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1、精品名师归纳总结高级动物生化试题问答题：1. 简述非编码 RNAnon-coding RNA 的种类、结构特点及其主要功能。非编码 RNA的种类结构和功能1 tRNA转运 RNAtransferRNA，tRNA结构特点之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发觉的。修饰成分在 tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清晰。5 末端具有 G大部分或 C。3末端都以 ACC的次序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。 有一个反密码子环， 在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子 anticodon . 反密码子可以与 mRNA链上互补的密码子配对。有一 个胸腺嘧啶环。 tRNA 具

2、有三叶草型二级结构以及“ L”型三级结构， tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调剂。tRNA 负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。tRNA 为每个密码子翻译成氨基酸供应了结合体，同时仍精确的将所需氨基酸运输到核糖体上。 鉴于 tRNA在蛋白质合成中的关键作用， 又把 tRNA称作其次遗传密码。 tRNA 仍具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参加下， 携带氨基酸转移至专一的受体分子， 以合成细胞膜或细胞壁组分。 作为反转录酶引物参加DNA合成。 作为某些酶的抑制剂等。 有的氨酰-tRNA 仍能调剂氨基酸的生物合成。2

3、 rRNA核糖体 RNAribosomalRNA,rRNA可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结他们是核糖体的组分，并直接参加核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 供应了一个核糖体内部的“脚手架” ，蛋白质可附着在上面。这种说明很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的讨论说 明， rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、挑选tRNA 以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是, 依据mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA并催化肽键形成而实现。 可以说核糖体是一个大的核酶 ribozyme 。而核

4、糖体的催化功能主要是由 rRNA来完成的 , 蛋白质并没有直接参加。3 tmRNA tmRNA主要包括 12 个螺旋结构和 4 个“假结”结构，同时仍包括一个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中 H1 由 5端和 3端两个末端形成，与 tRNA的氨基酸受体臂相像。 H1 和 H2的 5部分之间有一个由 10-13nt 形成的环，类似 tRNA 中的二氢尿嘧啶环，称为“ D”环。 H3 和 H4， H6 和H7， H8和 H9， H10和 H11之间分别形成 Pk1，pK2， pK3，pK4。H4和 H5 之间就由一段包含编码标记肽 ORF的单链 RNA连接。H12由 5 个碱基对和 7n

5、t 形成的环组成， 类似 tRNA中的 T C臂和 TC环，称为“ T”环。tmRNA 结构依据功能进行划分可分为 tRNA类似域 TLD和 mRNA类似域 MLD， TLD主要包括 H1,H2,H12, “ D”环和“ T”环， MDL就包括 ORF和 H5，这两部分分别具有类似 tRNA和 mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌 及细胞器如叶绿体，线粒体中的稳固小分子RNA。它具有 mRNA分子和 tRNA 分子的双重功能，它在一种特别的翻译模式反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量掌握”的重要分

6、子之一。识别可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结题的核糖体的崩解。4 核仁小 RNAsnoRNA 绝大多数 snoRNA可归为两类 boxC/DsnoRNA和boxH/ACA snoRNA，均具有保守的特点二级结构，boxC/DsnoRNA类能形成“发夹- 铰链- 发夹- 尾部”状二级结构。 boxC/DsnoRNA其分子两端的boxC,boxD 以及末端配对序列能形成保守的“茎 - 内环- 茎”状二级结构， 称为“ K-turn ”结构。大多数 boxC/DsnoRNA和 boxH/ACAsnoRNA分别具有指导 rRNA，snRNA或 tRNA前体中特定核苷 2-O- 核糖甲基

7、化修饰与假尿嘧啶化修饰的功能。 少部分 snoRNA参加 rRNA前体的加工剪切， 与 rRNA 的正确折叠和组装相关。5 微 RNAmicroRNAs。miRNA，小分子 RNA它是一类长度为 2125nt的单链 RNA分子片段，有一个很好玩的共同特点，就是它的序列存在于茎环结构中的茎上。这种茎环结构通常是由70多个核苷酸组成的不完全的发夹结构，上面有一些凸起和环状结构。茎部形成双链RNA ，但不是严格互补，可存在错配和 GU摇摆配对。据其作用模式的不同可以分为三类：第一类如 lin4 ，与 mRNA不完全互补，当 miRNA与靶 mRNA不完全配对结合时，主 要 影 响 其 翻 译 过 程

8、 而 对 mRNA的 稳 定 性 无 影 响 。 第 二 类 如miR39 和 miR171，与其靶 mRNA完全互补，当其与 mRNA完全配对结合后，分裂切割靶 mRN。A第三类作用模式如 let7 ，当其与靶 RNA完全互补配对时， 直接靶向切割 mRN，A 而不完全互补配对时起调剂基因表达的作用。6 小干扰 RNASmall interferingRNA。siRNAsiRNA 是长度 20 到 25个核苷酸的双股 RNA，在生物学上有很多不同的用途。 目前已知 siRNA主要参加 RNA干扰 RNAi现象，以带有专一性的方式调剂基因的表达。此外，可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归

9、纳总结变。其生理意义在于，生物的抗御机制，调控细胞分化与胚胎发育，维护基因组的稳固以及 RNA 水平上的调控机制。7 snRNA 小核 RNA：它是真核生物转录后加工过程中RNA 剪接体spilceosome 的主要成分，参加 mRNA前体的加工过程。另外，仍有端体酶 RNAtelomeraseRNA， 它 与染 色体 末端的复制 有关 。 以 及反 义RNAantisenseRNA，它参加基因表达的调控。仍参加RNA剪接和 RNA修饰。8 eRNA eRNA从内含子或 DNA非编码区转录的 RNA分子，精细调控基因的转录和翻译效率。9 SNP RNA信号识别颗粒 RNA，细胞质中与含信号肽

10、mRNA识别， 打算分泌的RNA功能分子， 它是一种核糖核酸蛋白复合体。 能够识别并结合刚从游离核糖体上合成出来的信号肽，临时中止新生肽的合成，又能与其在内质网上 的受体 即停靠蛋白质 结合而将新生肽转移入内质网腔，防止蛋白水解酶对其损害另外，仍有端体酶 RNAtelomeraseRNA，它与染色体末端的复制有关。 以及反义 RNAantisenseRNA，它参加基因表达的调控。仍参加RNA剪接和 RNA修饰。10 gRNA 又称引导 RNA 真核生物中参加 RNA编辑的具有与 mRNA互补序列的 RNA , 具有 3 寡聚 U的尾巴, 中间有一段与被编辑 mRNA精确互补的序列 ,5端是一个

11、锚定序列 , 它同非编辑的 mRNA序列互补。在编辑时 , 形成一个编辑体editosome, 以 gRNAs内部的序列作为模板进行转录物的校正 , 同时产可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结生编辑的 mRN。AgRNA3端的 oligoU尾可作为被添加的 U的供体。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结Piwi 亚家族蛋白结合形成 piRNA复合物piRC来调控基因缄默途径。 对 Piwi 亚家族蛋白的遗传分析以及 piRNA 积存的时间特性讨论发觉， piRC 在配子发生过程中起着特别重要的作用。仍能维护生殖系和干细胞功能和调剂翻译和 mRNA的稳固性。12atRNA

12、 反义 RNA是指与 mRNA互补的 RNA分子,由于核糖体不能翻译双链的 RNA，所以反义 RNA与 mRNA特异性的互补结合 ,即抑制了该 mRNA的翻译。通过反义 RNA掌握 mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式， 反义 RNA也参加了和 P22 噬菌体的溶菌 / 溶源状态的掌握。2. 请以发育生物学 developmental biology、表观遗传学 epigenetics、体细胞重编程技术 somatic cell reprogramming、体细胞克隆 somatic cell cloning、细胞凋亡 apoptosis或诱导干细胞 iPS 、干细胞 stem ce

13、ll为关键词，阅读至少 一篇 2021 年以后的外文文献 ，阐述相关方面讨论进展，或有关技术在动物生殖细胞卵母细胞、精子发生、卵泡发育、早期胚胎发育过程中文文献 。中的应用讨论 不少于 2000 字，并附上所阅读文献全文 。留意不能抄袭有关可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结动物生化试验技术试题1、 试述分子杂交技术核酸和蛋白质的种类、适用范畴及特点。核酸分子杂交技术是利用 DNA变性与复性的原理，在某种理化因素作用下DNA双链分子解链变性后，在 DNA复性重新形成双螺旋结构时，把不同的 DNA单链分子或者 DNA与RNA的混合物放在同一溶液中，只要在 DNA或RNA单链分子之间存

14、在肯定的碱基互补配对关系，就可以在 DNA之间或 DNA与RNA之间形成杂化的双链。蛋白质分子杂交是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。面重点介绍三种常用的分子杂交技术。（1） ） Southern 杂交-DNA和DNA分子之间的杂交southern 杂交主要用来讨论 DNA分子中某一基因位置、某一专一序列在待检样品中存在与否及两种核酸分子之间的相像性。1、用于对基因组中特定基因的定位及检测。 2、用于从基因文库中找到所需要的基因。（2） ） Northern 杂交 DNA和RNA分子之间的杂交。目前主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异性mRN的A 表达水平或比较不同组织或细胞中同一基因的

15、表达情形，如在基囚工程中是检测目的基因是否转录 出mRN的A 方法。假如 RNA分子在大小和含量上与正常情形不同，可以考虑是否有调控区的突变或剪接部分的突变。（3） ） western 杂交蛋白质分子 抗原一抗体 之间的杂交。可用于检测样品中特异蛋白质是否存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用讨论等。如检测目的基因在受细胞中有没有翻译出相应的蛋白质，检测病人血液中是否有某种抗体从而检测是否感染过某种抗原，单可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结2. 简述核酸和蛋白质浓度分析方法。1紫外分光光度法紫外分光光度法基于 DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸取，DN

16、A/RNA 在 260nm处有最大的吸取峰，蛋白质在280nm处有最大的吸取峰，盐和小分子 就集中在 230nm处。因此，可以用 260nm波进步行分光测定核酸浓度， OD值为1 相当于大约 50 g/ml 双链 DNA，单链 DNA浓度约为 33g/ml，RNA约为 40 g/ml ，寡核苷酸约为 35g/ml 。如用 1cm光径，用 H2O稀释 DNA/RNA样品 n倍并以 H2O为空白对比，依据此时读出的OD260值即可运算出样品稀释前的浓 度：DNAmg/ml=50 OD260读数稀释倍数 /1000RNAmg/ml=40OD260读数稀释倍数 /1000 。A280nm是蛋白和酚类物

17、质最高吸取峰的吸取波长，比值可进行核酸样品纯度评 估：纯 DNA的 A260/A280 比值为 1.8 ，纯 RNA为 2.0 。假设比值低，表示受到蛋白芳香族或分类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5 相当于 50%蛋白质/DNA溶液。A230nm是碳水化合物最高吸取峰的吸取波长，比值可进行核酸样品纯度评估： 纯 DNA和 RNA的 A260/A230 比值为 2.5 。假设比值小于 2.0 标明样品被碳水化合物糖类、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A320nm或 A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应当接近0.0 。假设不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。2定糖定磷法定糖定磷法是

18、通过测定核酸中戊糖和无机磷含量实现对核酸含量的测定。该法可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结分光光度计测定光吸取值即可定量核酸。但此法精确度差、灵敏度低、干扰物多、操作繁琐，在现今的讨论中已较少采纳。比方二苯胺法是利用脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成羟基酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸取，在每毫升含DNA20-400微克范畴内，光密度与 DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除 DNA外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样的反应。少采纳。比方二苯胺法是利用脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成羟基酮基戊醛与二苯胺试剂

19、一起加热产生蓝色化合物，在 595nm 处有最大的吸取，在每毫升含 DNA20-400微克范畴内，光密度与 DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除 DNA外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样的反应。 1、DNA标准曲线的制作取 8 支试管，编号，以肯定的梯度依次加入不同浓度的DNA溶液和二苯胺试剂试剂。加毕，摇匀，于 60恒温水浴中保温 1 小时，或于沸水中煮沸 15 分钟， 冷却测 0.D595nm值。以光密度为纵坐标， DNA含量 ug/ml 为横坐标，绘制标准曲线。2、样品的测定取 2 支试管，各加 0.2-0.5毫升的待测液内含 DNA应在标准曲线可测范畴之内加

20、蒸馏水稀释至2 毫升，再加 4 毫升二苯胺试剂，摇匀， 其操作步骤与标准曲线的制作相同。依据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度 DNA的含量，按下式运算出样品中 DNA的百分含量。DNA含量/ 毫升待测液 =标准曲线查得值稀释倍数 留意事项。1、二茉胺法测定 DNA含量灵敏度不高，待测样品中 DNA含量低于 50mg/L 即难以测定。乙醛可增加二苯胺法测定 DNA的发色量，又可削减脱氧木糖和阿拉伯可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结2、样品中含有少量 RNA并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰DNA定理。3酶

21、催化法基于酶催化的核酸定值方法是一种相对核酸定量法。其原理是染料能同时与酶和核酸结合，通过检测酶的催化活性即可实现对核酸的定量。此法的 优点在于不需要通过核酸扩增，操作便利，使用的仪器简洁。但该法试验中， 酶的催化活性受多方面影响， 难以到达最正确状态， 会使定量结果显现偏差。3荧光染料法荧光染料法是通过检测荧光试剂与DNA结合后的荧光强度变化而实现对核酸的 定量。某些荧光探针试剂本身荧光强度不大， 但与 DNA 结合后荧光强度大大增强，如：溴化乙锭在水溶液中的荧光量子产率很低，但它与DNA结合后，产生很强的荧光，激发波长显著红移。又如Hoechst33258 是一种双苯并咪唑荧光染料，可高度

22、特异的与双链 DNA非嵌入性结合，结合后其荧光率由 0.01 增至 0.6 。荧光染料法适用于样品中 DNA或 RNA 含量较低或含有较多杂质的样品， 肯定灵敏度很高 . 如利用 Hoechst33258 可测定纳克级水平的DNA。 PicoGreen及SYBR Green的检测灵敏度较 EB和 Hoechst33258 更高， PicoGreen 可检测低至 0.25-0.5ng的 DNA样品。前已有很多商品化核酸定量荧光染料，如Invitrogen公司用于测定双链 DNA的PicoGreen 、用于测定单链 DNA的 OliGreen 及用于测定 RNA含量的 RiboGreen等。含这些

23、染料的核酸定量试剂盒被认为是目前对微量核酸定量较精确的方法。 与紫外分光光度法相比，荧光染料法的应用尚不广泛它存在以下缺陷：1某些荧光染料如 EB 等具有极强的毒性和致诱变性。 2荧光分析对环境因素极为敏锐，易受温度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干扰。3该可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结精确定量需依靠已知浓度的标准物质，而目前缺乏经过精确定值的标准物质， 且少数现今采纳标准物质 DNA的定量方法为紫外分光光度法，这就产生潜在的偏差并使测量结果无法溯源到国际单位制。在水溶液中的荧光量子产率很低，但它与DNA结合后，产生很强的荧光，激发波长显著红移。又如 Hoechst33258

24、是一种双苯并咪唑荧光染料，可高度特异的与双链 DNA非嵌入性结合，结合后其荧光率由0.01 增至 0.6 。荧光染料法适用于样品中 DNA或 RNA 含量较低或含有较多杂质的样品， 肯定灵敏度很高 . 如利用 Hoechst33258 可测定纳克级水平的 DNA。 PicoGreen 及SYBR Green的检测灵敏度较 EB和 Hoechst33258 更高， PicoGreen 可检测低至 0.25-0.5ng 的 DNA样品。目前已有很多商品化核酸定量荧光染料，如Invitrogen公司用于测定双链 DNA 的 PicoGreen、用于测定单链 DNA的 OliGreen 及用于测定 R

25、NA含量的 RiboGreen 等。含这些染料的核酸定量试剂盒被认为是目前对微量核酸定量较精确的方法。与紫外分光光度法相比，荧光染料法的应用尚不广泛它存在以下缺陷：1某些荧光染料如 EB等具有极强的毒性和致诱变性。 2荧光分析对环境因素极为敏锐，易受温度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干扰。3该法需制作标准曲线，操作较复杂。 4需专业的定量试剂盒，价格昂贵。 5精确定量需依靠已知浓度的标准物质，而目前缺乏经过精确定值的标准物质，且少数现今采纳标准物质 DNA的定量方法为紫外分光光度法，这就产生潜在的偏差并使测量结果无法溯源到国际单位制。4杂交定量法可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结

26、大技术及 Rnase爱护技术。Southern 杂交特异性强，但操作复杂，灵敏度低。与Southern 杂交类似的是用于检测 RNA的 Northern 杂交技术，可用于基因表达量的比较讨论。生物芯片是一种高通量的杂交定量技术。 该技术以核酸杂交为基础， 将短的寡核苷酸或 cDNA序列高密度的固定在固相支持物的外表，然后加入已标记的目的序列进行杂交， 之后检测荧光信号。由于荧光信号的强度与目标分子的数目成比例，从而实现 核酸定量检测。支链信号放大技术采纳了一种人工合成的、结构犹如树枝的DNA信号放大探针分支链 DNA，其优点是：1只需将释放的核酸变性，样品处理简洁。 2不经过指数增长的扩增过程

27、，防止了扩增产物污染及 PCR抑制因素的影响。3可高通量检测病原体。但该方法成本较高，且当放大倍数低时，敏锐性较差，检测范畴窄， 不适用于 RNA的低浓度检测。 RNase爱护技术由 Zinn 于 1983 年首次提出，此法的灵敏度高于 Northern 杂交，但成本比较高、放射性同位素有致癌作用，且所转录成的RNA易降解，增加了试验误差。蛋白质浓度分析方法一、蛋白浓度的直接测定 UV法这种方法是在 280nm波长，直接测试蛋白。挑选 Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是挑选相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。 蛋白质测定过程特别简洁，先测试空白液，然后直接测试蛋白质

28、。从而显得结果很不稳固。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯洁、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简洁。但是简洁受到平行物质的干扰，如 DNA的干扰。另外敏锐度低，要求蛋白的浓度较高。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结酪氨酸和色氨酸残基，使蛋白质在280nm 的紫外光区产生最大吸取，并且这一波长范畴内的吸取值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋 白质的含量。紫外吸取法可测定 0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。三双缩脲法 Biuret法双缩脲NH3C

29、ONHCONH是3两 个分子脲经 180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范畴为 110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、 Tris缓冲液和某些氨基酸等。四 BCA方法测定蛋白质含量BCA检测法是 Lowry 测定法的一种改良方法。与 Lowry 方法相比， BCA法的操作更简洁，试剂更加稳固，几乎没有干扰物质的影响

30、，灵敏度更高微量检测可到达 0.5 g/ml ，应用更加敏捷。蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将 Cu2+复原成 Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳固的化合物在562nm 处具有强吸取值，并且可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结量。五凯氏定氮法：凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量, 假设蛋白质的含氮量已知时，就可用此法测定样品中蛋白质的含量。当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮就转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反

31、应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨蒸馏到肯定量、肯定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸取氨后， 氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂颜色转变，然后用标准无机盐酸滴定，直至复原溶液中原先的氢离子浓度为止。依据所用标准盐酸的量可运算出待测物中的总氮量。蛋白质的含氮量为 16%，即 1 克蛋白质中的氮相当于 6.25 克蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25, 即得样品中蛋白质的含量。3. 预对某个基因的表达 RNA

32、和蛋白质水平进行 定性和定量分析 ，试述可采纳的技术路线和主要试验方法。答： 通过 mRNA表达水平的检测： Northern blot、real time PCR、原位杂交等。通过蛋白表达水平的检测： 1定量检测分析： western bloting2蛋白质功能分析：免疫荧光技术、酵母双杂交、ChIP、荧光共振能量转移等。可采纳的技术路线和主要试验方法有：（1） ）mRNA表达水平的检测Northern Blot:可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结是一种基于 RNA-DNA杂交原理建立的一种 RNA分析技术。将 RNA变性及电泳别离后，转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特

33、定 mRNA分子的含量及其大小。基本步骤：完整 mRNA的别离依据 RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对 RNA进行别离将 RNA转移到固相支持物尼龙膜上，在转移的过程中，要保持RNA 在凝胶中的相对分布将 RNA固定在支持物上 UV交联固相 RNA与探针分子DNA或 RNA杂交除去非特异性结合到固相支持物上的探针分子对特异性结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。real time PCR又称实时定量荧光 PCR，是指在 PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最终通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct 值对模板进行相对定量。基本步骤： 样品 RNA的抽提

34、 RNA质量检测， 一般利用紫外吸取法和变性琼脂糖凝胶电泳进行测定样品 cDNA的合成梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因 -actin实时定量 PCR制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板待测样品的待测基因实时定量 PCR实时定量 PCR使用引物列表 PCR产物进行电泳进行实时荧光定量 PCR。（2） ）蛋白表达水平的检测 Western blot以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/ 多肽分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法是利用此方法对细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。基本步骤：蛋白质样品的制备 SDS-PAGE进

35、行别离蛋白质转膜特异抗体可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结即第一抗体与膜上的蛋白质抗原印记杂交再经偶联了可检测标记信号的其次抗体即抗抗体，商品试剂盒中多采纳偶联辣根过氧化物酶的Ig 最终经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后猎取免疫印迹信息。酵母双杂交酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的熟悉。讨论发觉， 很多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域domain 组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在 N端有一个由 147 个氨基酸组成的 DNA结合域 DNAbindingdomain,BD ，C 端有一个由 113 个氨基酸组成的

36、转录激活域 transcriptionactivationdomain,AD 。GAL4分子的 DNA结合域可以和上游激活序列 upstreamactivatingsequence，UAS结合，而转录激活域就能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。试验流程酵母双杂交系统正是利用了 GAL4的功能特点， 通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:1、视已知蛋白的 cDNA序列为诱饵 bait，将其与 DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。2、将待挑选蛋白的 cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。4、酵母细胞中，已别离的 DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白假设能与待挑选的未知蛋白特异性的相互作用，就可激活报告基因的转录。反可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结之，就不能。利用 4 种报告基因的表达，便可捕获到新的蛋白质。可编辑资料 - - - 欢迎下载