体结合后也可能通过尚未知的途径，激活p38 MAPK通路使ERM磷酸化。磷酸化的ERM与F-actin结合，形成应力纤维，内皮细胞收缩，从而导致细胞间黏附连接和紧密连接结构的断裂，使内皮细胞屏障功能降低，血管通透性升高

19、。工作思路见下图1。本研究以ERM蛋白为主要研究靶点，通过探讨AGE作用于内皮细胞导致其结构和功能变化的细胞和分子机制，进一步阐明糖尿病特别是糖尿病性微血管病以及其它相关疾病的发病机制。ERM作为调节内皮细胞功能和结构变化的重要功能蛋白，不仅仅是AGE介导的通路的下游靶分子，还可能是氧自由基、PKC和其它致病途径的靶分子。对ERM在内皮细胞功能调节作用的阐明，将有助于找到糖尿病多种致病途径的结合点，使其成为糖尿病性微血管病和其它相关疾病治疗的更有效的新靶点。Reorganization of F-actinAGERho GTPROCKERMERMPMKK3/MKK6ERMp38 MAPKDis

20、ruptions of adhesion junction and tight junctionEndothelial barrier dysfunction and hyper-permeabilityReceptor mediated signalCell membraneRAGE？参考文献：1. 袁申元，杨光燃，袁明霞。重视糖尿病微血管并发症的防治。微循环学杂志 2006; 16(1): 6-7. 2. 金惠铭，胡仁明。糖尿病性微血管病的临床病理生理。中国病理生理杂志 2007; 23(2): 399-402。3. Leto G, Pricci F, Amadio L, et al. I

21、ncreased retinal endothelial cell monolayer permeability induced by the diabetic milieu: role of advanced non-enzymatic glycation and polyol pathway activation. Diabetes Metab Res .2001;17: 448-458.4. Brownlee M, Vlassara H. Advanced protein glycosylation in diabetes and aging. Annu Rev Med .1995; 4

22、6:223-234.5. Wautier JL, Zoukourian C, Chappey O, et al. . Receptor-mediated endothelial cell dysfunction in diabetic vasculopathy: soluble receptor for advanced glycation end products blocks hyperpermeability in diabetic rats. J Clin Invest. 1996; 97(1): 238-243.6. Xiao-Hua Guo, Qiao-Bing Huang, Bo

23、 Chen, Shu-yun Wang, Qiang Li, Yan-jun Zhu, Fan-Fan Hou, Ning Fu , Ming Zhao. Advanced glycation end products induce actin rearrangement and subsequent hyperpermeability of endothelial cells. APMIS 114 (12): 874-883.7. Tamma G, Klussmann E, Oehlke J, Krause E, Rosenthal W, Svelto M, Valenti G. Actin

24、 remodeling requires ERM function to facilitate AQP2 apical targeting. J Cell Sci. 2005; 118(Pt 16):3623-30. 8. Tsukita S, Yoe uaY Tsukita S. ERM (ezrin/radixin/mo%sn( faAiLy8 rmct*sjeleton to signal transduction. Curr Opin Cell Biol 1997; 9 (1):7075. 9. Mangeat P, Roy C, Martin M. ERM proteins in c

25、ell adhesion and membrane dynamics. Trends Cell Biol. 1999; 9(5):87-192. 10. Ivetic A, Ridley AJ. Ezrin/radixin/moesin proteins and Rho GTPase signalling in leucocytes. Immunol. 2004; 112(2): 165-76. 11. Lee JH, Katakai T, Hara T, Gonda H, Sugai M, Shimizu A. Roles of p-ERM and Rho-ROCK signaling in

26、 lymphocyte polarity and uropod formation. J Cell Biol. 2004; 167(2):327-37. 12. Wojciak-Stothard B, Ridley AJ. Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability. Vasc. Pharmacol. 2003; 39(4-5):187-99.13. Zhao H, Shiue H, Palkon S, Wang Y, Cullinan P, Burkhardt JK, Musch MW, Chang EB, Turne

27、r JR. Ezrin regulates NHE3 translocation and activation after Na+ glucose cotransport. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 9485 9490. 14. Shiue H, Musch MW, Wang Y, Chang EB, Turner JR. Akt2 phosphorylates ezrin to trigger NHE3 translocation and activation. J. Biol. Chem. 2005; 280 (2): 16881

28、695.15. Shirai H, Autieri M, Eguchi S. Small GTP-binding proteins and mitogen-activated protein kinases as promising therapeutic targets of vascular remodeling. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2007 ;16(2):111-5. 16. Koss M, Pfeiffer GR 2nd, Wang Y, Thomas ST, Yerukhimovich M, Gaarde WA, Doerschuk CM, W

29、ang Q. Ezrin/radixin/moesin proteins are phosphorylated by TNF-alpha and modulate permeability increases in human pulmonary microvascular endothelial cells. J Immunol. 2006; 176(2): 1218-27.17. Bach LA, Gallicchio MA, McRobert EA, Tikoo A, Cooper ME. Effects of advanced glycation end products on ezr

30、in-dependent functions in LLC-PK1 proximal tubule cells. Ann N Y Acad Sci. 2005 ; 1043:609-16. 18. Monnier VM, Sell DR, Genuth S. Glycation products as markers and predictors of the progression of diabetic complications. Ann N Y Acad Sci. 2005 ; 1043:567-81. 19. Yamamoto Y, Doi T, Kato I, Shinohara

31、H, Sakurai S, Yonekura H, Watanabe T, Myint KM, Harashima A, Takeuchi M, Takasawa S, Okamoto H, Hashimoto N, Asano M, Yamamoto H. Receptor for advanced glycation end products is a promising target of diabetic nephropathy. Ann N Y Acad Sci. 2005;1043:562-6. 20. Schalkwijk CG, Ter Wee PM, Stehouwer CD

32、. Plasma levels of AGE peptides in type 1 diabetic patients are associated with serum creatinine and not with albumin excretion rate: possible role of AGE peptide-associated endothelial dysfunction. Ann N Y Acad Sci. 2005 ;1043:662-70. 2. 项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题。（此部分为重点阐述内容）研究内容：（1） AGE对内皮细胞ERM蛋白磷酸化

33、的影响：用RT-PCR和western blot等方法，证明正常内皮细胞表达ERM蛋白的种类和水平；采用Western blot和免疫组化方法观察AGE对ERM磷酸化水平的影响和移位情况，包括时间和剂量效应；选用针对ERM特定位点的磷酸化抗体和ERM磷酸化位点突变技术以及质谱分析等鉴定 ERM的磷酸化位点。（2） AGE调控ERM磷酸化的上游信号通路：观察AGE作用内皮细胞对ROCK和ERK、p38 MAPK磷酸化水平的动态影响；观察用ROCK和ERK、p38 MAPK特异性抑制剂预处理细胞后对AGE介导的ERM 磷酸化水平的影响；利用RNAi技术降低或减少ROCK和MAPK的表达，观察相应信

34、号被抑制后对AGE介导的ERM 磷酸化水平的影响。（3） ERM磷酸化水平的改变是否影响内皮细胞屏障功能：选用单层内皮细胞模型和制备AGE慢性作用的动物模型，通过siRNA、ERM磷酸化位点突变体转染等技术，观察ERM磷酸化被抑制后单层内皮细胞和微血管屏障功能的变化。研究目标：本研究通过培养细胞、游离微血管和整体动物模型，利用免疫组化、蛋白磷酸化检测、激酶特异性抑制剂、激酶无活性突变体重组腺病毒感染技术、RNAi干扰技术和和通透性测定等方法，在细胞、组织和整体水平研究AGE对内皮细胞ERM蛋白磷酸化水平的影响以及与内皮细胞形态和屏障功能的关系，鉴定AGE调控ERM磷酸化的上游信号通路以及ERM

35、磷酸化位点，阐明ERM蛋白在AGE所致内皮细胞功能变化以及微血管损伤的信号通路及其机制。拟解决的关键问题：（1）鉴定调控AGE影响ERM磷酸化的上游信号通路：AGE是否通过激活下游Rho和MAPK信号通路，实现对ERM磷酸化水平的影响；（2）AGE影响ERM磷酸化的后果：AGE 介导的ERM磷酸化水平的变化是引起内皮细胞骨架和相关连接结构形态和功能改变，从而导致内皮细胞屏障功能障碍和血管通透性升高的重要环节。3、拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）研究方案：本课题拟通过培养的内皮细胞、游离微血管和动物模型，利用免疫组化、蛋白磷酸化检测、激酶特异性抑

36、制剂、激酶无活性突变体重组腺病毒感染技术、RNAi干扰技术和通透性测定等方法，在细胞、组织和整体水平探讨ERM蛋白磷酸化在AGE所致内皮细胞屏障功能变化中的作用，查明介导ERM激活的信号通路。本课题的具体研究方案如下：（1）AGE对ERM磷酸化的影响要探讨ERM蛋白在AGE介导的内皮细胞功能变化中的作用，首先要证明AGE确实引起ERM的磷酸化并明确其磷酸化位点。拟进行以下几方面的工作：A. AGE的制备：用糖孵育法制备AGEs修饰的牛血清白蛋白（AGE-BSA）（参照论文Hou FF et al. Kidney Int 2001; 59:990-1002）。用1.75 mg/mL的牛血清白蛋白

37、（bovine serum albumin，BSA）在含100 mmol/L的D-葡萄糖、200 U/mL的青霉素、70 g/mL庆大霉素和1.5 mmol/L PMSF的磷酸缓冲液（100 mmol/L）中，于37孵育8周。以相同条件但不含葡萄糖的缓冲液孵育的牛血清白蛋白作为对照。孵育结束后以无菌的PBS（PH7.4）透析以除去未结合的葡萄糖。制备的样品经抗AGE抗体用荧光分光光度法进行鉴定和含量检测。用于大鼠整体实验的AGE改用大鼠血清（rat serum albumin, RSA）与糖孵育，其余条件相同，制成AGE-RSA。B. 正常内皮细胞ERM的表达：ERM有三种，分别是Ezrin、

38、Radixin和Moesin。目前有关内皮细胞ERM的报道较少。我们拟采用的培养人微血管内皮细胞（HMVEC），用RT-PCR和Western blot技术分别从mRNA水平及蛋白水平明确正常状态下人微血管内皮细胞ERM的种类和表达水平。C. AGE对ERM磷酸化的影响：蛋白激酶磷酸化是蛋白质功能活动的重要特征。用ERM特异的磷酸化抗体（已商业化）和Western blot技术可以检测内皮细胞受到AGE刺激后ERM的磷酸化变化情况，包括用不同浓度的AGE（12.5、25、50、100和200 mg/ml）刺激内皮细胞ERM的磷酸化水平的变化（量效关系）和同一浓度AGE刺激不同时间（5、10、1

39、5、20、30、45、60、120 min）ERM磷酸化的变化趋势（时间曲线），查明AGE刺激内皮细胞后ERM磷酸化的变化规律及达到高峰的时间，并用免疫组化方法查明其细胞定位的变化。D. ERM磷酸化位点的鉴定 由于目前对ERM磷酸化位点的多少尚不完全清楚，查明AGE能诱导ERM磷酸化后，需要进一步鉴定ERM磷酸化位点。鉴定ERM磷酸化位点的方法有三种：通过针对某一磷酸化位点的特异性抗体（已商业化的抗体），结合Western blot技术或者免疫荧光技术识别目标蛋白，证实已往的结果。构建ERM磷酸化位点突变的质粒，转染细胞并检测其对细胞功能的影响。用质谱技术鉴定蛋白质磷酸化位点是未来的主要技术

40、手段之一。这三种方法可以相互补充和验证。（2）鉴定介导ERM磷酸化的上游信号通路现有的研究提示ERM的磷酸化可能受ROCK及MAPK信号通路的调控，但是AGE是否也通过激活ROCK及MAPK (ERK、p38)信号通路实现对ERM功能的影响还不清楚。我们拟通过以下实验研究AGE激活细胞介导ERM磷酸化的上游信号通路。A. AGE诱导的ROCK及MAPK（p38和ERK）动力学改变：观察AGE刺激内皮细胞后ROCK、ERK、p38 MAPK磷酸化水平的时间和量效曲线，并探讨这种变化规律与AGE诱导的ERM磷酸化变化之间的相关性。B. 用特异性抑制剂改变信号通路的活动，探讨信号通路活动与ERM磷酸

41、化之间的关系：选用ROCK抑制剂Y-27632、ERK通路抑制剂PD98059以及p38抑制剂SB203580预处理内皮细胞，再给予AGE，观察ERM磷酸化水平变化，阐明AGE是否通过激活ROCK、MAPK信号通路导致ERM的磷酸化。C. RNAi干扰信号通路的关键成分，阐明信号通路活动与ERM磷酸化之间的关系：特异性蛋白激酶抑制剂可能因特异性选择作用不够而带来假象，为此，我们拟采用RNAi 技术（具体方法见我室前期报道（龚小卫，姜勇等。解放军医学杂志2004；29（10：882-884）降低或减少ROCK和MAPK的细胞内蛋白含量，并研究相关信号通路活动阻抑后对AGE激活ER砀鄀匀瘀彁响。D

42、. 鉴定上ERL匐甏瘀丐伀甀瘀蘀瘀（嬠一PK是否通过直接与ERM相互作用导致ERM发生磷酸化目前尚有争议。我们拟采用酵母双杂交和免疫共沉淀（Co-IP）技术明确二者之间的关系，如果不是直接作用尚需通过噬菌体展示筛选或串联亲和纯化（TAP）技术筛选与ERM发生作用的蛋白，为进一步阐明ERM的信号通路提供切入点。（3）ERM磷酸化对内皮细胞屏障功能的影响为进一步探讨AGE刺激引起的ERM变化与内皮细胞屏障功能之间的相关性，我们拟从已建立的细胞模型开展相关的工作。A. 建立研究内皮细胞通透性的细胞模型：将内皮细胞培养在双层通透的培养皿（transwell）上，用荧光标记物漏出法测定内皮细胞的通透性

43、Guo等，APMIS 114 (12), 874-883.。B. 干扰ERM的功能，探讨AGEERM内皮屏障功能之间的关系：ERM磷酸化位点突变重组体转染细胞后会直接影响细胞ERM的磷酸化及功能活动。据此，我们拟构建ERM磷酸化位点突变的重组腺病毒感染细胞，然后观察AGE刺激引起的内皮细胞骨架蛋白F-actin及通透性的变化，阐明ERM在AGE介导的内皮屏障功能中的作用。C. 利用RNAi技术降低或减少ERM的表达，探讨AGEERM内皮屏障功能之间的关系：利用RNAi技术实现对ERM基因的沉默，减少细胞内ERM蛋白表达水平，再观察ERM蛋白表达水平降低后，AGE介导的内皮细胞骨架蛋白F-act

44、in以及通透性的改变。（4）在AGE作用的动物模型上验证细胞学的实验在细胞学实验已证明AGE介导ERM磷酸化及其信号通路的基础上，需要在动物模型上验证其结果，为临床相关疾病的防治提供更符合临床的依据。A. AGE动物模型的制备：采用静脉内注射AGE的方法制备AGE的动物模型（参照Zhou et al. Am. J. Patho. 2004; 165 (6):2033-2043）。按照每日一次、100 mg/kg通过大鼠尾静脉注射给予AGE-RSA，连续注射6周。对照组注射等量血清。治疗组在进行实验检测前24小时，用MAPK通路或ROCK通路（根据细胞学的研究结果）激酶无活性突变体重组腺病毒或者

45、ERM无功能突变体腺病毒感染目标动物。B. 分离微静脉，建立研究活体微血管通透性模型：急性分离肠系膜微静脉，口径为4060 mm，长度为0.81.2 mm，无分支。采用计算机图像分析和荧光强度测定技术，检测荧光标记白蛋白在微血管的通透系数Pa。Pa=(1/If) (dIf/dt)o (r/2)，其中If代表了初始荧光标记白蛋白的浓度，(dIf/dt)o 则是荧光蛋白渗出微血管管壁的速度，r是微血管的半径。Pa值愈大，表示通透性愈高（参照Huang Q et al. Shock,2003,20(4): 363-8）。C. 抑制ROCK或MAPK通路对微血管通透性和内皮细胞骨架的影响：在整体动物水平，利用图像分析和荧光标记技术，观察抑制ROCK或MAPK通路后活体肠系膜微静脉的通透性改变，用免疫组化观察组织切片和微血管内皮细胞的形态与结构改变；用免疫荧光和免疫组化技术观察细胞骨架蛋白F-actin的结构变化及ERM磷酸化水平变化，进一步从整体水平验证细胞学水平的实验结果，探讨上游信号通路与ERM之间的相关性。D. 抑制ERM功能对微血管通透性和内皮细胞骨架的影响：观察感染ERM无功能突变体腺病毒感染动物活体肠系膜微静脉的通透性改变，以及细胞骨架蛋白F-actin的结构变化，从整体水