2015-高级生物化学及实验技术试题答案解析(共16页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上高级动物生化试题问答题：1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。非编码RNA的种类结构和功能1 tRNA 转运RNA（transferRNA，tRNA）结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5末端具有G（大部分）或C。3末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草

2、型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。2 rRNA核糖体RNA（ribosomal

3、RNA,rRNA）核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶(ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRN

4、A来完成的,蛋白质并没有直接参与。3 tmRNAtmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5端和3端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5部分之间有一个由10-13nt形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt形成的环组成，类似tRNA中的TC臂和TC环，称为“T”环。tmRNA结构按照功能进行划分可分为tRNA类

5、似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问题的核糖体的崩解。4 核仁小RNA(snoRNA)绝大多数snoRNA可

6、归为两类boxC/DsnoRNA和boxH/ACAsnoRNA，均具有保守的特征二级结构，boxC/DsnoRNA类能形成“发夹-铰链-发夹-尾部”状二级结构。boxC/DsnoRNA其分子两端的boxC,boxD以及末端配对序列能形成保守的“茎-内环-茎”状二级结构，称为“K-turn”结构。大多数boxC/DsnoRNA和boxH/ACAsnoRNA分别具有指导rRNA，snRNA或tRNA前体中特定核苷2-O-核糖甲基化修饰与假尿嘧啶化修饰的功能；少部分snoRNA参与rRNA前体的加工剪切，与rRNA的正确折叠和组装相关。5 微RNA（microRNAs；miRNA，小分子RNA）它是

7、一类长度为2125nt的单链RNA分子片段，有一个很有趣的共同特点，就是它的序列存在于茎环结构中的茎上。这种茎环结构通常是由70多个核苷酸组成的不完全的发夹结构，上面有一些凸起和环状结构。茎部形成双链RNA，但不是严格互补，可存在错配和GU摆动配对。据其作用模式的不同可以分为三类：第一类如lin4，与mRNA不完全互补，当miRNA与靶mRNA不完全配对结合时，主要影响其翻译过程而对mRNA的稳定性无影响。第二类如miR39和miR171，与其靶mRNA完全互补，当其与mRNA完全配对结合后，分裂切割靶mRNA。第三类作用模式如let7，当其与靶RNA完全互补配对时，直接靶向切割mRNA，而不

8、完全互补配对时起调节基因表达的作用。6 小干扰RNA（SmallinterferingRNA；siRNA）siRNA是长度20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。其生理意义在于，生物的抗御机制，调控细胞分化与胚胎发育，维持基因组的稳定以及RNA水平上的调控机制。7 snRNA（小核RNA）： 它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。另外，还有端体

9、酶RNA(telomeraseRNA)，它与染色体末端的复制有关；以及反义RNA(antisenseRNA)，它参与基因表达的调控。还参与RNA剪接和RNA修饰。8 eRNAeRNA从内含子或DNA非编码区转录的RNA分子，精细调控基因的转录和翻译效率。9 SNPRNA信号识别颗粒RNA，细胞质中与含信号肽mRNA识别，决定分泌的RNA功能分子，它是一种核糖核酸蛋白复合体。能够识别并结合刚从游离核糖体上合成出来的信号肽，暂时中止新生肽的合成，又能与其在内质网上的受体(即停靠蛋白质)结合而将新生肽转移入内质网腔，防止蛋白水解酶对其损害另外，还有端体酶RNA(telomeraseRNA)，它与染色

10、体末端的复制有关；以及反义RNA(antisenseRNA)，它参与基因表达的调控。还参与RNA剪接和RNA修饰。10 gRNA又称引导RNA真核生物中参与RNA编辑的具有与mRNA互补序列的RNA,具有3寡聚U的尾巴,中间有一段与被编辑mRNA精确互补的序列,5端是一个锚定序列,它同非编辑的mRNA序列互补。在编辑时,形成一个编辑体(editosome),以gRNAs内部的序列作为模板进行转录物的校正,同时产生编辑的mRNA。gRNA3端的oligo(U)尾可作为被添加的U的供体。11 piRNA piRNA主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中，通过与Piwi亚家族蛋白结合形成piRNA复

11、合物（piRC）来调控基因沉默途径。对Piwi亚家族蛋白的遗传分析以及piRNA积累的时间特性研究发现，piRC在配子发生过程中起着十分重要的作用。还能维持生殖系和干细胞功能和调节翻译和mRNA的稳定性。12 atRNA（反义RNA）是指与mRNA互补的RNA分子,由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合,即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式，反义RNA也参与了和P22噬菌体的溶菌/溶源状态的控制。2. 请以发育生物学（developmental biology）、表观遗传学(epigenetics)、体细胞

12、重编程技术(somatic cell reprogramming)、体细胞克隆(somatic cell cloning)、细胞凋亡(apoptosis)或诱导干细胞(iPS)、干细胞(stem cell)为关键词，阅读至少一篇2010年以后的外文文献，阐述相关方面研究进展，或有关技术在动物生殖细胞（卵母细胞、精子）发生、卵泡发育、早期胚胎发育过程中的应用研究（不少于2000字，并附上所阅读文献全文）。注意不能抄袭有关中文文献。动物生化实验技术试题1、 试述分子杂交技术（核酸和蛋白质）的种类、适用范围及特点。核酸分子杂交技术是利用DNA变性与复性的原理，在某种理化因素作用下DNA双链分子解链变

13、性后，在DNA复性重新形成双螺旋结构时，把不同的DNA单链分子或者DNA与RNA的混合物放在同一溶液中，只要在DNA或RNA单链分子之间存在一定的碱基互补配对关系，就可以在DNA之间或DNA与RNA之间形成杂化的双链。蛋白质分子杂交是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。面重点介绍三种常用的分子杂交技术。（1） Southern杂交-DNA和DNA分子之间的杂交southern杂交主要用来研究DNA分子中某一基因位置、某一专一序列在待检样品中存在与否及两种核酸分子之间的相似性。1、用于对基因组中特定基因的定位及检测。2、用于从基因文库中找到所需要的基因。（2） Northern杂交DNA和RN

14、A分子之间的杂交。目前主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异性mRNA的表达水平或比较不同组织或细胞中同一基因的表达情况，如在基囚工程中是检测目的基因是否转录出mRNA的方法。如果RNA分子在大小和含量上与正常情况不同，可以考虑是否有调控区的突变或剪接部分的突变。（3） western杂交蛋白质分子(抗原一抗体)之间的杂交。可用于检测样品中特异蛋白质是否存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。如检测目的基因在受细胞中有没有翻译出相应的蛋白质，检测病人血液中是否有某种抗体从而检测是否感染过某种抗原，单克隆抗体技术中用于筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞等。2. 简述核酸和

15、蛋白质浓度分析方法。（1）紫外分光光度法紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50g/ml双链DNA，单链DNA浓度约为33g/ml，RNA约为40g/ml，寡核苷酸约为35g/ml。如用1cm光径，用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50OD260读数稀释倍数/1000RNA（mg/ml）=40

16、OD260读数稀释倍数/1000。A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。（

17、2）定糖定磷法定糖定磷法是通过测定核酸中戊糖和无机磷含量实现对核酸含量的测定。该法无需特殊仪器，只需要将地衣酚、二苯胺及钼酸铵等与核酸样品反应，再通过分光光度计测定光吸收值即可定量核酸。但此法准确度差、灵敏度低、干扰物多、操作繁琐，在现今的研究中已较少采用。比如二苯胺法是利用脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成羟基酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收，在每毫升含DNA20-400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除DNA外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样的反应。少采用。比如二苯胺法是利用脱氧核糖核酸中的脱氧核

18、糖在酸性环境中变成羟基酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收，在每毫升含DNA20-400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除DNA外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样的反应。1、DNA标准曲线的制作取8支试管，编号，以一定的梯度依次加入不同浓度的DNA溶液和二苯胺试剂试剂。加毕，摇匀，于60恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D595nm值）。以光密度为纵坐标，DNA含量（ug/ml）为横坐标，绘制标准曲线。2、样品的测定取2支试管，各加0.2-0.5毫升的待测液（内含DNA应在标准曲线可测范

19、围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA的含量，按下式计算出样品中DNA的百分含量。DNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值稀释倍数注意事项。1、二茉胺法测定DNA含量灵敏度不高，待测样品中DNA含量低于50mg/L即难以测定。乙醛可增加二苯胺法测定DNA的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。2、样品中含有少量RNA并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰DNA定理。（3）酶催化法基于酶催化的核酸定值方法

20、是一种相对核酸定量法。其原理是染料能同时与酶和核酸结合，通过检测酶的催化活性即可实现对核酸的定量。此法的优点在于不需要通过核酸扩增，操作方便，使用的仪器简单。但该法实验中，酶的催化活性受多方面影响，难以达到最佳状态，会使定量结果出现偏差。（3）荧光染料法荧光染料法是通过检测荧光试剂与DNA结合后的荧光强度变化而实现对核酸的定量。某些荧光探针试剂本身荧光强度不大，但与DNA结合后荧光强度大大增强，如：溴化乙锭在水溶液中的荧光量子产率很低，但它与DNA结合后，产生很强的荧光，激发波长显著红移；又如Hoechst33258是一种双苯并咪唑荧光染料，可高度特异地与双链DNA非嵌入性结合，结合后其荧光率

21、由0.01增至0.6。荧光染料法适用于样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质的样品，绝对灵敏度很高.如利用Hoechst33258可测定纳克级水平的DNA。PicoGreen及SYBRGreen的检测灵敏度较EB和Hoechst33258更高，PicoGreen可检测低至0.25-0.5ng的DNA样品。前已有许多商品化核酸定量荧光染料，如Invitrogen公司用于测定双链DNA的PicoGreen、用于测定单链DNA的OliGreen及用于测定RNA含量的RiboGreen等。含这些染料的核酸定量试剂盒被认为是目前对微量核酸定量较准确的方法。与紫外分光光度法相比，荧光染料法的应用尚不广

22、泛它存在以下缺陷：（1）某些荧光染料（如EB等）具有极强的毒性和致诱变性；（2）荧光分析对环境因素极为敏感，易受温度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干扰；（3）该法需制作标准曲线，操作较复杂；（4）需专业的定量试剂盒，价格昂贵；（5）精确定量需依赖已知浓度的标准物质，而目前缺乏经过精确定值的标准物质，且少数现今采用标准物质（DNA）的定量方法为紫外分光光度法，这就产生潜在的偏差并使测量结果无法溯源到国际单位制。在水溶液中的荧光量子产率很低，但它与DNA结合后，产生很强的荧光，激发波长显著红移；又如Hoechst33258是一种双苯并咪唑荧光染料，可高度特异地与双链DNA非嵌入性结合，结合后其荧光

23、率由0.01增至0.6。荧光染料法适用于样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质的样品，绝对灵敏度很高.如利用Hoechst33258可测定纳克级水平的DNA。PicoGreen及SYBRGreen的检测灵敏度较EB和Hoechst33258更高，PicoGreen可检测低至0.25-0.5ng的DNA样品。目前已有许多商品化核酸定量荧光染料，如Invitrogen公司用于测定双链DNA的PicoGreen、用于测定单链DNA的OliGreen及用于测定RNA含量的RiboGreen等。含这些染料的核酸定量试剂盒被认为是目前对微量核酸定量较准确的方法。与紫外分光光度法相比，荧光染料法的应用尚

24、不广泛它存在以下缺陷：（1）某些荧光染料（如EB等）具有极强的毒性和致诱变性；（2）荧光分析对环境因素极为敏感，易受温度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干扰；（3）该法需制作标准曲线，操作较复杂；（4）需专业的定量试剂盒，价格昂贵；（5）精确定量需依赖已知浓度的标准物质，而目前缺乏经过精确定值的标准物质，且少数现今采用标准物质（DNA）的定量方法为紫外分光光度法，这就产生潜在的偏差并使测量结果无法溯源到国际单位制。（4）杂交定量法杂交定量法主要包括：Southern杂交、Northern杂交、基因芯片、支链信号放大技术及Rnase保护技术。Southern杂交特异性强，但操作复杂，灵敏度低。与S

25、outhern杂交类似的是用于检测RNA的Northern杂交技术，可用于基因表达量的比较研究。生物芯片是一种高通量的杂交定量技术。该技术以核酸杂交为基础，将短的寡核苷酸或cDNA序列高密度地固定在固相支持物的表面，然后加入已标记的目的序列进行杂交，之后检测荧光信号。由于荧光信号的强度与目标分子的数目成比例，从而实现核酸定量检测。支链信号放大技术采用了一种人工合成的、结构如同树枝的DNA信号放大探针分支链DNA，其优点是：（1）只需将释放的核酸变性，样品处理简单；（2）不经过指数增长的扩增过程，避免了扩增产物污染及PCR抑制因素的影响；（3）可高通量检测病原体。但该方法成本较高，且当放大倍数低

26、时，敏感性较差，检测范围窄，不适用于RNA的低浓度检测。RNase保护技术由Zinn于1983年首次提出，此法的灵敏度高于Northern杂交，但成本比较高、放射性同位素有致癌作用，且所转录成的RNA易降解，增加了实验误差。蛋白质浓度分析方法一、蛋白浓度的直接测定（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，

27、操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。二紫外吸收法测定蛋白质含量：大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。三双缩脲法（Biuret法）双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与Cu

28、SO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。四BCA方法测定蛋白质含量BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5g/ml），应用更加灵活。蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将

29、Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。五凯氏定氮法：凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含量。当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。消化完成后

30、，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。根据所用标准盐酸的量可计算出待测物中的总氮量。蛋白质的含氮量为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品中蛋白质的含量。3. 预对某个基因的表达（RNA和蛋白质水平）进行定性和定量分析，试述可采用的技术路线和主要实验方法。答：通过mRNA表达水平的检测： Northern blot

31、、real time PCR、原位杂交等。通过蛋白表达水平的检测：（1）定量检测分析：western bloting（2）蛋白质功能分析：免疫荧光技术、酵母双杂交、ChIP、荧光共振能量转移等。可采用的技术路线和主要实验方法有：（1） mRNA表达水平的检测Northern Blot:是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种RNA分析技术。将RNA变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。基本步骤：完整mRNA的分离根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离将RNA转移到固相支持物（尼龙膜）上，在转移的过程中，要保持RNA在凝胶中的相对

32、分布将RNA固定在支持物上（UV交联）固相RNA与探针分子（DNA或RNA）杂交除去非特异性结合到固相支持物上的探针分子对特异性结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。real time PCR又称实时定量荧光，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。基本步骤：样品RNA的抽提RNA质量检测，一般利用紫外吸收法和变性琼脂糖凝胶电泳进行测定样品cDNA的合成梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（-actin）实时定量PCR制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板待测样品的待测基因实时定量P

33、CR实时定量PCR使用引物列表PCR产物进行电泳进行实时荧光定量PCR。（2） 蛋白表达水平的检测Western blot以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法是利用此方法对细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。基本步骤：蛋白质样品的制备SDS-PAGE进行分离蛋白质转膜特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印记杂交再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig）最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取免疫印迹信息。酵母双杂交酵母双杂

34、交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNAbindingdomain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的

35、转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。试验流程酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。专心-专注-专业