生物 第五章 DNA和蛋白质技术 5.1 DNA的粗提取与鉴定 新人教版选修1.ppt

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1、5.1 DNA5.1 DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定一、基础知识一、基础知识（一）提取（一）提取DNADNA的方法的方法1.1.提取生物大分子的基本思路提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法，分离具有选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子不同物理或化学性质的生物大分子2.2.提取提取DNADNA的基本思路的基本思路提取提取DNA，去除其他成分，去除其他成分利用利用DNA与与RNA、蛋白质蛋白质和和脂质脂质等等在物理和化学性质方面的差异在物理和化学性质方面的差异 DNA DNA的溶解性的溶解性DNADNA和蛋白质等成分和蛋白质等成分在不同浓度的在不同浓度

2、的NaClNaCl溶液溶液中溶解度不同中溶解度不同利用这一特点，利用这一特点，选择适当的盐浓度选择适当的盐浓度就能使就能使DNA充分溶解，充分溶解，而使杂质沉淀；而使杂质沉淀；或者让其他成分溶解，或者让其他成分溶解，DNA析出析出3.DNA3.DNA等大分子的理化性质等大分子的理化性质 DNA不溶于酒精溶液不溶于酒精溶液 DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性DNADNA不溶于酒精溶液，不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将将DNADNA与蛋白质进一步分离。与蛋白质进一步分离。DNA不溶于酒精溶液不溶于酒精溶液 DNA对酶、高温和洗涤

3、剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶蛋白酶水解蛋白质，水解蛋白质，对对DNADNA没有影响没有影响 高高 温温大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受60608080 而而DNADNA在在8080以上才会变性以上才会变性 洗涤剂洗涤剂溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质 但对但对DNADNA没有影响没有影响试剂：试剂：（二）（二）DNADNA的鉴定的鉴定条件：条件：二苯胺二苯胺沸水浴条件下，沸水浴条件下，DNADNA遇二苯胺被染成遇二苯胺被染成蓝色蓝色沸水浴沸水浴现象：现象：（一）（一）实验材料的选取实验材料的选取（二）（二）破碎细胞，获取含破碎细胞，获取含DNAD

4、NA的滤液的滤液（三）（三）除去滤液中的杂质除去滤液中的杂质(纯化纯化)（四）（四）DNADNA的析出与鉴定的析出与鉴定二、实验设计二、实验设计（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取从下列材料中选取从下列材料中选取2 23 3种种原则：原则：菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌在液体培养基中培养的大肠杆菌在液

5、体培养基中培养的大肠杆菌在液体培养基中培养的大肠杆菌凡是含有凡是含有DNADNA的生物材料都可以考虑的生物材料都可以考虑选用选用DNADNA含量相对较高的组织含量相对较高的组织 从核从核DNA数目来看，猪数目来看，猪38条，鸡条，鸡78条，哺条，哺乳动物血乳动物血0条，猕猴桃条，猕猴桃58条，洋葱条，洋葱16条，豌条，豌豆豆14条，菠菜条，菠菜12条，大肠杆菌条，大肠杆菌1条。请选择条。请选择动植物材料各一种。动植物材料各一种。哺乳动物的血细胞无细胞核及细胞器。哺乳动物的血细胞无细胞核及细胞器。液体培养基中的大肠杆菌的液体培养基中的大肠杆菌的DNA量减少。量减少。鱼卵是减数分裂的产物。鱼卵是减

6、数分裂的产物。（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液1 1、动物细胞、动物细胞2 2、植物细胞、植物细胞容易破碎容易破碎需要溶解细胞膜需要溶解细胞膜鸡血细胞溶液：鸡血细胞溶液：鸡血细胞溶液：鸡血细胞溶液：加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液过滤后收集滤液过滤后收集滤液过滤后收集滤液想一想：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？想一想：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体

7、，蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂；水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂；水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂；水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂；加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出从而释放出从而释放出从而释放出DNADNADNADNA 加入一定的洗涤剂和食盐加入一定的洗涤剂和食盐 充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液想一想：洗涤剂和食盐的作用分别

8、是什么？想一想：洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂洗涤剂洗涤剂洗涤剂离子去污剂，能溶解细胞膜，利于离子去污剂，能溶解细胞膜，利于离子去污剂，能溶解细胞膜，利于离子去污剂，能溶解细胞膜，利于DNADNADNADNA释放释放释放释放食食食食 盐盐盐盐NaClNaClNaClNaCl，利于，利于，利于，利于DNADNADNADNA的溶解于研磨液中的溶解于研磨液中的溶解于研磨液中的溶解于研磨液中经研磨可破碎细胞壁，使细胞核内的经研磨可破碎细胞壁，使细胞核内的经研磨可破碎细胞壁，使细胞核内的经研磨可破碎细胞壁，使细胞核内的DNADNADNADNA释放。若研磨不释放。若研磨不释放。若研磨不释放。若研磨不

9、充分，会使提取的充分，会使提取的充分，会使提取的充分，会使提取的DNADNADNADNA量变少，导致看不到丝状沉淀物、量变少，导致看不到丝状沉淀物、量变少，导致看不到丝状沉淀物、量变少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。用二苯胺鉴定不显示蓝色等。用二苯胺鉴定不显示蓝色等。用二苯胺鉴定不显示蓝色等。为了纯化提取的为了纯化提取的DNADNA需要将滤液作进一步处理需要将滤液作进一步处理讨论：滤液讨论：滤液/研磨液中可能含有哪些成分？研磨液中可能含有哪些成分？答：可能含有核蛋白、多糖和答：可能含有核蛋白、多糖和答：可能含有核蛋白、多糖和答：可能含有核蛋白、多糖和RNARNARNARNA等

10、杂质等杂质等杂质等杂质想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分，想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？会对实验结果产生怎样的影响？1.DNA1.DNA的溶解性的溶解性的溶解性的溶解性2.DNA2.DNA对对对对酶酶酶酶、高温高温高温高温和和和和洗涤剂洗涤剂洗涤剂洗涤剂的耐受性的耐受性的耐受性的耐受性（三）除去滤液中的杂质（三）除去滤液中的杂质讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋

11、白，使提取的DNADNADNADNA 与蛋白质分开；与蛋白质分开；与蛋白质分开；与蛋白质分开；方案三：利用方案三：利用方案三：利用方案三：利用DNADNADNADNA和蛋白质对高温耐受性的不同，和蛋白质对高温耐受性的不同，和蛋白质对高温耐受性的不同，和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性，与使蛋白质变性，与使蛋白质变性，与使蛋白质变性，与DNADNADNADNA分离分离分离分离（四）（四）DNADNA的析出与鉴定的析出与鉴定与滤液与滤液与滤液与滤液体积相等体积相等体积相等体积相等的的的的冷却冷却冷却冷却的的的的酒精溶液酒精溶液酒精溶液酒精溶液(体积分数体积分数体积分数体积分数95959595

12、)，静置静置静置静置2 2 2 23min3min3min3min，溶液中会出现白色丝状物，溶液中会出现白色丝状物，溶液中会出现白色丝状物，溶液中会出现白色丝状物 粗提取粗提取粗提取粗提取DNADNADNADNA用玻璃棒沿一个方向搅拌，用玻璃棒沿一个方向搅拌，用玻璃棒沿一个方向搅拌，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水1 1、DNADNA的析出的析出的析出的析出2.DNA2.DNA的鉴定的鉴定的鉴定的鉴定 向两支试管中分别加入向两支试管中分别加入向两支试管中分别加入向两支试管中分

13、别加入 2mol/L 2mol/L 2mol/L 2mol/L NaClNaClNaClNaCl 溶液溶液溶液溶液5ml5ml5ml5ml 其中一支试管中加入其中一支试管中加入其中一支试管中加入其中一支试管中加入DNADNADNADNA丝状物丝状物丝状物丝状物 各加入各加入各加入各加入二苯胺二苯胺二苯胺二苯胺试剂试剂试剂试剂4ml4ml4ml4ml 混匀后，置于沸水浴中加热混匀后，置于沸水浴中加热混匀后，置于沸水浴中加热混匀后，置于沸水浴中加热5min5min5min5min 待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化待冷

14、却后，比较两只试管中溶液的颜色变化 观察现象：观察现象：观察现象：观察现象：溶解丝状物的溶液变为溶解丝状物的溶液变为蓝色蓝色方法步骤方法步骤 加入物质加入物质 目的目的 1 1.制备鸡血细胞液制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液柠檬酸钠溶液 2 2.提取鸡血细胞细胞核物质提取鸡血细胞细胞核物质 20 m120 m1蒸馏水蒸馏水 3 3.溶解细胞核内的溶解细胞核内的DNADNA 2 m12 m1L L 的的NaCINaCI溶液溶液4040mLmL 4 4.析出含析出含DNADNA的黏稠物的黏稠物 蒸馏水蒸馏水 5 5.滤取含滤取含DNADNA的黏稠物的黏稠物 6 6.将将DNADNA的黏稠物再溶解的黏稠

15、物再溶解 2 mol2 molL L 的的NaClNaCl溶液溶液20 20 mLmL 7 7.过滤含过滤含DNADNA的的NaCNaCl l 溶液溶液 8 8.提取含有杂质较少的提取含有杂质较少的 DNADNA 冷却的冷却的9595的酒精的酒精50 50 mLmL A A:(1)1)向试管中加入向试管中加入0 0.015 mol015 molL L 的的NaClNaCl溶液溶液5 5mLmL(2)2)加入加入DNADNA(3)43)4 mLmL二苯胺试剂二苯胺试剂 9 9.DNADNA的鉴定的鉴定 B B:(1)(1)向试管中加入向试管中加入0 0.015mol015molL L 的的NaC

16、lNaCl溶液溶液5 5mLmL(2)4 m2)4 mL 二苯胺试剂二苯胺试剂 加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加速血细胞破裂加速血细胞破裂 溶解溶解DNA 使使2mol/L的的NaCl溶液稀释至溶液稀释至0.14mol/L使得使得DNA最大限度地释出最大限度地释出 使含使含DNA的黏稠物被留在纱布上的黏稠物被留在纱布上使含使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中除去含除去含DNA的滤液中的杂质的滤液中的杂质提取提取DNA A出现蓝色出现蓝色 B无变化无变化观察你提取的观察你提取的DNADNA颜色，颜色，如果不是白色丝状物，如果

17、不是白色丝状物，说明说明DNADNA中的杂质较多；中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，如果不呈现蓝色，可能所提取的可能所提取的DNADNA含量低，含量低，或是实验操作中出现错误，或是实验操作中出现错误，需要重新制备需要重新制备四、课题成果评价四、课题成果评价（一）是否提取出了（一）是否提取出了DNADNA练习练习1、请解释提取、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。的实验操作中主要的步骤的目的。答：提取答：提取DNA的的第一步是材料的选取第一步是材料的选取，其目的是，其目的是一定要选取一定要选取DNA含量较高的生物材料，

18、否则会由于含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第第二步是二步是DNA的释放和溶解的释放和溶解，这一步是实验成功与否，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；全部溶解；第三第三步是步是DNA的纯化的纯化，即根据，即根据DNA的溶解特性、对酶的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；与杂质分开；最后一步是对最后一步是对DNA进行鉴定进行鉴定，这是对，这是对整个实验的结果的检测。整个实验的结果的检测。2、

19、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取提取DNA一样容易吗？一样容易吗？答：答：提取蛋白质比提取提取蛋白质比提取DNA的难度大的难度大。这是因为，。这是因为，与与DNA相比，相比，蛋白质对温度、盐浓度、蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件等条件要敏感得多，很容易失活要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取提取没有一种统一的方法没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。的特性摸索提取的条件，设计特定

20、的方法。2.实验中实验中NaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为2 molL和和0.14 molL对对DNA有何影响有何影响?1.在在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是中加入蒸馏水的作用是()。A.稀释血液、冲洗样品稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低使血细胞破裂、降低NaCl浓度使浓度使DNA析出析出C.使血细胞破裂、增大使血细胞破裂、增大DNA溶解量溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA答：答：B答：前者是溶解答：前者是溶解DNA，后者是使，后者是使DNA析出析出3.DNA3.DNA遇二苯胺遇二苯胺(沸水浴沸水浴)会染成会染成()()A.A.砖红色砖红色 B.B.橘黄色橘黄色 C.C.紫色紫色 D.D.蓝色蓝色4.提取鸡血中的提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液时，为什么要除去血液中的上清液中的上清液?答：答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以，所以要除去上清液要除去上清液(含有蛋白质含有蛋白质)。答：答：D