分子生物学5分子生物学基本的研究法 PPT课件.ppt

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1、第第 五五 章章 分子生物学基本研究法分子生物学基本研究法（上）（上）DNADNA、RNARNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术扉页：扉页：当你进入实验室时，要像脱去外衣那样当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的可能展开想象的“翅膀翅膀”，否则，你就不可，否则，你就不可能走在别人的前面。能走在别人的前面。基基因因操操作作主主要要包包括括DNADNA分分子子的的

2、切切割割与与连连接接、细细胞胞转转化化、核核酸酸序序列列分分析析以以及及基基因因人人工工合合成成、表表达达、定定点突变和点突变和PCRPCR扩增扩增等，是分子生物学研究的核心技术。等，是分子生物学研究的核心技术。基基因因工工程程是是指指在在体体外外将将核核酸酸分分子子插插入入病病毒毒、质质粒粒或或其其它它载载体体分分子子，构构成成遗遗传传物物质质的的新新组组合合，使使之之进进入入原原先先没没有有这这类类分分子子的的寄寄主主细细胞胞内内并并进进行行持持续续稳稳定的繁殖和表达定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强强调了外源核酸分子

3、在另一种不同的寄主细胞中的繁衍调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它生命科学技术的根本特征。区别于其它生命科学技术的根本特征。重组重组DNADNA技术发展史上的三大里程碑：技术发展史上的三大里程碑：一、一、2020世纪世纪4040年代确定了遗传信息的携带者、年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是即基因的分子载体是DNADNA而不是蛋白质，解决而不是蛋白质，解决了遗传

4、的物质基础问题。了遗传的物质基础问题。二、二、5050年代提出了年代提出了DNADNA分子的双螺旋结构模型和分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代解决了基因的自我复制和世代交替问题。交替问题。Generalized model of semiconservative replication of DNA.New synthesis is shown in blue.三三、5050年年代代末末至至6060年年代代，相相继继提提出出了了“中中心心法法则则”和和操操纵纵子子学学说说,成成功功地地破破译译了了遗遗传传密密码码，阐阐明了遗传信息的流动与表达机制。明

5、了遗传信息的流动与表达机制。CrickCrick于于19541954年所提出的遗传信息传递规律（即年所提出的遗传信息传递规律（即中心法则）。中心法则）。中心法则的演变中心法则的演变1954年首次年首次提出的提出的“中心法则中心法则”1970-1980年年的的“中心法则中心法则”21世纪后修正世纪后修正的的“中心法则中心法则”上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源自工具酶的发现。自工具酶的发现。5.1 5.1 基因操作的基本工具基因操作的基本工具（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶能能够够识识别别DNADNA上上的的特特定定碱碱基基序

6、序列列并并从从这这个个位位点点切切开开DNADNA分子。分子。第第一一个个核核酸酸内内切切酶酶EcoRIEcoRI是是BoyerBoyer实实验验室室在在19721972年年发发现现的的，它它能能特特异异性性识识别别GAATTCGAATTC序序列列，将将双双链链DNADNA分分子子在在这这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。图图5-1 几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及内切酶所识别的序列及其酶切末端其酶切末端。Werner Arber,Hamilton Smith and Daniel Nathans were awarded the 1978

7、Nobel Prize for their work on REs.图图5-2 DNA连接酶能把不同的连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体片段连接成一个整体 RE RE 切割随机切割随机DNADNA分子（假定分子（假定4 4种碱基在种碱基在DNADNA中中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照按照4 4n n 来计算，如一个来计算，如一个6 6碱基切割酶平均每碱基切割酶平均每4096 bp4096 bp核核DNADNA有一个酶切位点（有一个酶切位点（4 46 6），而一个），而一个4 4碱基切割酶平均每碱基切割酶平均每256 bp256 bp核核D

8、NADNA就有一个酶就有一个酶切位点（切位点（4 44 4）。）。重组重组DNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶酶酶 类类功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通通过过磷磷酸酸二二酯酯键键把把两两个个或或多多个个DNADNA片片段段连连接接成一个成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大肠杆菌）（大肠杆菌）按按55到到33方方向向加加入入新新的的核核苷苷酸酸，补补平平DNADNA双双链中的缺口链中的缺口反转录酶反转录酶按按照照RNARNA分分子子中中的的碱碱基基序序列列，根根据据碱碱基

9、基互互补补原则合成原则合成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把把磷磷酸酸基基团团加加到到多多聚聚核核苷苷酸酸链链的的5-OH5-OH末末端端（进行末端标记实验或用来进行（进行末端标记实验或用来进行DNADNA的连接的连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的33末端加上多聚或单核苷酸末端加上多聚或单核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII从从DNADNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA链末端的磷酸基团链末端

10、的磷酸基团嘌呤嘌呤腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤嘧啶嘧啶胞嘧啶胞嘧啶尿嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶组成组成DNA和和RNA分子的五种含氮碱基的结构式分子的五种含氮碱基的结构式多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程单核苷酸5-磷酸基团向核酸链的3-OH发起进攻（二）基因克隆的载体（二）基因克隆的载体 载体三要素：载体三要素：自我复制能力自我复制能力携带外源基因片段大小携带外源基因片段大小插入位点多少插入位点多少易于鉴定识别程度易于鉴定识别程度大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体:1 1、pSC101pSC101质粒载体质粒载体长长9.09kb9.09kb，带带有有四四环

11、环素素抗抗性性基基因因（tettetr r）及及EcoRIEcoRI、HindIIIHindIII、BamHIBamHI、SalISalI、XhoIXhoI、PvuIIPvuII以以及及SmaISmaI等等7 7种种限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶的的单单酶酶切切位位点点，在在HindIIIHindIII、BamHIBamHI和和SalISalI等等3 3个个位点插入外源基因，会导致位点插入外源基因，会导致tettetr r失活。失活。大大 肠肠 杆杆 菌菌pSC101质质粒粒 载载 体体 示示意图。意图。是是第第一一个个基基因因克克隆隆载载体体。缺缺点点：它它是是一一种种严严紧紧型型复复制制

12、控控制制的的低低拷拷贝贝质质粒粒，平平均均每每个个寄寄主主细细胞胞仅仅有有1212个个拷拷贝贝，从从带带有有该该质质粒粒的的寄寄主主细细胞胞中中提提取取pSC101 DNApSC101 DNA，产量很低。，产量很低。2 2、ColE1ColE1质粒载体质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。松弛型复制控制的多拷贝质粒。一一般般情情况况下下，当当培培养养基基中中氨氨基基酸酸被被耗耗尽尽，或或是是在在细细胞胞培培养养物物中中加加入入氯氯霉霉素素以以抑抑制制蛋蛋白白质质的的合合成成，寄寄主主染染色色体体DNADNA的的复复制制便便被被抑抑制制，细细胞胞的的生生长长也也随随之之停止。停止。松松弛弛型型质质

13、粒粒DNADNA却却继继续续复复制制数数小小时时，使使每每个个寄寄主主细细胞胞中中ColE1ColE1质质粒粒的的拷拷贝贝数数达达到到1000300010003000个个，占占细细胞胞总总DNADNA的的50%50%左右。左右。3 3、pBR322pBR322质粒载体质粒载体由三个不同来源的部分组成的：由三个不同来源的部分组成的：第第一一部部分分来来源源于于pSF2124pSF2124质质粒粒易易位位子子Tn3Tn3的的氨氨苄苄青霉素抗性基因（青霉素抗性基因（AmpAmpR R）；）；第第二二部部分分来来源源于于pSC101pSC101质质粒粒的的四四环环素素抗抗性性基基因因（tettetr

14、r）；）；第第三三部部分分则则来来源源于于ColE1ColE1的的派派生生质质粒粒pMB1pMB1的的DNADNA复制起点（复制起点（oriori）。）。优优点点是是具具有有较较小小的的分分子子量量(4363bp)(4363bp)，易易于于纯纯化化。即即使使携携带带了了6-8kb6-8kb的的外外源源DNADNA片片段段，操操作作仍仍较较便便利。利。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有有较较高高的的拷拷贝贝数数，经经过过氯氯霉霉素素扩扩增增，每每个个细细胞胞可累积可累积1000300010003000个拷贝，便于制备重组体个拷贝，便于制备重组体

15、DNADNA。4 4、pUCpUC质粒载体（包括四个部分）：质粒载体（包括四个部分）：来自来自pBR322pBR322质粒的复制起点（质粒的复制起点（oriori）氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（ampampr r）大大肠肠杆杆菌菌-半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因（lacZlacZ）启启动动子子及及编码编码-肽链的肽链的DNADNA序列。特称为序列。特称为lacZlacZ基因基因位位 于于 lacZlacZ基基 因因 5-5-端端 的的 一一 段段 多多 克克 隆隆 位位 点点（MCSMCS），外源基因插入破坏），外源基因插入破坏lacZ lacZ 基因功能基因功能LacZLacZ编码编

16、码-半乳糖苷酶氨基端半乳糖苷酶氨基端146146个氨基酸的个氨基酸的-肽，肽，IPTGIPTG（异丙基（异丙基-D-D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，所合成的达，所合成的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-肽与宿主细胞编码的肽与宿主细胞编码的缺陷型缺陷型-半乳糖苷酶互补，产生有活性的半乳糖苷酶互补，产生有活性的-半乳糖半乳糖苷酶，水解培养基中的苷酶，水解培养基中的X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。含含X-galX-gal培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组培养基中非转化菌落呈蓝

17、色，含有重组DNADNA分分子的菌落为白色。子的菌落为白色。优点：优点：更更小小的的分分子子量量和和更更高高的的拷拷贝贝数数。在在pBR322pBR322基基础础上上构构建建pUCpUC质质粒粒载载体体时时，仅仅保保留留下下其其中中的的氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因及及复复制制起起点点，其其分分子子小小了了许许多多，pUC8pUC8为为2750bp2750bp，pUC18pUC18为为2686bp2686bp。由由于于缺缺失失roprop基基因因，pUCpUC质质粒粒不不经经氯氯霉霉素素扩扩增增时时，平平均均每每个个细细胞胞即即可可达达500700500700个拷贝。个拷贝。ColE1质

18、粒质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系复制起始部位调控因子之间关系前体前体RNA(RNAII)RNA(RNAII)的转录起始于复制起点上游，需经的转录起始于复制起点上游，需经RNaseHRNaseH加工后产生有加工后产生有555555个核苷酸的引物，起始个核苷酸的引物，起始DNADNA合合成。成。RNA 1RNA 1在在RNA 2RNA 2的的55末端，转录方向相反，因此能通过末端，转录方向相反，因此能通过氢键配对与后者相互作用，阻止氢键配对与后者相互作用，阻止RNaseHRNaseH加工加工RNA 2RNA 2，使，使其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起始。其不能转化为有活性的引物，阻碍复

19、制起始。没有没有RopRop蛋白，蛋白，RNA 1RNA 1基因就不能起始转录。基因就不能起始转录。pUCpUC质质粒粒结结构构中中具具有有来来自自大大肠肠杆杆菌菌laclac操操纵纵子子的的lacZlacZ基基因因，所所编编码码的的-肽肽链链可可参参与与-互互补补作作用用。因因此此，可可用用X-galX-gal显显色色法法实实现现对对重重组组体体转转化子的鉴定。化子的鉴定。具具有有多多克克隆隆位位点点MCSMCS区区段段，可可以以把把具具两两种种不不同同粘粘性性末末端端（如如EcoRIEcoRI和和BamHIBamHI）的的外外源源DNADNA片片段段直直接接克隆到克隆到pUC8pUC8质粒

20、载体上。质粒载体上。5 5、pGEM-3Z pGEM-3Z质粒质粒 长长度度为为2743bp2743bp，编编码码有有一一个个氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基因和一个基因和一个lacZlacZ基因。基因。含含有有两两个个噬噬菌菌体体启启动动子子(T7(T7和和SP6)SP6)，为为RNARNA聚聚合合酶酶的的附附着着提提供供了了特特异异性性识识别别位位点点。加加入入T7T7或或SP6 SP6 RNARNA聚聚合合酶酶，所所克克隆隆的的外外源源基基因因便便会会转转录录出出相应的相应的mRNAmRNA。6 6、穿穿 梭梭 质质 粒粒 载载 体体（shuttle shuttle plasmid pla

21、smid vectorvector）由由人人工工构构建建的的具具有有两两种种不不同同复复制制起起点点和和选选择择记记号号，可可在在两两种种不不同同的的寄寄主主细细胞胞中中存存活和复制的质粒载体。活和复制的质粒载体。这这类类质质粒粒载载体体可可保保证证外外源源DNADNA序序列列在在不不同同物物种种(原原核核和和真真核核)的的细细胞胞间间得得到到扩扩增增，用用途广泛。途广泛。7 7、pBluescriptpBluescript噬菌粒载体噬菌粒载体 pBluescriptpBluescript是是一一类类从从pUCpUC载载体体派派生生而而来来的的噬噬菌菌粒粒载载体体，简简称称为为pBSpBS（+

22、/-+/-），如如今今则则更更多多地地叫叫作作pBluescript pBluescript KSKS（+/-+/-）或）或pBluescript SKpBluescript SK（+/-+/-）。）。SKSK表表示示多多克克隆隆位位点点区区的的取取向向，即即lacZlacZ基基因因是是按按照照SacIKpnISacIKpnI的方向转录；的方向转录；（+/+/-）表表示示单单链链噬噬菌菌体体f1f1复复制制起起点点的的两两种种相相反反的的取取向。向。f1f1（+）起起点点表表示示当当pBluescriptpBluescript噬噬菌菌粒粒载载体体和和辅辅助助噬噬菌菌体体共共感感染染寄寄主主细细

23、胞胞时时，能能够够回回收收到到lacZlacZ基基因因的的有有意意义义链链DNADNA；而而f1f1（-）起起点点则则表表示示当当pBluesriptpBluesript噬噬菌菌粒粒载载体体与与辅辅助助噬噬菌菌体体共共感感染染寄寄主主细细胞胞时时，可可回回收收到到lacZlacZ基因的无意义链基因的无意义链DNADNA。(i)(i)在在多多克克隆隆位位点点区区（MCSMCS）的的两两侧侧，存存在在一一对对T3T3和和T7T7噬噬菌菌体体的的启启动动子子，用用以以定定向向指指导导插插入入在在多多克克隆隆位位点点上的外源基因的转录活动；上的外源基因的转录活动；(ii)(ii)具具有有单单链链噬噬菌

24、菌体体M13M13或或f1f1的的复复制制起起点点和和一一个个来来自自ColE1ColE1质质粒粒的的复复制制起起点点，保保证证pBluescriptpBluescript噬噬菌菌粒粒载载体体在在有有或或无无辅辅助助噬噬菌菌体体共共感感染染的的不不同同情情况况下下，按按照照不同的复制形式分别合成出单链或双链不同的复制形式分别合成出单链或双链DNADNA；(iii(iii）编编码码有有一一个个氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因，作为转化子克隆的选择标记；作为转化子克隆的选择标记；(iv)(iv)含含有有一一个个lacZlacZ基基因因，可可以以按按照照X-gal-X-gal-IPTGIPTG组

25、组织织化化学学显显色色法法筛筛选选噬噬菌菌粒粒载载体体的的重重组子。组子。仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNADNA连连接酶进行接酶进行DNADNA的切割和重组，还不能满足基因的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的制能力的DNADNA分子上，才能在寄主细胞中进行分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。繁殖。具备自主复制能力的具备自主复制能力的DNADNA分子就是分子分子就是分子克隆的载体（克隆的载体（vectorvector）。病毒、噬菌体）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基

26、和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。因导入的载体。获获得得了了用用外外源源DNADNA片片段段和和载载体体分分子子重重组组而而成成的的杂杂种种DNADNA分分子子后后，还还必必须须通通过过一一个个被被称称为为细细菌菌转转化化的的过过程程将将其其重重新新导导入入到到寄寄主主细细胞胞中中，才才能保证重组能保证重组DNADNA分子的增殖（图分子的增殖（图5-35-3）。）。5.2 DNA5.2 DNA操作技术操作技术5.2.15.2.1核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳自自 从从 琼琼 脂脂 糖糖（agaroseagarose）和和 聚聚 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺（polyacrylamidep

27、olyacrylamide）凝凝胶胶被被引引入入核核酸酸研研究究以以来来，按按分分子子量量大大小小分分离离DNADNA的的凝凝胶胶电电泳泳技技术术，已已经经发发展展成成为为一一种种分分析析鉴鉴定定重重组组DNADNA分分子子及及蛋蛋白白质质与与核核酸酸相相互互作作用用的的重要实验手段。重要实验手段。一一种种分分子子被被放放置置到到电电场场中中，它它就就会会以以一一定定的的速速度度移移向向适适当当的的电电极极。我我们们把把这这种种电电泳泳分分子子在在电电场场作作用用下下的的迁迁移移速速度度，叫叫做做电电泳泳的的迁迁移移率率，它它与与电电场场强强度度和和电电泳泳分分子子本本身身所所携携带带的的净净

28、电电荷荷数数成正比，与片段大小成反比。成正比，与片段大小成反比。生生理理条条件件下下，核核酸酸分分子子中中的的磷磷酸酸基基团团呈呈离离子子化化状状态态，所所 以以，DNADNA和和 RNARNA又又 被被 称称 为为 多多 聚聚 阴阴 离离 子子（polyanionspolyanions），在电场中向正电极的方向迁移。），在电场中向正电极的方向迁移。由由于于糖糖-磷磷酸酸骨骨架架在在结结构构上上的的重重复复性性质质，相相同同数数量量的的双双链链DNADNA几几乎乎具具有有等等量量的的净净电电荷荷，因因此此它它们们能能以以同同样样的速度向正电极方向迁移。的速度向正电极方向迁移。琼脂糖凝胶分辨琼脂

29、糖凝胶分辨DNADNA片段的范围为片段的范围为0.2-50kb0.2-50kb之间。之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1 1到到10001000个碱基对之间。个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。孔隙越小，其分辨能力就越强。表表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片片段的能力段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 0

30、00 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501图图5-4 5-4 溴溴化化乙乙锭锭染染料料的的化化学学结结构构及及其其对对DNADNA分分子子的的插插入入作作用用。由由于于插插入入了了溴溴化化乙乙锭锭分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中DNADNA的的条条带带便便呈呈现现出出橘橘黄黄色荧光，易于鉴定。色荧光，易于鉴定。图图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图脉冲电场凝胶电泳示意图 5.2.2 5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目

31、标DNADNA分子的增殖分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNADNA分子分子导入宿主细胞中。外源导入宿主细胞中。外源DNADNA通过自身载体上的复通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。纯化出来。细菌转化（细菌转化（transformationtransformation），是指一种），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNADNA而而导致性状特征发生遗传改变的过程

32、。导致性状特征发生遗传改变的过程。为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取增加其获取DNADNA的能力。经过这种处理的细胞被的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（称作感受态细胞（competent cellscompetent cells）。）。CaClCaCl2 2法法将将快快速速生生长长期期大大肠肠杆杆菌菌置置于于经经00预预处处理理的的低低渗渗CaClCaCl2 2溶溶液液中中，细细胞胞膨膨胀胀，膜膜通通透透性性改改变变，易易与与外外源源DNADNA相相粘附。粘附。将将该该体体系系转转移移到到4242下下做做短短暂暂的的热热刺刺

33、激激，外外源源DNADNA就就可可能能被被细细胞胞吸吸收收。将将经经过过转转化化后后的的细细胞胞置置于于选选择择性性培培养基上，筛选阳性克隆。养基上，筛选阳性克隆。转转化化效效率率可可达达到到5105106 6-210-2107 7个个转转化化子子/g/g超超螺螺旋旋质质粒粒DNADNA。电击法电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的会转变为亲水性孔洞，介质中的DNADNA进入细胞进入细胞质。质。将将生生长长至至对对数数中中期期的的E.E.colic

34、oli菌菌液液冷冷却却至至44后后离离心心，洗洗菌菌后后用用10%10%的的甘甘油油悬悬浮浮，将将高高密密度度菌菌液液（2102101010/ml/ml）置置于于特特制制的的电电极极杯杯中中进进行电击。行电击。获获 得得 最最 大大 转转 化化 效效 率率 时时 场场 强强 一一 般般 为为12.515kV/cm12.515kV/cm，时间跨度一般为，时间跨度一般为4.55.54.55.5毫秒。毫秒。电电击击转转化化与与温温度度有有关关，一一般般在在0404进进行行。由由于于转转化化载载体体上上常常带带有有LacLacZ Z基基因因，多多用用带带有有不不同同抗抗生生素素的的选选择择性性培培养养

35、基基结结合合-互互补补蓝蓝白白斑斑筛选法鉴定转化细胞。筛选法鉴定转化细胞。5.2.35.2.3聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR）技术）技术聚聚合合酶酶链链式式反反应应是是快快速速扩扩增增DNADNA序序列列最最常常用用的的方法。方法。PCRPCR反反应应的的模模板板DNADNA若若是是基基因因组组上上的的某某个个片片段段，就就称称为为genomic genomic PCRPCR，若若是是mRNAmRNA反反转转录录产产生生的的cDNAcDNA，就称为，就称为RT-PCRRT-PCR。图图5-7 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 图图5-8 PCR指指数数扩扩增增时

36、时循循环环次次数数与与DNA产产物物数数量量的的比比较较19891989年年1212月，月，著名的自然科学杂志著名的自然科学杂志“SCIENCE”“SCIENCE”将将PCRPCR和它所使用的聚合酶命名为第一个和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子年度分子”。主编主编Daniel Koshland Jr.Daniel Koshland Jr.写道：第一篇有关写道：第一篇有关PCRPCR的论的论文发表于文发表于19851985年。自那以后，年。自那以后，PCRPCR已经发展成为日益强已经发展成为日益强大的和有广泛用途的技术。大的和有广泛用途的技术。有了有了PCRPCR，极少量遗，极少量遗传物质

37、也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、可传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、可用于生化分析和鉴定的材料。用于生化分析和鉴定的材料。“SCIENCE”“SCIENCE”确实在确实在19851985年发表了第一篇关于年发表了第一篇关于PCRPCR的的论文。但是，却拒绝了由穆利斯撰写的描述论文。但是，却拒绝了由穆利斯撰写的描述PCRPCR技术技术的论文。编辑部给他回了一封标准的拒稿信：的论文。编辑部给他回了一封标准的拒稿信：“这篇文章虽然通过了评审委员会的初选，但不幸这篇文章虽然通过了评审委员会的初选，但不幸的是，专家们对本文的评审结论并没有像对同时期的是，专家们对本文的评审结论并没有像对同

38、时期拟录用的稿件那样积极。所以，尊稿无力竞争本刊拟录用的稿件那样积极。所以，尊稿无力竞争本刊有限的版面。有限的版面。”凯利凯利穆利斯博穆利斯博士，（英文名士，（英文名Kary Banks Mullis，1944年年12月月28日），日），美国生物化学家。美国生物化学家。1993年因发明聚年因发明聚合酶链锁反应合酶链锁反应（PCR），与迈），与迈克尔克尔史密斯分史密斯分享诺贝尔化学奖。享诺贝尔化学奖。同年还获得日本同年还获得日本国际奖。国际奖。凯利凯利穆利斯（穆利斯（Kary MullisKary Mullis），），19441944年出生，年出生，19621962年在佐治亚理工学院化学工程专业

39、毕业年在佐治亚理工学院化学工程专业毕业.受受同学们的蛊惑同学们的蛊惑，19661966年报考加州伯克利大学生化专年报考加州伯克利大学生化专业研究生被录取。业研究生被录取。19681968年一个人在年一个人在NATURENATURE发表发表“时间反演的宇宙学意义时间反演的宇宙学意义”论文并论文并侥幸侥幸通过了博士生资格考试。通过了博士生资格考试。19721972年，以年，以“微生物铁转运因子的结构与有机合成微生物铁转运因子的结构与有机合成”获得博士学位。获得博士学位。毕业后，尝试写小说，但因毕业后，尝试写小说，但因“不能使一部分人物具有不能使一部分人物具有不幸的遭遇不幸的遭遇”而失败，又因而失败

40、，又因厌恶天天宰杀实验小鼠厌恶天天宰杀实验小鼠而而两次丢掉工作。两次丢掉工作。他有一条知名的可能引起不少同学共鸣的学习曲线：他有一条知名的可能引起不少同学共鸣的学习曲线：刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣知知识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失望和不安阶识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失望和不安阶段段辞职辞职以后去一家小咖啡馆当了两年经理。以后去一家小咖啡馆当了两年经理。1979年加入西特年加入西特斯公司，负责斯公司，负责DNA合成。合成。正是费时费力的正是费时费力的DNA合成（单引物，以算术级数增长）合成（单引物，以算术级数增长），激发了他

41、的思维。，激发了他的思维。1983年年8月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关PCR原理原理的学术报告。人们对这个报告的反应冷谈，的学术报告。人们对这个报告的反应冷谈，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯回忆说，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯回忆说，“绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡说八道。说八道。”普遍的观点是，虽然我不够聪明，没看出普遍的观点是，虽然我不够聪明，没看出问题的要害所在，但肯定有理

42、由证明这个方法不行，问题的要害所在，但肯定有理由证明这个方法不行，要不为什么从前没人想到呢？要不为什么从前没人想到呢？PCRPCR技术的原理技术的原理首首先先将将双双链链DNADNA分分子子在在临临近近沸沸点点的的温温度度下下加加热热分分离离成成两两条条单单链链DNADNA分分子子，DNADNA聚聚合合酶酶以以单单链链DNADNA为为模模板板并并利利用用反反应应混混合合物物中中的的四四种种脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸和和实实验验中中提提供供的的引引物物序序列列合合成成新新生生的的DNADNA互补链。互补链。DNADNA解链（变性）解链（变性）引物与模板引物与模板DNADNA相结合（退火）相结合

43、（退火）DNADNA合成（链的延伸）三步。合成（链的延伸）三步。经经不不断断重重复复循循环环之之后后，反反应应混混合合物物中中所所含含有有的的双双链链DNADNA分分子子数数，即即两两条条引引物物结结合合位位点点之之间间的的DNADNA区区段段的的拷拷贝数，理论上的最高值应是贝数，理论上的最高值应是2 2n n,实得实得1.81.8n n.将将含含有有待待扩扩增增DNADNA样样品品的的反反应应混混合合物物放放置置在在高高温温（9494）环环境境下下加加热热1 1分分钟钟，使使双双链链DNADNA变变性性，形成单链模板形成单链模板DNADNA。94加热，淬火加热，淬火降降低低反反应应温温度度（

44、退退火火，约约5050），约约1 1分分钟钟，使使寡寡核核苷苷酸酸引引物物与与两两条条单单链链模模板板DNADNA结合在靶结合在靶DNADNA区段两端的互补序列位置上。区段两端的互补序列位置上。5060，退火，退火引物与模板引物与模板DNA相相结合结合将将反反应应混混合合物物的的温温度度上上升升到到7272左左右右保保温温1-1-数数分分钟钟，在在DNADNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下，从从引引物物的的3-3-端端加加入入脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸，并并沿沿着着模模板板分分子子按按5353方方向向延延伸伸，合合成成新新生生DNADNA互补链。互补链。PCR扩增，扩增，72左右左右,按按每每

45、分钟分钟1000个碱基对设计个碱基对设计循环往复循环往复应用实例：应用实例：实验中通过对拟南芥基因芯片数据分析实验中通过对拟南芥基因芯片数据分析,鉴定鉴定出一个受干旱胁迫诱导的出一个受干旱胁迫诱导的cDNA。干旱、紫外。干旱、紫外线、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理线、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高后表达量均有显著提高,特别是干旱处理特别是干旱处理3h后后表达量极表达量极显著显著提高。提高。多序列比对和系统进化分析发现该基因含多序列比对和系统进化分析发现该基因含有典型的有典型的AP2/EREBP DNAAP2/EREBP DNA结合结构域，且结合结构域，且属于属于

46、DREBDREB亚家族。由于其亚家族。由于其N N端富含谷氨酰端富含谷氨酰氨残基氨残基,将它命名为将它命名为QRAP2(Glutamine-QRAP2(Glutamine-rich AP2)rich AP2)。常规常规PCRPCR技术能扩增两引物之间的技术能扩增两引物之间的DNADNA区段，区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶然而，有时我们也希望扩增位于靶DNADNA区区段之外的未知段之外的未知DNADNA序列，这就需要应用序列，这就需要应用反反向向PCRPCR（reverse PCRreverse PCR）技术）技术。用用一一种种在在靶靶序序列列上上没没有有酶酶切切位位点点的的核核酸酸限限制

47、制性内切酶消化性内切酶消化DNADNA；产产生生大大小小不不同同的的线线性性DNADNA片片段段群群体体，其其中中靶靶DNADNA区区段段的的DNADNA分分子子长长度度不不超超过过23kb23kb，经经连连接后重新环化；接后重新环化；按按靶靶序序列列设设计计的的一一对对引引物物与与互互补补序序列列退退火火结结合，其延伸方向如箭头所指；合，其延伸方向如箭头所指；反反向向PCR的的基基本本操操作作程程序序。波波纹纹线线表表示示靶靶DNA区区段段，箭箭头头表表示示限限制制性性内内切切酶酶位位点点，分分别别用用方方框框表表示示靶靶DNA区区段段的的左左侧侧和和右右侧序列。侧序列。RACERACE技技

48、术术（rapid rapid amplification amplification of of cDNA cDNA endsends）(Page 183)(Page 183)在在已已知知cDNAcDNA序序列列基基础础上上克克隆隆55或或33端端缺缺失失序序列列的的技技术术。根根据据已已知知序序列列设设计计基基因因片片段段内内部部特特异异引引物物，由由该该片片段段向向外外侧侧进进行行PCRPCR扩扩增增得得到到目目的的序序列列。用用于于扩扩增增55端端的的方方法法称称为为5RACE5RACE，用于扩增，用于扩增33端的称为端的称为3RACE3RACE。5 RACE5 RACE在反转录酶的作用

49、下，以基因片段内部特异性在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性引物（引物（GSP1GSP1）启始）启始cDNAcDNA第一条链合成。第一条链合成。RNaseRNase降解模板链降解模板链mRNAmRNA，纯化第一链。，纯化第一链。用末端转移酶在用末端转移酶在cDNAcDNA链链33端加入连续的端加入连续的dCTPdCTP。以连有以连有oligo(dG)oligo(dG)的锚定引物和基因片段内部的锚定引物和基因片段内部特异的特异的nestednested引物进行引物进行PCRPCR扩增，得到目的片扩增，得到目的片段，用段，用nest PCRnest PCR检测。检测。3RACE1、用用olig

50、o(dT)锚锚定定引引物物启启始始cDNA第第一一链的合成链的合成.2、降解模板、降解模板mRNA.3、用用通通用用锚锚定定引引物物UAP和和基基因因片片段段内内部部特特异异引引物物进进行行PCR扩扩增增得得到到目目的的3片片段段，用用nest PCR法检测法检测.5.2.4 5.2.4 实时定量实时定量PCRPCR（real time quantitative PCRreal time quantitative PCR，Q-PCRQ-PCR）由由于于PCRPCR敏敏感感性性高高，扩扩增增产产物物总总量量变变异异系系数数大大，定定量量不不准准确确。9090年年代代末末期期出出现现了了Q-PCR