医学遗传学临床遗传学 .ppt

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1、医医 学学 遗遗 传传 学学临床遗传学临床遗传学临临床床遗遗传传学学(clinical genetics)：是是研研究究临临床床各各种种遗遗传传病病的的诊诊断断、产产前前诊诊断断、预预防防、遗遗传传咨咨询询以以及及治治疗疗，以以降降低低遗遗传传病病在在人人群群中中的的危危害害，提提高高人人们们的的遗传素质。遗传素质。临床遗传学第一节第一节 遗传病诊断遗传病诊断临床遗传学临床遗传学遗遗传传病病的的诊诊断断方方法法具具有有普普遍遍性性诊诊断断原原则则，又有遗传学的诊断手段。又有遗传学的诊断手段。遗遗 传传 病病 的的 诊诊 断断 主主 要要 包包 括括 产产 前前 诊诊 断断(prenatal d

2、iagnosis)、症症 状状 前前 诊诊 断断(presymptomatic diagnosis)和和现现症症状状病病人人诊诊断断(symptomatic diagnosis)。其其中中以以产产前前诊诊断断和和症状前诊断尤其重要。症状前诊断尤其重要。临床遗传学临床诊断临床诊断vv病史、症状和体征病史、症状和体征O家族史家族史 应特别注意患者和代述人所提应特别注意患者和代述人所提供的家族各成员的体征、症状和关系的供的家族各成员的体征、症状和关系的准确性。准确性。临床遗传学临床诊断临床诊断vv病史、症状和体征病史、症状和体征O婚姻史婚姻史 着重了解婚龄、次数、配偶健着重了解婚龄、次数、配偶健康情

3、况以及是否是近亲婚配。康情况以及是否是近亲婚配。临床遗传学临床诊断临床诊断vv病史、症状和体征病史、症状和体征O生育史生育史 着重询问生育年龄、子女数目及着重询问生育年龄、子女数目及健康情况，有无流产、死产和早产史，新健康情况，有无流产、死产和早产史，新生儿死亡或患儿。除询问上述情况外，还生儿死亡或患儿。除询问上述情况外，还应了解患儿有无产伤、窒息，妊娠早期有应了解患儿有无产伤、窒息，妊娠早期有无患病毒性疾病和接触过致畸因素等。无患病毒性疾病和接触过致畸因素等。临床遗传学临床诊断临床诊断vv病史、症状和体征病史、症状和体征O症症状状和和体体征征 遗遗传传病病除除有有和和其其他他疾疾病病相相同同

4、体体征征外外，又又有有其其本本身身特特异异性性症症候候群群，为为初初步步诊诊断断提提供供初初步步线线索索。如如苯苯丙丙酮酮尿尿症症患患儿儿常常伴伴有有智智力力低低下下和和特特殊殊腐腐臭臭尿尿；Down综综合合征征患患儿儿伴伴有有智智力力低低下下、眼眼距距宽宽、眼眼裂裂小小、张口伸舌等体征。张口伸舌等体征。临床遗传学临床诊断临床诊断vv系谱分析系谱分析系系谱谱分分析析(pedigree analysis)是是在在调调查查患患者者及及家家族族各各成成员员的的发发病病情情况况后后按按一一定定规规律律绘绘制制一一个个图解并行分析。图解并行分析。临床遗传学临床诊断临床诊断vv系谱分析系谱分析系系谱谱分分

5、析析(pedigree analysis)是是在在调调查查患患者者及及家家族族各各成成员员的的发发病病情情况况后后按按一一定定规规律律绘绘制制一一个个图解并行分析。图解并行分析。系系谱谱分分析析，有有助助于于区区别别遗遗传传病病和和非非遗遗传传病病，单单基基因因或或多多基基因因病病，显显性性、隐隐性性，常常染染色色体体遗遗传传病或性染色体遗传病。病或性染色体遗传病。临床遗传学临床诊断临床诊断vv系谱分析应该注意以下几个方面系谱分析应该注意以下几个方面O系谱本身的全面、准确、可靠性系谱本身的全面、准确、可靠性O要注意辨别区别孟德尔式遗传病、非孟德要注意辨别区别孟德尔式遗传病、非孟德尔式遗传病和一

6、些特殊的遗传现象，如遗尔式遗传病和一些特殊的遗传现象，如遗传印记和动态突变等传印记和动态突变等临床遗传学临床诊断临床诊断vv系谱分析应该注意以下几个方面系谱分析应该注意以下几个方面O外显不全而使系谱呈现隔代遗传外显不全而使系谱呈现隔代遗传O迟发显性迟发显性O新的突变产生新的突变产生O显性和隐性的相对性显性和隐性的相对性O家系小而选样偏倚现象家系小而选样偏倚现象临床遗传学细胞遗传学诊断细胞遗传学诊断染染色色体体检检查查或或称称核核型型分分析析(karyotype analysis)是是辅辅助助诊诊断断和和确确诊诊染染色色体体疾疾病病的的主要方法之一。主要方法之一。临床遗传学细胞遗传学诊断细胞遗传

7、学诊断vv性染色质检查性染色质检查正常女性细胞中有两条正常女性细胞中有两条X染色体，其中一染色体，其中一条有活性，另一条无转录活性，在间期细胞中条有活性，另一条无转录活性，在间期细胞中呈异固缩而形成一个约呈异固缩而形成一个约1 m大小的贴近核膜内大小的贴近核膜内缘的浓染小体，称为缘的浓染小体，称为X染色质染色质(X-chromatin)或或Barr小体小体。临床遗传学细胞遗传学诊断细胞遗传学诊断vv性染色质检查性染色质检查在男性间期细胞核中，应用荧光染料染色在男性间期细胞核中，应用荧光染料染色后可见一个约为后可见一个约为0.3 m大小的强荧光小体，即大小的强荧光小体，即Y染色质染色质(Y-ch

8、romatin)或或Y小体小体。临床遗传学细胞遗传学诊断细胞遗传学诊断vv染色体核型分析染色体核型分析染染色色体体数数目目异异常常和和结结构构畸畸变变的的分分析析。一一般般观观察察3050个个细细胞胞，其其中中有有35个个形形态态结结构构异异常完全相同的核型，即可做出初步诊断。常完全相同的核型，即可做出初步诊断。临床遗传学细胞遗传学诊断细胞遗传学诊断vv染色体核型分析染色体核型分析O高龄孕妇高龄孕妇(35岁以上岁以上)O多发性流产的妇女及其丈夫多发性流产的妇女及其丈夫O原发闭经和男女不孕症者原发闭经和男女不孕症者O智能发育不全、生长迟缓或伴有其他先天畸形者智能发育不全、生长迟缓或伴有其他先天畸

9、形者O夫妇中有染色体异常，如平衡易位、嵌合体等夫妇中有染色体异常，如平衡易位、嵌合体等O家族中已发现染色体异常或先天畸形个体家族中已发现染色体异常或先天畸形个体O有两性内外生殖器畸形者有两性内外生殖器畸形者临床遗传学细胞遗传学诊断细胞遗传学诊断vv染色体原位杂交染色体原位杂交应应用用标标记记的的DNA探探针针与与载载玻玻片片上上的的染染色色体体或或间间期期细细胞胞的的DNA或或RNA杂杂交交，研研究究核核酸酸片片段的位置，相互关系称为段的位置，相互关系称为原位杂交原位杂交。临床遗传学细胞遗传学诊断细胞遗传学诊断vv染色体原位杂交染色体原位杂交用用生生物物素素、地地高高辛辛等等标标记记DNA探探

10、针针，原原位位杂杂交交后后。用用荧荧光光生生物物素素和和抗抗体体进进行行免免疫疫检检测测和和放放大大杂杂交交信信号号，使使探探针针杂杂交交区区域域发发出出荧荧光光，这这种原位杂交称为种原位杂交称为荧光原位杂交荧光原位杂交(FISH)。临床遗传学细胞遗传学诊断细胞遗传学诊断vv染色体原位杂交染色体原位杂交检检测测染染色色体体缺缺失失、插插入入、易易位位及及扩扩增增等等结结构构异异常常，也也可可检检测测间间期期核核判判定定染染色色体体数数目目异异常常。双双色色FISH，多多色色FISH以以及及染染色色体体涂涂染染方方法法的的应用，提高了异常染色体的检出率和准确性。应用，提高了异常染色体的检出率和准

11、确性。临床遗传学生化检查生化检查基基因因突突变变引引起起的的单单基基因因病病往往往往表表现现在在酶酶和和蛋蛋白白质质的的质质和和量量的的改改变变和和缺缺如如。因因此此，酶酶和和蛋蛋白白质质的的定定量量、定定性性分分析析是是诊诊断断单单基基因因病病或先天代谢病的主要方法。或先天代谢病的主要方法。临床遗传学生化检查生化检查vv代谢产物的检测代谢产物的检测DMD可可检检测测血血清清中中磷磷酸酸肌肌酸酸激激酶酶活活性性；苯苯丙丙酮酮尿尿症症患患者者可可检检测测血血清清苯苯丙丙氨氨酸酸或或尿尿中中苯苯乙酸浓度做出判断等。乙酸浓度做出判断等。临床遗传学生化检查生化检查vv酶和蛋白质的分析酶和蛋白质的分析基

12、基因因突突变变导导致致表表达达调调控控异异常常或或翻翻译译后后加加工工修修饰饰缺缺陷陷，使使酶酶蛋蛋白白缺缺如如或或功功能能异异常常。通通过过酶酶活性检测而诊断某些遗传代谢病。活性检测而诊断某些遗传代谢病。临床遗传学基因诊断基因诊断分分子子生生物物学学技技术术极极大大的的丰丰富富了了我我们们对对人人类类遗遗传传病病的的分分子子病病理理学学研研究究的的认认识识，同同时时也也提提供供了从了从DNA水平对遗传病基因诊断的手段。水平对遗传病基因诊断的手段。基基因因诊诊断断(gene diagnosis)是是利利用用DNA分分析析技技术术直直接接从从基基因因水水平平(DNA或或RNA)检检测测遗遗传传病

13、的基因缺陷而做出诊断。病的基因缺陷而做出诊断。临床遗传学基因诊断的原理基因诊断的原理核核酸酸分分子子杂杂交交是是基基因因诊诊断断的的最最基基本本方方法法之之一一。其其基基本本原原理理是是根根据据碱碱基基互互补补原原则则，互互补补的的DNA单单链链在在一一定定条条件件下下结结合合成成双双链链，即即分分子子杂交杂交。临床遗传学基因诊断的原理基因诊断的原理结结合合是是特特异异性性的的，它它不不仅仅能能在在DNA和和DNA之间进行，也能在之间进行，也能在DNA和和RNA之间进行。之间进行。当当用用一一段段已已知知基基因因的的核核苷苷酸酸序序列列作作为为探探针针，与与变变性性后后的的单单链链基基因因组组

14、DNA混混合合时时，如如果果两两者者的的碱碱基基互互补补配配对对，结结合合成成双双链链，从从而而表表明明被被检检测测的的基因组基因组DNA中含有已知的基因序列。中含有已知的基因序列。临床遗传学基因诊断的原理基因诊断的原理进进行行基基因因检检测测有有两两个个必必要要条条件件，一一是是必必需需有有特特异异的的DNA探探针针，二二是是必必需需有有基基因因组组DNA。当二者均变性呈单链时，即可进行分子杂交。当二者均变性呈单链时，即可进行分子杂交。临床遗传学基因诊断的原理基因诊断的原理vv基因探针基因探针基基因因探探针针(gene probe)就就是是一一段段与与目目的的基基因因或或DNA互互补补的的特

15、特异异核核苷苷酸酸序序列列，它它可可以以包包括括整整个个基基因因，也也可可以以是是基基因因的的一一部部分分，可可以以是是DNA本身，也可以是由之转录而来的本身，也可以是由之转录而来的RNA。临床遗传学vv基因探针基因探针O探针来源探针来源zz基因组探针基因组探针基因组探针基因组探针(genomic probe)(genomic probe)zzcDNAcDNA探针探针探针探针(cDNA probe)(cDNA probe)zz人工合成的寡核苷酸探针人工合成的寡核苷酸探针人工合成的寡核苷酸探针人工合成的寡核苷酸探针基因诊断的原理基因诊断的原理临床遗传学vv基因探针基因探针O探针制备探针制备进进行

16、行分分子子杂杂交交需需要要大大量量的的探探针针拷拷贝贝，一一般般是是通通过过分分子子克克隆隆(molecular cloning)获获得得的的。克克隆隆(clone)是是指指用用无无性性繁繁殖殖方方法法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。基因诊断的原理基因诊断的原理临床遗传学O探针制备探针制备基基因因组组DNA探探针针 应应先先制制备备基基因因组组文文库库，从从中中筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因片片段段的的克克隆隆，再通过细菌扩增，制备出大量探针。再通过细菌扩增，制备出大量探针。vv基因探针基因探针基因诊断的原理基因诊断的原理临床遗传学O探针制备探

17、针制备cDNA探探针针 首首先先需需提提取取纯纯化化mRNA，从从组组织织、细细胞胞中中提提取取mRNA，以以其其为为模模板板，在在逆逆转转录录酶酶的的作作用用下下合合成成与与之之互互补补的的DNA(即即cDNA)。vv基因探针基因探针基因诊断的原理基因诊断的原理临床遗传学O探针制备探针制备寡寡核核苷苷酸酸探探针针(ASO)是是根根据据已已知知基基因因序序列列合合成成的的与与其其互互补补的的核核苷苷酸酸片片段段，长长度度可可十十几几个个至至几几十十个个核核苷苷酸酸。其其序序列列跨跨越越基基因因突突变变位位点点，每每一一突突变变位位点点有有两两种种ASO探探针，分别与正常序列和异常序列互补。针，

18、分别与正常序列和异常序列互补。vv基因探针基因探针基因诊断的原理基因诊断的原理临床遗传学O探针标记探针标记目目的的是是使使探探针针带带有有标标识识物物与与DNA结结合合后后产产生生可可识识别别信信号号。通通常常采采用用放放射射性性同同位位素素32P标标记记探探针针的的某某种种核核苷苷酸酸的的磷磷酸酸基基。近近年年来来发发展展了了一一些些用用非非同同位位素素如如生生物物素素、地地高辛配体等作为标记物的方法。高辛配体等作为标记物的方法。vv基因探针基因探针基因诊断的原理基因诊断的原理临床遗传学O探针标记探针标记zz缺口平移法缺口平移法缺口平移法缺口平移法(nick translation)(nic

19、k translation)vv基因探针基因探针基因诊断的原理基因诊断的原理临床遗传学缺口平移法缺口平移法临床遗传学限制性酶限制性酶限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶(restriction endonuclease)，又又简简称称限限制制酶酶或或内内切切酶酶。是是重重组组DNA技技术术和和基基因因诊诊断断中中最最重重要要的的一一类类工工具具酶酶。限限制制酶酶能能特特异异地地识识别别和和切切割割特特异异的的核核苷苷酸酸序序列列，将将双双链链DNA切切成成较较小小的的片段。片段。临床遗传学vv限制酶的命名限制酶的命名限制性酶限制性酶EcoR属名属名属名属名种名种名种名种名菌株名菌株名

20、菌株名菌株名酶的序号酶的序号酶的序号酶的序号临床遗传学vv限制酶识别序列和切割形式限制酶识别序列和切割形式限制性酶限制性酶HaeHae5 33 5G G C CG G C CC C G GC C G G5 33 5G GG GC CC CC CC CG GG GMboMbo5 33 5G A T CG A T CC T A GC T A G5 33 5G A T CG A T CC T A GC T A GBamBamHH5 33 5G G A T C CG G A T C CC C T A G GC C T A G G5 33 5G GC C T A GC C T A GG A T C CG

21、 A T C CG GPstPst5 33 5C T G C A GC T G C A GG A C G T CG A C G T C5 33 5C T G C AC T G C AG GG GA C G T CA C G T C临床遗传学vv限制酶识别序列和切割形式限制酶识别序列和切割形式限制性酶限制性酶O平末端平末端(blunt end)：对称轴切，连接效果差：对称轴切，连接效果差O粘性末端粘性末端(sticky end)：交错切：交错切临床遗传学DNA多态性多态性一一个个人人的的两两套套单单倍倍体体DNA是是不不完完全全相相同同的的，一一般般每每100500个个碱碱基基对对就就有有一一个

22、个是是不不相相同同的的。换换言言之之，如如果果把把两两套套基基因因组组的的DNA(各各2.8109bp)排排列列起起来来，那那么么平平均均有有1000万万处处不不同同，它它们们多多位位于于内内含含子子序序列列中中。实实际际上上，除除单单卵卵双双生生子子外外，人人群群中中没没有有两两个个个个体体的的基基因因组组DNA是完全相同的。是完全相同的。临床遗传学vvRFLP：第一代多态标记：第一代多态标记vvVNTR，STR：第二代多态标记：第二代多态标记vvSNP：第三代多态标记：第三代多态标记DNA多态性多态性临床遗传学vvRFLP：第一代多态标记：第一代多态标记DNA多态性多态性由由于于碱碱基基的

23、的变变异异可可能能导导致致酶酶切切点点的的消消失失或或新新的的切切点点出出现现，从从而而引引起起不不同同个个体体DNA在在用用同同一一限限制制酶酶切切时时，DNA片片段段长长度度出出现现差差异异，这这种种由由于于内内切切酶酶切切点点变变化化所所导导致致的的DNA片片段段长长度度的的差差 异异，称称 为为 限限 制制 性性 片片 段段 长长 度度 多多 态态 性性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)。临床遗传学vvRFLP：第一代多态标记：第一代多态标记DNA多态性多态性8kb8kb8kb8kb5kb3kb等位基因等位基因1等位基因等位基

24、因2探针位置探针位置 2/2 1/1 1/22/2 1/1 1/28kb8kb5kb5kb3kb3kb等位基因等位基因等位基因等位基因临床遗传学vvVNTR，STR：第二代多态标记：第二代多态标记DNA多态性多态性在在人人类类基基因因组组中中还还存存在在一一类类DNA重重复复序序列列，称称为为小小卫卫星星DNA。每每一一个个单单位位通通常常只只有有1628bp长长，但但其其重重复复次次数数在在人人群群中中是是高高度度变变异异的的。当当用用限限制制酶酶切切割割VNTR区区时时，只只要要酶酶切切位位点点不不在在重重复复区区内内，就就可可能能得得到到各各种种长长度度不不同同的的片片段段。限限制制性性

25、片片段段大大小小的的差差异异取取决决于于两两个个酶酶切切位位点点之之间的串联重复单位数目的不同。间的串联重复单位数目的不同。临床遗传学vvVNTR，STR：第二代多态标记：第二代多态标记DNA多态性多态性另另一一类类重重复复序序列列是是微微卫卫星星DNA。它它们们的的基基本本序序列列只只有有26bp，如如(TA)n、(CGG)n等等，通通常重复常重复1060次并呈高度的多态性。次并呈高度的多态性。临床遗传学vvSNP：第三代多态标记：第三代多态标记DNA多态性多态性单单核核苷苷酸酸重重复复(A)n的的位位点点极极其其丰丰富富，遍遍及及整整个个基基因因组组，具具有有高高度度多多态态。据据估估计计

26、基基因因组组中中大大约约平平均均1000bp就就会会出出现现一一个个SNP，这这样样SNP在在整整个个基基因因组组的的分分布布就就会会达达到到300万万个个。应应用用于于搜搜寻寻多多基基因因遗遗传传病病相相关关基基因因，对对重重要要疾疾病病进进行行连锁分析，进行致病基因定位和克隆等。连锁分析，进行致病基因定位和克隆等。临床遗传学vvSouthern印迹杂交印迹杂交基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法同同源源的的两两条条DNA-DNA在在一一定定条条件件下下结结合合形成双链。形成双链。临床遗传学vvSouthern印迹杂交印迹杂交基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法O基因组基因组DNA提取提取O

27、DNA限制性内切酶酶解基因组限制性内切酶酶解基因组DNAO琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段片段O凝胶中凝胶中DNA片段原位碱变性片段原位碱变性O凝胶中单链凝胶中单链DNA的的Southern印迹转移印迹转移O探针标记探针标记O分子杂交分子杂交O放射放射(荧光荧光)自显影或显色自显影或显色O结果分析结果分析临床遗传学vvSouthern印迹杂交印迹杂交基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法同同源源的的两两条条DNA-DNA在在一一定定条条件件下下结结合合形成双链。形成双链。O缺失、插入、倒位、基因扩增检测缺失、插入、倒位、基因扩增检测ORFLP连锁分析连锁分析临床遗传学vvSouth

28、ern印迹杂交印迹杂交基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法临床遗传学vvNorthern印迹杂交印迹杂交基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法是是指指DNA-RNA分分子子杂杂交交，应应用用特特异异性性基基因探针分析基因的转录水平。因探针分析基因的转录水平。临床遗传学vvNorthern印迹杂交印迹杂交基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法O提取提取 T、Cell 总总 RNAO提纯分离提纯分离mRNAO琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离RNAO转移至硝酸纤维素膜转移至硝酸纤维素膜O杂交检测杂交检测临床遗传学vvNorthern印迹杂交印迹杂交基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法是是指指DNA-

29、RNA分分子子杂杂交交，应应用用特特异异性性基基因探针分析基因的转录水平。因探针分析基因的转录水平。O检测检测mRNA长度分子量大小长度分子量大小(依电泳迁依电泳迁移率估计移率估计)OmRNA的含量，即基因表达高低。的含量，即基因表达高低。临床遗传学vv聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法PCR(polymerase chain reaction)是是模模拟拟体体内内DNA复复制制条条件件，应应用用DNA聚聚合合酶酶反反应应，特特异异性性扩扩增增某某一一DNA片片段段的的技技术术。体体外外程程序序化化的的DNA合成技术。合成技术。临床遗传学vv聚合酶链反应聚合

30、酶链反应(PCR)基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法合合成成待待扩扩增增区区域域两两端端已已知知序序列列，与与模模板板DNA互互补补的的寡寡核核苷苷酸酸特特异异性性引引物物，引引物物的的序序列列决定扩增片段的长度。决定扩增片段的长度。临床遗传学vv聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法反应体系反应体系：DNA模板，模板，Taq DNA聚合酶，聚合酶，dNTPs。临床遗传学vv聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法O反应程序反应程序变性变性变性变性(9495(9495)复性复性复性复性 延伸延伸延伸延伸 (3755(3755)(7

31、072)(7072)30-35cycles DNA30-35cycles DNA扩增扩增扩增扩增100100万倍万倍万倍万倍临床遗传学vv聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法临床遗传学vv聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法O优点优点z特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速z微量的模板微量的模板DNA即可扩增大量产物即可扩增大量产物临床遗传学vv聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法O应用应用z基因组基因组DNA分析分析z遗传物质的鉴定遗传物质的鉴定z遗传病的诊断遗

32、传病的诊断临床遗传学vv聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法O缺点缺点z需靶需靶DNA序列的信息序列的信息z产物短小，产物短小，DNA复制不精确复制不精确临床遗传学vvPCR相关技术相关技术基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法O增效增效PCR(booster PCR)当当扩扩增增少少于于1000拷拷贝贝的的模模板板DNA时时会会遇到两个问题：遇到两个问题：z形成引物二聚体形成引物二聚体z非特异扩增非特异扩增.消耗了引物和酶，而特异扩消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。增片段产量降低。临床遗传学vvPCR相关技术相关技术基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法O

33、增效增效PCR(booster PCR)对对于于这这种种情情况况，可可设设置置二二步步PCR，先先用用较较低低浓浓度度的的引引物物进进行行初初级级PCR，此此时时由由于于引引物物少少，形形成成产产物物二二聚聚体体的的可可能能减减少少，但但并并不不影影响响靶靶序序列列的的扩扩增增，只只是是产产量量不不高高。约约经经1520个个循循环环后后补补充充引引物物量量，以以初初级级PCR产产物物为为模模板板进进行行扩扩增增，靶序列的产量将相应增加。靶序列的产量将相应增加。临床遗传学vvPCR相关技术相关技术基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法O巢式巢式PCR(nest PCR)进进行行二二步步PCR，其其

34、中中第第二二级级PCR另另设设反反应应体体系系，并并应应用用另另外外的的PCR引引物物，新新引引物物的的位位置置位位于于初初级级PCR引引物物的的内内侧侧，只只有有初初级级PCR中中特特异的扩增片段才能被二级引物扩增。异的扩增片段才能被二级引物扩增。除除了了达达到到增增效效PCR同同样样的的目目的的外外，还还提提高高了最终产物的特异性。了最终产物的特异性。临床遗传学vvPCR相关技术相关技术基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法O多重多重PCR在在同同一一PCR体体系系中中加加入入若若干干对对PCR引引物物，这这些些引引物物的的退退火火温温度度相相近近，且且所所覆覆盖盖的的区区域域不不重重叠叠，

35、这这样样的的反反应应体体系系可可同同时时扩扩增增多多个个DNA片片段段。多多重重PCR常常用用来来检检测测同同一一基基因因的的多多个个外外显显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。子的缺失，或在检测缺失设置内对照。临床遗传学vvPCR相关技术相关技术基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法ORT-PCR以以mRNA为为模模板板，经经逆逆转转录录酶酶作作用用合合成成cDNA。使使微微量量的的mRNA(pg水水平平)迅迅速速扩扩增增(达达ng g水水平平)，大大大大提提高高mRNA的的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。临床遗传学vv扩增片段长度多态性扩增片段长

36、度多态性基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法小小卫卫星星DNA和和微微卫卫星星DNA的的长长度度多多态态性性可可以以通通过过PCR扩扩增增后后电电泳泳来来检检出出，并并用用于于致致病病基基因因的的连连锁锁分分析析，称称为为扩扩增增片片段段长长度度多多态态性性(Amp-FLP)连连锁锁分分析析法法。PCR扩扩增增后后，产产物物既既等等位位片片段段之之间间的的差差别别有有时时只只有有几几个个核核苷苷酸酸。多多用于突变性质不明的连锁分析。用于突变性质不明的连锁分析。临床遗传学vv等位基因特异性寡核苷酸探针等位基因特异性寡核苷酸探针基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法当当基基因因的的突突变变部部位位和

37、和性性质质完完全全明明了了时时，可可以以合合成成等等位位基基因因特特异异的的寡寡核核苷苷酸酸探探针针(ASO)，用用同同位位素素或或非非同同位位素素标标记记来来进进行行诊诊断断。探探针针为为20bp左右的核苷酸。左右的核苷酸。临床遗传学vv等位基因特异性寡核苷酸探针等位基因特异性寡核苷酸探针基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法用用于于检检测测点点突突变变时时一一般般需需要要合合成成两两种种探探针针，一一种种与与正正常常基基因因序序列列完完全全一一致致，能能与与之之稳稳定定地地杂杂交交，但但不不能能与与突突变变基基因因序序列列稳稳定定杂杂交交；另另一一种种与与突突变变基基因因序序列列一一致致，能

38、能与与突突变变基基因因序序列列稳稳定定杂杂交交，但但不不能能与与正正常常基基因因序序列列稳稳定定杂杂交交，就就可可以以把把只只有有一一个个碱碱基基发生了突变的基因区别开来。发生了突变的基因区别开来。临床遗传学vvPCR-SSCP基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法聚聚合合酶酶链链反反应应-单单链链构构象象多多态态性性(PCR-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)分析。分析。临床遗传学vvPCR-SSCP基因诊断技术与方法基因诊断技术与方法原原理理是是对对已已知知有有点点突突变变的的遗遗传传病病，在在疑疑有有突突变变的的DNA片片段段

39、附附近近设设计计一一对对引引物物进进行行PCR扩扩增增，然然后后将将扩扩增增产产物物用用甲甲酰酰胺胺变变性性，并并在在不不含含变变性性剂剂的的中中性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中电电泳泳，突突变变所所引引起起的的DNA构构象象差差异异将将出出现现泳泳动动变变位位，表表现现为为电泳带位置的差异，从而可据之做出诊断。电泳带位置的差异，从而可据之做出诊断。临床遗传学基因诊断应用基因诊断应用利利用用分分子子生生物物学学技技术术从从DNA水水平平检检测测人人类类遗传性疾病的基因缺陷，又称遗传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法分析法。O传统诊断：表现型传统诊断：表现型基因型基因型O基因诊断：基因型基因

40、诊断：基因型表现型表现型(逆向诊断逆向诊断)z直接诊断直接诊断z间接诊断间接诊断临床遗传学vv直接诊断直接诊断遗传病诊断举例遗传病诊断举例OO镰状细胞贫血镰状细胞贫血镰状细胞贫血镰状细胞贫血(HbS):code 57(HbS):code 57MstMst:CCTNAGGCCTNAGG A A:CCTG:CCTGA AGGAGGGAG S S:CCTG:CCTGT TGGAGGGAG 1.2 kb 1.2 kb 0.2kb 0.2kb AA A A AA S S S S S S1.40 kb1.40 kb1.20 kb1.20 kb0.20 kb0.20 kb临床遗传学vv直接诊断直接诊断遗传病

41、诊断举例遗传病诊断举例OOASOASO探针斑点杂交探针斑点杂交探针斑点杂交探针斑点杂交PKU,ARPKU,AR正常探针正常探针正常探针正常探针突变探针突变探针突变探针突变探针临床遗传学vv间接诊断间接诊断遗传病诊断举例遗传病诊断举例OOSouthern blot-RFLPSouthern blot-RFLP20.0 Kb 5.0 Kb甲型血友病甲型血友病(Bgl)，XR1 21 2 3 4 5临床遗传学第二节第二节 遗传病的治疗遗传病的治疗临床遗传学临床遗传学随随着着医医学学遗遗传传学学的的迅迅速速发发展展，人人们们对对遗遗传传病病的的发发病病机机理理认认识识逐逐渐渐深深入入，重重组组DNA技

42、技术术在在医医学学中中广广泛泛应应用用，使使遗遗传传病病的的治治疗疗有有了了长长足足的的进进步步，逐逐渐渐从从传传统统的的手手术术治治疗疗、药药物物疗疗法法、饮饮食食治治疗疗等等步步入入了了基基因因治治疗疗，技技术术方方法法的的日日益益成成熟熟，为为根根治治遗遗传传病开辟了广阔前景。病开辟了广阔前景。临床遗传学手术治疗手术治疗某某种种遗遗传传病病发发展展到到各各种种临临床床症症状状都都已已显显现现，尤尤其其是是器器官官组组织织出出现现损损伤伤时时，手手术术治治疗疗可可以以有有效地改善某些遗传病的症状，减轻病痛。效地改善某些遗传病的症状，减轻病痛。临床遗传学手术治疗手术治疗对对某某些些受受损损器

43、器官官的的修修补补与与切切除除，矫矫正正畸畸形形，例例如如，唇唇裂裂和和(或或)腭腭裂裂的的修修补补；多多指指(趾趾)症症的的切除；先天性心脏病的手术矫正等，改善症状。切除；先天性心脏病的手术矫正等，改善症状。vv手术矫正手术矫正临床遗传学手术治疗手术治疗免免疫疫学学知知识识和和技技术术的的发发展展，免免疫疫排排斥斥问问题题得得到到控控制制，应应用用组组织织器器官官移移植植技技术术缓缓解解和和治治疗疗遗传病得以开展。遗传病得以开展。vv器官和组织移植器官和组织移植O肾移植肾移植O肝移植肝移植O骨髓移植骨髓移植临床遗传学药物及饮食治疗药物及饮食治疗饮饮食食治治疗疗遗遗传传病病的的原原则则是是禁禁

44、其其所所忌忌。由由于于酶酶缺缺乏乏不不能能对对底底物物进进行行正正常常代代谢谢的的患患者者，可可以以控控制制底底物物或或前前体体物物质质的的摄摄入入量量，降降低低代代谢谢底底物物的堆积，以达到治疗的目的。的堆积，以达到治疗的目的。vv禁其所忌禁其所忌O产前治疗产前治疗O现症病人治疗现症病人治疗临床遗传学药物及饮食治疗药物及饮食治疗由由于于酶酶促促反反应应障障碍碍，体体内内贮贮积积过过多多“毒毒物物”，此此时时可可使使用用各各种种理理化化方方法法将将过过多多的的“毒毒物物”排除或抑制其生成，改善患者症状。排除或抑制其生成，改善患者症状。vv去其所余去其所余O应用螯合剂应用螯合剂O应用促排泄剂应用

45、促排泄剂O应用代谢抑制剂应用代谢抑制剂O血浆置换和血浆过滤血浆置换和血浆过滤O平衡清除法平衡清除法临床遗传学药物及饮食治疗药物及饮食治疗先先天天代代谢谢病病往往往往是是由由于于基基因因突突变变所所致致的的酶酶缺缺失失或或活活性性下下降降或或蛋蛋白白质质缺缺乏乏，可可用用诱诱导导和和补补充方法治疗。充方法治疗。vv补其所缺补其所缺O酶诱导治疗酶诱导治疗O蛋白酶补充疗法蛋白酶补充疗法临床遗传学基因治疗基因治疗基基因因治治疗疗(gene therapy)是是指指将将外外源源正正常常基基因因导导入入靶靶细细胞胞，以以纠纠正正或或补补偿偿因因基基因因缺缺陷陷和和异异常常引引起起的的疾疾病病，以以达达到到

46、治治疗疗的的目的。目的。临床遗传学基因治疗基因治疗vv基因治疗的原理与策略基因治疗的原理与策略O生殖细胞基因治疗生殖细胞基因治疗O体细胞基因治疗体细胞基因治疗临床遗传学基因治疗基因治疗vv基因治疗的方法与应用基因治疗的方法与应用O目的基因的转移目的基因的转移z基因的分离与克隆基因的分离与克隆z外源基因的转移外源基因的转移临床遗传学vv基因转移方法基因转移方法O化学法化学法基因治疗基因治疗临床遗传学O物理法物理法z电穿孔法电穿孔法z显微注射法显微注射法z脂质体法脂质体法vv基因转移方法基因转移方法基因治疗基因治疗临床遗传学O同源重组法同源重组法(homologous recombination)

47、是是将将外外源源基基因因定定位位导导入入受受体体细细胞胞的的染染色色体体上上，在在该该座座位位因因有有同同源源序序列列，通通过过单单交交换换或或双双交交换换，外外源源基基因因片片段段替替换换有有缺缺陷陷的的片片段段，达达到到修正缺陷的目的。修正缺陷的目的。vv基因转移方法基因转移方法基因治疗基因治疗临床遗传学O病毒介导基因转移病毒介导基因转移(viral mediated gene transfer)以以病病毒毒为为目目的的基基因因载载体体(vector)，将将外外源源目目的的基基因因通通过过基基因因重重组组技技术术组组装装于于病病毒毒载载体体(viral vector)上上，再再去去感感染染

48、宿宿主主细细胞胞。目目前前常常用用的的病病毒毒有有逆逆转转录录病病毒毒、牛牛乳乳头头瘤瘤病病毒毒、腺腺病病毒、巨细胞病毒等。毒、巨细胞病毒等。vv基因转移方法基因转移方法基因治疗基因治疗临床遗传学逆逆转转录录病病毒毒是是RNA病病毒毒，但但有有逆逆转转录录酶酶，可可使使RNA逆逆转转录录为为DNA，再再整整合合到到宿宿主主细细胞胞基基因组。因组。vv逆转录病毒载体逆转录病毒载体病毒载体病毒载体临床遗传学O优点优点vv逆转录病毒载体逆转录病毒载体病毒载体病毒载体z高高效效感感染染宿宿主主细细胞胞，近近100%的的受受体体细细胞胞被被感染，转化细胞效率高感染，转化细胞效率高z它它能能感感染染广广谱

49、谱动动物物物物种种和和细细胞胞类类型型而而无无严严格的宿主特异性格的宿主特异性z随随机机整整合合的的病病毒毒可可长长期期存存留留，一一般般无无害害于于细胞细胞临床遗传学O缺点缺点vv逆转录病毒载体逆转录病毒载体病毒载体病毒载体z病毒分子量小，最大插入片段在病毒分子量小，最大插入片段在7kb左右左右z随机插入靶细胞基因组中随机插入靶细胞基因组中z只只能能把把DNA整整合合到到分分裂裂旺旺盛盛的的细细胞胞基基因因组中组中z具有致癌作用，可使受体细胞癌变具有致癌作用，可使受体细胞癌变临床遗传学一一般般认认为为这这类类病病毒毒难难于于改改造造成成缺缺陷陷型型病病毒毒，使使用用意意义义不不大大，但但牛牛

50、乳乳头头瘤瘤病病毒毒重重组组后后，可可在在宿宿主主染染色色体体外外独独立立复复制制，不不会会因因插插入入宿宿主主染染色色体体而而引起插入突变，并表达出基因产物。引起插入突变，并表达出基因产物。vvDNA病毒载体病毒载体病毒载体病毒载体临床遗传学O优点优点vvDNA病毒载体病毒载体病毒载体病毒载体z该该病病毒毒可可感感染染分分裂裂和和非非分分裂裂的的细细胞胞，并并能能得到大量基因产物得到大量基因产物z病病毒毒颗颗粒粒相相对对稳稳定定，并并易易于于纯纯化化和和浓浓缩缩，且感染力不降低且感染力不降低z可可有有效效转转导导多多种种靶靶细细胞胞后后而而游游离离于于细细胞胞基基因组外，并持续表达因组外，并