广东省原住口腔扁平苔藓患者非刺激全唾液蛋白组学研究.docx

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1、广东省原住口腔扁平苔藓患者非刺激全唾液蛋白组学研究 组织将其列入癌前状态2。OLP目前发病机制尚不明确，临床尚无特殊有效的治疗方法。双向荧光差异凝胶电泳技术，是利用电荷和分子量的差异分别蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的其次向SDS-PAGE凝胶图像3-4。与以往的双向电泳技术相比，重复性好，灵敏度高。本探讨采纳双向荧光差异凝胶电泳-质谱分析技术，通过对本地区口腔扁平苔蘚患者唾液蛋白的筛选找出差异蛋白，为进一步探讨本地区OLP的发病机制供应依据。 1 资料与方法 1.1 一般资料 选取本院2022年1月-2022年12月收治的15例口腔扁平苔藓患者为探讨组，15例正常者为比照组

2、，收集两组患者的非刺激性全唾液。其中探讨组男6例，女9例，平均年龄岁。比照组男7例，女8例，平均年龄岁。两组患者一般资料比较差异均无统计学意义，具有可比性。该探讨已经医院伦理学委员会批准，入选患者知情同意。 1.2 纳入及解除标准 两组入选成员均为广东省原住人口；均全身无系统性疾病；口腔内均无其他黏膜病变及中、重度牙周炎；妇女均未处于怀孕期及哺乳期；半年内未做过牙周基础治疗；最近3个月均未服用过抗生素；均全口无龋者；均无抽烟者。 1.3 方法 1.3.1 仪器设备 Ettan等电聚焦电泳仪、Ettan垂直板电泳仪、MultiTem P 温控循环水浴、Typhoon 9400多功能荧光扫描系统、

3、Image Quant图像分析软件、Decyder Differentialin-gel Analysis V ersion 7.0凝胶分析软件均为GEHealthcare 公司产品，4800 M ALDI-TOF/TOF质谱为Applied Biosystem 公司产品 1.3.2 样本的采集 OLP患者在采集前一天晚餐清淡饮食，睡前采纳Bass刷牙法进行口腔护理。全部成员均根据Rhodus改良的方法，采集WUS 3 mL置于无菌试管。收集全部样品后，吸取唾液上清液加入离心管中，随后加入簇新配制50%胎牛血清白，快速用封口膜密封，快速放入-80 超低温冰箱中冷冻、备用。 1.3.3 样本的处

4、理 将样本进行裂解、离心，并取上清液。得到蛋白溶液经2D-Clean up试剂盒纯化后用2D-Q uant试剂盒进行定量。每样品各取50 g蛋白质，根据CyDye DIGE Fluor minimal labeling kit试剂盒运用说明进行荧光标记。 1.3.4 双向电泳 将用Cy2、Cy3和Cy5标记的样品混合在一支离心管，加入等体积的2sample buffer，用移液器吸打混匀后避光、冰上放置10 min。加入一向电泳水化液至450 L，混匀。将上述溶液加入Holder中，当心置入24 cm胶条，用覆盖油覆盖。等电聚焦参数设定为：30 V，12 h；101 V，1 h；1010 V，

5、1 h；梯度升压至8000 V，2 h；电流限制在50 A/胶条。等点聚焦后在平衡液1和平衡液2中各平衡15 min。用电泳液轻轻润洗胶条。然后转移到其次向已制好的12.5% SDS-PAG E胶上，用0.5%琼脂糖封顶，进行其次向电泳，二向电泳的参数设定为：3 W/胶条，45 min；17 W/胶条至溴酚蓝染料迁移至胶的底部结束电泳。 1.3.5 图像扫描 用Typhoon 9400荧光扫描仪分别采集Cy2、Cy3和Cy5荧光信号。通过调整PM T，使选定的强信号区域荧光强度在60000101000并尽量接近，平衡荧光信号。所得图像用Decyder Differentialin-gel An

6、alysis Version 7.0凝胶分析软件进行差异蛋白分析。 1.3.6 质谱分析 考马斯亮蓝后挖取感爱好的差异蛋白质点置于离心管中，进一步用胰蛋白酶降解，进行MALDI-TOF/TOF质谱分析，通过Mascot数据搜寻鉴定蛋白质。 1.4 统计学处理 采纳SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料用表示，比较采纳t检验；计数资料以率表示，比较采纳 字2检验，P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 两组SDS-PAGE蛋白条带比较 SDS-PAGE结果显示，全部样本的蛋白条带清楚，两组间蛋白条带重复性较好，并无明显蛋白丢失现象。 2.2 两组2-D DIGE结果比较 经2-

7、D DIGE检测两组总蛋白整体分布相像，图像重复性较好、辨别率比较高，探讨组与比照组平均蛋白质点数分别为个和个。 2.3 两组质谱分析鉴定结果 质谱分析结果显示，两组唾液蛋白存在五个差异明显的蛋白质，即分泌性IgA、锌2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白，探讨组中分泌性IgA表达下调，其余四种差异蛋白表达明显上调，见表1。 3 探讨 口腔扁平苔藓在口腔疾病中比较常见，主要的临床表现为乳白色斑点，斑细小孤立，排列成环状、线状及不规则的网状，也有些患者出现斑块、萎缩、丘疹、侵蚀性溃疡和大疱5。目前其发病机制仍不明确，有自身免疫、感染、神经精神因素、细胞因子作用、家族遗传等学说，也有些人认为

8、药物因素、内分泌异样、慢性病灶等因素也可诱发本病6-7。随着以蛋白质组学探讨为主的后基因组时代的来临，人们起先从蛋白质组学的角度探讨疾病的发朝气制8。通过差异蛋白质来探讨OLP，将更加全面地揭示其发生、发展过程中的重要蛋白质，为深化探讨OLP发朝气制及临床诊治供应有效信息。 蛋白质组学技术快速发展，2-D DIGE的出现有效地克服了传统2-DE技术的弊端，辨别率高，重复性好，削减试验误差带来的影响，运用荧光染料共价标记，可分析微量的蛋白质样品，灵敏度高9-10。唾液中既包含了血液中可以被常规检测到的全部蛋白、激素、抗体和其他分子标记，还包括很多唾液腺分泌的蛋白质等，可反映身体的健康状态11。O

9、LP的发生会导致唾液中的蛋白质组分发生改变，因此精确全面地检测患者唾液的蛋白组分表达水平找寻出差异蛋白，对于进一步阐明OLP发病机制具有非常重要的意义。且唾液检查无创伤，简洁便利，患者易于接受。本探讨利用双向荧光差异凝胶电泳-质谱分析技术，胜利筛选并鉴定出OLP患者唾液蛋白中存在分泌性IgA、锌2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白五种差异蛋白质。 分泌性IgA在唾液中含量较高，与口腔的生理活动功能亲密相关，许彦枝等12发觉，OLP患者唾液蛋白中的分泌性IgA含量明显降低。本探讨中探讨组唾液蛋白中分泌性IgA含量明显低于比照组，与之前的相关报道保持一样，具有临床意义。这可能是由于当口腔腺

10、体及其四周黏膜合成和分泌分泌性IgA不足时，唾液中分泌性IgA含量降低，病原体易侵入口腔引起感染13。锌2糖蛋白作为一种脂解因子，可以促进脂肪细胞的脂质分解，在恶性肿瘤病人体内表达明显增高，特殊是恶病质患者14。除了血清和精液，在尿液、唾液、汗液等体液中都能检测到这种蛋白15。本探讨中锌2糖蛋白在OLP患者唾液蛋白中表达上调，详细的机制有待进一步探讨。 碳酸酐酶6具有维持口腔环境pH值平衡的功能16。探讨发觉唾液碳酸酐酶6削减时，龋齿发生率增加。本探讨中OLP患者唾液蛋白中碳酸酐酶6增加，可能与口腔内细菌繁殖导致产酸增高有关。近年来，唾液淀粉酶活性检测的有效性渐渐得到认可，已经成为一种反映人体

11、自主神经系统在压力及压力相关刺激下发生改变最为敏感的生物标记物17。在高度精神集中运算压力下，健康人群的唾液淀粉酶分泌会明显增加。焦虑患者唾液中的唾液淀粉酶活性与焦虑程度明显正相关18。长期的神经心情惊慌焦虑，很有可能诱发OLP，从而引起唾液淀粉酶含量的增加。唾液中的白蛋白主要来自血液，武影19等探讨发觉血清白蛋白在慢性牙周炎患者WUS中的表达上调。这主要是全唾液中含有10%来源的龈沟液成分，在牙周组织炎症状态下龈沟液流量增大，进入唾液的成分也可能增高20。本探讨中探讨组血清白蛋白表达上调，可能是由于OLP是一种慢性炎症性疾病，对局部黏膜产生的刺激影响唾液的分泌，诱发血清白蛋白含量增多所致。

12、综上所述，利用双向荧光差异凝胶电泳-质谱分析技术，筛选出OLP患者唾液蛋白存在的五种差异蛋白，但仍须要通过Western blot等技术进一步验证。本探讨将接着探究本地区扁平苔藓患者唾液中蛋白质的代谢改变规律与发病机制，努力为临床诊疗供应依据。 参考文献 1唐国瑶.口腔扁平苔藓诊断与治疗的现状和展望J.中华口腔医学杂志，2022，47：395-3101. 2孟红军.王守儒教授治疗口腔扁平苔藓阅历及相关现代探讨J.中国医学创新，2022，12：95-101. 3杜俊变，王丽惠，段江燕.2D-DIGE技术在蛋白质组学中的应用J.生物學杂志，2022，28：84-87. 4陈波，邹声泉，邱江锋，等.

13、荧光差异凝胶电泳筛选胆管癌胆汁差异表达蛋白的探讨J.中华肝胆外科杂志，2022，17：231-234. 5李忠权.氯喹联合曲安奈德在口腔扁平苔藓治疗中的效果视察J.中国医学创新，2022，8：173-173. 6葛娅娜，张成仁，靳慧，等.Th1细胞/Th2细胞在口腔扁平苔藓发病机制中的作用J.免疫学杂志，2022，28：255-258. 7张梅华，缪羽，昭日格图.口腔扁平苔藓与精神因素的相关性探讨J.内蒙古医学杂志，2022， 47：816-820. 8张伟斌，陈丹，马伟钦，等.结直肠癌有无肝转移血清差异蛋白质表达的探讨J.中国医学创新，2022，11：1-6. 9黄鹤，刘继红，李玉洁，等.差

14、异荧光电泳分别人卵巢癌腹水蛋白的探讨J.中国医药指南，2022，9：177-178. 10刘铁军，李昆珊，刘健，等.应用双向荧光差异凝胶电泳和质谱技术筛选口腔扁平苔藓唾液差异蛋白J.好用口腔医学杂志，2022，31：793-796. 11张杰铌，周绍楠，郑晖，等.唾液蛋白质组学的探讨进展与应用J.中华口腔医学杂志，2022， 47：273-273. 12许彦枝，张杨杨，刘健，等.化湿行瘀清热方剂治疗的口腔扁平苔藓患者效果及其唾液白蛋白、分泌型IgA水平视察J.山东医药，2022，56：101-101. 13张素欣，尹克，段玉芹，等.SIgA IL-6和树突状细胞在口腔癌中的表达及相互作用J.中

15、国肿瘤临床，2022， 40：257-260. 14饶志坚，袁海平，史仍飞.锌2糖蛋白生物学功能J.中国生物化学与分子生物学报，2022，30：11101-1201. 15孟倩，赵旭宏，赵瑾，等.消化道不同恶性肿瘤患者血清锌-2-糖蛋白水平检测及临床意义J.首都医科高校学报，2022，33：665-668. 16谢正元，吕珂，龚辉，等.碳酸酐酶VI与上消化道pH值平衡关系探讨J.好用临床医学，2022，11：1-2. 17刘银，金美辰.心理压力下唾液淀粉酶活性及自由基清除活性的改变J.海峡药学，2022， 28：264-266. 18张杰，刘伟忠，杨泽民，等.唾液和唾液淀粉酶临床探讨进展J.医药导报，2022，32：342-345. 19武影，束蓉，刘雄伟.慢性牙周炎患者和健康者非刺激性全唾液中的差异蛋白比较J.华西口腔医学杂志，2022，29：519-521. 20王妙妍，阮毅，陈广盛.牙周炎对2型糖尿病患者血清和龈沟液IL-6含量影响的探讨J.中国医学创新，2022，11：73-76. 第9页 共9页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页第 9 页 共 9 页