蛋白质（酶）、核酸的 分离纯化.ppt

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1、生命科学基础实验教学示范中心,生物化学技术原理部分,第一章 蛋白质（酶）、核酸的分离纯化,第三章 层析技术,第二章 离心技术,第四章 电泳技术,第一章 蛋白质（酶）、核酸的分离纯化,第一节 引言 一、分离纯化的意义二、分离纯化的要求三、分离纯化的一般程序,第二节 蛋白质（酶）、核酸分离纯化的前处理 一、材料的选择与预处理 二、细胞的破碎 三、细胞器的分离 四、提取,第三节 分离纯化 一、 粗提纯 二、 精提纯 三、 纯度鉴定,第四节生物大分子的浓缩、干燥及保存,第一节 引言,蛋白质（酶）、核酸存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子；蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、

2、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能；核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各种蛋白质的合成。,生物大分子的分离纯化的方法很多，主要是根据分子之间特异性的差异，如分子大小 、溶解度、电荷等建立起来的。,一、分离纯化的意义,从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义；工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂；（如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等）医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病；基因工程的需要。,二、分离纯化的要求,1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究其一级结构和空间结构的

3、蛋白、一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失，而且提纯步骤越多，损失越大。,三、分离纯化的一般程序,生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段： 材料的选择和预处理； 破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）； 分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离。其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。,第二节 蛋白质（酶）、核酸 分离纯化的前处理,一、材料的选择与预处理选择材料

4、主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理，若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。,二、细胞的破碎,分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失其生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌

5、到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。,组织细胞的破碎方法很多，根据不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎；植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的；细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。,三、细胞器的分离,细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞

6、还有叶绿体。如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。,四、提取,组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是提取。提取实际

7、上就是将制备物从复杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中（通常是水、缓冲液、稀盐溶液或有机溶剂）。,1、蛋白质（酶）的提取,大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）或0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。,2、核酸的提取,DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存

8、在。DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/L NaCl溶液。RNA的提取：利用RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/LNaCl溶液，先提取得到RNP。提取得到DNP或RNP后，再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。,蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。去污剂法是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而

9、变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异丙醇将核酸沉淀离心收集即可。,蛋白质的去除,第三节 分离纯化,从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进行。,一、粗提纯1.蛋白质的粗提纯,主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开。这些方法的特点是简便，处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。,（1）盐析,向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl，使蛋白质脱去

10、水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。,不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质中盐的浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：,血清,球蛋白,清蛋白,(NH4)2SO4,50%饱和度,饱和,析出,析出,分段盐析,（2）等电点沉淀,蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时

11、，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。,（3）有机溶剂法,与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。,室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性

12、问题。不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。,2.核酸的粗提纯,从细胞中提取得到的核酸，常混杂有蛋白质及各种大小的核酸同类物等杂质，可采用适当方法进行粗提纯。粗提纯中，进一步将蛋白质除去,可用去污剂或有机溶剂多次反复提取。从RNA除去混杂的DNA，可用DNAase将DNA降解掉。从DNA中除去混杂的RNA，可用RNAase将RNA降解掉。,二、精提纯1.蛋白质精提纯,一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法。常用的柱层析方法有凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲

13、和层析。常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。,核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱层析等方法。超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心。电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。 前者凝胶孔径小，适合分离1000个核苷酸以下的核酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析。,2.核酸精提纯,三、 纯度鉴定,生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超

14、速离心沉降分析法等。选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定。,核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。,第四节生物大分子的浓缩、干燥及保存一、浓缩1.吸收法2.超滤法二、干燥1.真空干燥2.冷冻真空干燥三、样品的保存1.干态保存2.液态保存,离心技术概论 一般制备离心 超离心技术,第二章 离心技术,台式高、超速离心机0.6-10万rpm,离心机,制备性,分析性,分析性超速离心机,普通离心机,冰冻离心机,台式（或地面式）普通

15、离心机,大容量冰冻离心机小于0.6万rpm,高速冰冻离心机0.6-2.5万,超速冰冻离心机2.5-8万或更高,(分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特征和结构等),概述,一般制备离心,一般制备离心是指在分离、浓缩、提纯样品中，不必制备密度梯度的一次完成的离心操作，实验室用低、高速离心机可应用于此项技术。 台式或地面式普通离心机,高速冰冻离心机,科研人员将采集的脐带血放置到低温超速离心机内进行技术处理,超速冰冻离心机,应用范围： 病毒及亚细胞组份分离 蛋白梯度分离 脂蛋白分离 RNA梯度沉淀 质粒DNA提纯,制备性超速离心主要利用离心机转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快颗粒的沉降速度，

16、把样品中不同沉降系数或浮力密度差的物质分开。沉降系数指单位(cm)离心场中颗粒沉降的速度，用s表示，其单位是110-13秒，简称S，即1S110-13秒。沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。制备超离心的关键是如何根据颗粒和介质的性质以及转子的某些参数来确定转速和离心时间。颗粒沉降的时间和速度取决于：离心力、颗粒的大小形状和密度、沉降介质的密度和粘度。,超离心技术,一、原理和计算,二、转子离心管及选择,三、离心技术类型,四、梯度回收,一、原理和计算（一）离心力和相对离心力当离心机转头以一定的角速度w（弧度/秒）旋转，颗粒的旋转半径为r（厘米）时，任何颗粒均受一个向外的离心力

17、，此离心力为： F= m2r 式中，F通常以地心引力表示，称为相对离心力（RCF），相对离心力指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度g（980厘米/秒2），这时RCF可表示如下： RCF = 2r/980 实际上，这一关系式常用每分钟转数n（或rpm），以更通用表达式来表示，由于=2n/60 于是： RCF=42（rpm）2r/3600*980 简化得： RCF=1.11910-5 （rpm）2r 一般低转速时常用rpm来表示，高转速离心则以g表示。,半径,相对离心力,转速,方法：三点一线，左对左，右对右,为了便于进行转速和相对离心力之间的换算，人们在式的基础

18、上制作了三者关系的列线计算图,RCF=1.11910-5 （rpm）2r,二、转子离心管及选择（一）离心管常见的玻璃离心管质硬且脆，不能承受超离心的压力。用于超离心机转子中的离心管分为塑料管及不锈钢管两类。离心时样品一般应装满离心管，否则将可能因有气泡而使管的外部受压不均，造成离心管破裂，使转子不平衡产生事故。 （二）离心管帽超离心机所用离心管一般都附有管帽，离心时离心管需戴上管帽。,（三）转子及选择 主要有角转子、水平转子、垂直转子、区带转子等几种类型。1、角转子指离心管腔与转轴成一定倾角的转子，角度越大，沉降越结实，分离效果越好，相反，角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。颗

19、粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积，称为“壁效应”。最适合差速离心，强度大、方便，但加速或减速时，对样品有搅动。,2、水平转子转子活动管套内的离心管，旋转时随着转子的转动，从垂直悬吊上升到水平位置（约200800rpm）时。颗粒在水平转子中的沉降是沿管子方向的，梯度离心中颗粒沉降区带横过离心管，离心后区带不必重新定位，但只有处于样品区带中心的颗粒才直接向管底沉降，其它颗粒则撞向壁的两侧，产生“壁效应”，但受振动和变速搅乱后对流现象小得多。,3、垂直转子角式转子的特殊形式，主要用于等密度梯度离心，这种转子颗粒移动距离短，比水平式和角式转

20、子节约大量时间，但速度剧变容易产生对流扰乱。4、区带转子,三、离心技术类型 常用离心技术一般包括差速离心法，速度区带法和等密度梯度沉降法。（一）差速离心法原理：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的“沉淀”及含小和轻颗粒“上清液”，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好分开。这时所得沉淀是不纯的，需经再悬浮和再离心（23次），才能得到较纯颗粒。用

21、于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。,已破碎的细胞,沉淀（细胞核）,上清液,沉淀（细胞膜碎片、线粒体、溶酶体）,上清液,沉淀（核糖核蛋白体）,上清液（可溶性组分）,500g，10,10 000g，10,100 000g，3h,（二）速度区带法速度区带主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。,（三）等密度梯度沉降法原理：等密度

22、梯度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。等密度梯度离心一般常用CsCl、RuCl、蔗糖、甘油等做介质。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。,四、梯度回收1、穿刺法 这是一种简易的手工操作法，采用针穿刺离心管底部，使梯度靠重力自由滴出，然后依次作分布收集，此法适用于薄壁塑料管，流出液部分收集于

23、小试管中，经分析决定取舍或合并。 此法对梯度扰动小，但离心管不能再用，不适合回收管底有沉淀的梯度，也不使用于不锈钢或厚壁塑料管。,2、取代法 回收梯度中最常使用的一种方法，分为向上及向下取代两种。取代法优点是不破坏离心管，能用于较粘梯度，可借光学（放射性）系统进行流出液跟踪，简化分析化验工作。缺点是开始取代操作时易引起扰乱，操作需特别小心，梯度粘度太大时也不合适。,浓取代液,稀 浓,通入空气、轻液体,收集 浓 稀,收集,3、虹吸法 用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯度，它也不损伤离心管，尤其适用于不锈钢管中物质的分级分离，但虹吸时易引起分离区带扰乱，最好使用专门的装置。 除取代法和虹吸

24、法外，有时从管上部直接仔细地用注射器或吸管定量移出梯度液，效果也较好。4、切割法 适用于极粘梯度，就是用离心管切割器将冻结的塑料管切成薄片，从而将梯度分部收集，此法仅适用于赛璐璐或硝酸纤维素管。,梯度的分析分析梯度中的回收物质常用紫外吸收法、酶活力测定法、放射标记法。蛋白质、核酸或某些含蛋白质、核酸占优势的细胞器、病毒可用紫外吸收法测定。细胞器一般可测定标志酶活性，通常每一组分至少选二种标志酶，如一时找不到更好的测定目的物，也可测光吸收来推断分布的组分，对于同位素标记物，最好是测定其放射活性。此外，某些情况下也可用免疫法，电泳法测定物质在梯度中的分布，亚细胞成分可用电镜或光学显微镜观察分析各分

25、部的组分，最后分析结果。,第三章 层析技术,引言,层析法的基本原理,层析法的分类,第一节 吸附层析技术,第二节 分配层析技术,第三节 凝胶过滤层析技术,第四节 离子交换层析法,第五节 亲和层析法,第六节 高压液相层析（HPLC）,引言,层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。1944年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝

26、胶层析等。,层析法的基本原理,层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。,层析法的分类,按两相所处的状态分类： 流动相有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分为： 液相层析 液-固层析 液-液层析 气相层析 气-固层析 气-液层析,按层析过程的机理分类：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异

27、，达到分离鉴定的目的。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。,按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。,第一节 吸附层析技术,一、基本原理吸附层析法（液-固层析法，LSC） 原理：利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进

28、行分离。 特点：适合分离不同种类的化合物(醇类和芳香烃）。,二、吸附剂吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，与待分离物质的极性官能团作用。常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等羟基羟基磷灰石（HA）Ca10(PO4)6.(OH)2,可用于分离蛋白质与核酸。其表面有Ca2+和PO43-两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白质可与PO43-结合。HA柱层析最重要的用途之一是分离单链DNA和双链DNA，因为它对双链DNA的亲和力大于单链DNA。,第二节 分配层析技术,分配层析法（液-液层析法，LLC）原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同

29、而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。,分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数。 K=c1/c2分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。,特点：液-液层析法适合于分离同系物或同分异构体,层析柱分离物质的示意图：,固定相为固体颗粒，装在层析柱内，高5cm，固定相周围充满液体流动相，每厘米柱中液相体积为1cm3。若在柱顶加入1cm3溶剂,其中含32mg样品，同时应有相同体积的溶剂从柱底流出，此时样品处于柱中A位置。若样品的分配

30、系数是1，则它在固相与液相间等量分配。若再有1cm3的溶剂加到柱上，A部分中的溶剂带着16mg的物质向下移动到B，A和B中的物质都将发生再分配，,第三节 凝胶过滤层析技术,一、基本原理概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。,二、凝胶的种类和性质 1.交联葡聚糖凝胶（Sephadex)

31、1) Sephadex G G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。 G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。 2） Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质。2.琼脂糖凝胶（Sepharose ;pharmacia;Bio-Gel) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。 3.聚丙烯酰胺凝胶 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。 商品名为生物胶-P（Bio-Gel P)。 4.聚苯乙烯凝胶（Styrogel) 大网孔结构。,三、 凝胶过滤在

32、试验室中的应用,1）生物大分子物质的分离纯化2）分子量的测定3）分级分离4）溶液浓缩5）平衡常数的测定6）细胞及颗粒的分离,蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关， LogM=（k1-k2）Ve（Ve为洗脱体积）,先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。,原理:根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。将离子交换树脂装入层析柱。离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团。含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出H+，含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解离出

33、OH-。,第四节 离子交换层析法,离子交换层析的基本原理,+,+,+,+,+,若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。,+,+,原理：利用生物大分子间特异的亲和能力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，通过洗脱杂质即可除

34、去。被结合的物质再用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。,第五节 亲和层析法,+,C,C,配基,蛋白质,1.配基固相化,2.亲和吸附,固体载体,3.解吸附,C,第六节 高压液相层析（HPLC）,特点：使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高。 溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。,第四章 电 泳 技 术,引言,第一节 电泳的基本原理,第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳,第三节 琼脂糖凝胶电泳,第四节 免疫电泳,一、概述,二、聚丙烯酰胺凝胶的制备,三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,四、不连续聚丙烯酰

35、胺凝胶电泳,引言,电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。,按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离

36、成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。,电泳的分类,引言,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,引言,淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可

37、调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质,引言,第一节 电泳的基本原理,电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。,.,电泳的基本原理,在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间

38、内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。,+,-,若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： F引=EQ （1）在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻=6rV 当F引=F阻时 EQ= 6rV V= 由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度()成反比。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状也有关。,EQ,6r,（2）,（3）,（4）,电泳的基本原理,由（4）

39、可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，常用迁移率m（或称泳动度，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况。 m = V/E = Q/6r （5） 由上式可以看出，迁移率仅与球形粒子所带电荷数量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。,EQ,6r,（4）,V=,电泳的基本原理,由于蛋白质、氨基酸等的电离度随溶液pH变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移率U为迁移率m和当时条件下电离度的乘积。 U = m （6） 将（6）式代入（5）式得： U = （7）,.,Q,.,6r,由（7）式可以看出，凡能

40、影响溶液粘度的因素如温度，影响分子带电量Q及解离度的因素如pH的改变，都会对有效迁移率，产生影响。,电泳的基本原理,以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的情况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响因素外，有效迁移率还受电渗（是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动）的影响。电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。 最后要考虑选用离子强度适宜的溶液。离子强度影响粒子的电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，泳动速度越慢；反之越快。 总之，电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、温度、pH、电渗及离子强度多种因素的影响。,电泳的基本原理,第二节

41、聚丙烯酰胺凝胶电泳,一、概述聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electropho-resis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acry-lamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。,CH2=CH,C=O,NH2,CH2=CH,C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH,-CH2-CH-

42、CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH NH2,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,二、聚丙烯酰胺凝胶的制备,聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1.化学聚合 化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵，此外还需要加速剂TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可使过硫酸铵形成氧自由基，这些自由基的产生可引发丙烯酰胺单体形成自由基，从而与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定孔径的聚丙烯酰胺。,., 光聚合通常用核黄素为催化剂，核

43、黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。或在胶液表面，往往覆盖一层水，隔绝空气，可加速聚合。 （2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。 （3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。,2.光聚合, 凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交联度（C）的计算公式分别为：T= C= 凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影

44、响。凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断；浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为5%时，凝胶具有最小孔径，超过5%或低于5%时凝胶孔径都要增大。,三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,Acr（g）+Bis（g）,V（ml）,X100%,Acr（g）+Bis（g）,Bis（g）,X100%, 在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。 用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%的大孔凝胶，此时

45、凝胶太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖，或在3%凝胶中加入20%蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。,四、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,系统的不连续性表现在以下几个方面： 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。 在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应，分子筛效应和浓缩效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。,8.3,8.3,8.9,6.7,+,-,水平板式电泳槽,垂直板式电泳槽,电泳条带,第三节 琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。,