一显微镜的使用及微生物形态的观察 PPT课件.ppt

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1、水处理生物学实验凌 琪2017年2月实验一 显微镜的使用及微生物形态的观察一、实验目的1.学习普通光学显微镜的使用方法。2.结合生物滤池生物膜及曝气池活性污泥的观察,认识原生动物、菌胶团等微生物的形态,并学习测量微生物大小的方法。二、实验器材1.生物滤池滤料、活性污泥法曝气池混合液。2.显微镜、目测微尺、物测微尺、载玻片、盖玻片。三、实验步骤(一)显微镜的结构和各部分的作用机械部分主要包括:1.镜筒 2.载物台 3.调节器光学部分主要包括:1.接目镜 2.接目镜 3.集光器 4.反光镜 显微镜的结构三、实验步骤(二)显微镜的使用和保护方法 1.低倍镜的使用方法 2.高倍镜的使用方法三、实验步骤

2、 3.显微镜的保护法 (1)显微镜应放置在干燥的地方,使用时避免强烈的日光照射。(2)接物镜或接目镜不清洁时,应当用擦镜纸或软绸揩擦。(3)用完显微镜后,应当立即放到镜匣中。三、实验步骤(三)活性污泥和生物膜的观察1.标本的制备 (1)活性污泥 取活性污泥法曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片的中央(如混合液中污泥较少，可待其沉淀后,去沉淀污泥一小滴加到载玻片上；如混合液中污泥较多，则应稀释后进行观察)显微镜的使用及微生物形态显微镜的使用及微生物形态的观察。的观察。三、实验步骤 (2)生物膜 A 从生物膜法的构筑物内刮取生物膜一小块,用蒸馏水稀释,制成供显微镜观察用的菌液。对于用石子作滤料的生

3、物滤池,也可取石子一小块,置于冲洗干净的烧杯中,加蒸馏水少许和干净的玻璃珠,摇荡数分钟,使滤料上的生物膜脱落在水中,去掉滤料,再摇荡数分钟,做成菌液(如太浓、不易在显微镜下观察,可进行稀释)。B 取菌液一小滴,置于洁净载玻片的中央,用洗净的盖玻片覆盖(注意不要有气泡)以备显微镜观察之用。三、实验步骤 2.显微镜观察 (1)低倍镜观察A 在选定的接目镜下,利用低倍镜,确定目测微尺一格的长度(单位以um计)。B 观察所制备的微生物标本玻片,画出所见原生物、菌胶团等微生物的形态草图.选择一个原生动物,量出其尺寸。C 记下观察所用接目镜和接物镜的放大倍数和算出显微镜的放大倍数。三、实验步骤 (2)高倍

4、镜观察 A 改用高倍镜观察,画出微生物的形态草图,并与用低倍镜所看到的比较,注意其不同点.B 记下显微镜的放大倍数.四、显微镜保养和使用中的注意事项1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度光洁度3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.观

5、察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。绘图。5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。可单手拿，更不可倾斜拿。6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。腐蚀镜片。五、思 考 题 v油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？注意些什么？v使用油镜时，为什么必须用镜头油

6、？使用油镜时，为什么必须用镜头油？v镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？接用高倍镜或油镜观察？实验二实验二 微型动物的计数微型动物的计数 活性污泥和生物膜是生物法处理废水的主体。污泥中微生物的生长、繁殖、代谢活动以及微生物之间的演替情况往往直接反映了处理状况。因此，我们在操作管理中除了利用物理、化学的手段来测定活性污泥的性质以外，还可借助于显微镜观察微生物的状态来判断废水处理的运行状况，以便及早发现异常情况，及时采取适当的对策，保证稳定运行提高处理效果。为了监测微型动物演替变化状况还需要定时进行计数。一、实验目的 了解活性污

7、泥或生物膜中微生物及微型动物的数量及生长状况。二、材料与器皿 (一)显微镜、载玻片、盖玻片、微型动物计数板；(二)活性污泥(或生物膜)样品。三、方法与步骤 (一)压片标本的制备 1.取活性污泥法曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片中央(如混合液中污泥较少，可待其沉淀后，取沉淀的活性污泥一小滴放在载玻片上；如混合液中污泥较多，则应稀释后进行观察)。2.盖上盖玻片，即制成活性污泥压片标本。在加盖玻片时，要先使盖玻片的一边接触水滴，然后轻轻放下，否则会形成气泡、影响观察。3.在制作生物膜标本时，可用镊子从填料上刮取一小块生物膜，用蒸馏水稀释，制成菌液。以下步骤与活性污泥标本的制备方法相同。(二)显微

8、镜观察 1低倍镜观察，要注意观察污泥絮粒的大小，污泥结构的松紧程度，菌胶团和丝状菌的比例及其生长状况，并加以记录和作必要的描述。观察微型动物的种类、活动状况，对主要种类进行计数。污泥絮粒大小对污泥初始沉降速率影响较大，絮粒大的污泥沉降快，污泥絮粒大小按平均直径可分成三等：大粒污泥：絮粒平均直径500m；中粒污泥：絮粒平均直径在150500m之间；细小污泥：絮粒平均直径150m。污泥絮粒性状是指污泥絮粒的形状、结构、紧密度及污泥中丝状菌的数量。镜检时可把近似圆形的絮粒称为圆形絮粒；与圆形截然不同的称为不规则形状絮粒。絮粒中网状空隙与絮粒外面悬液相连的称为开放结构；无开放空隙的称为封闭结构。絮粒中

9、菌胶团细菌排列致密，絮粒边缘与外部悬液界限清晰的称为紧密的絮粒。絮粒边缘界线不清的称为琉松的絮粒。实践证明，圆形、封闭、紧密的絮粒相互间易于凝聚，浓缩、沉降性能良好；反之则沉降性能差。活性污泥中丝状菌数量是影响污泥沉降性能最重要的因素，当污泥中丝状菌占优势时，可从絮粒中向外伸展，阻碍了絮粒间的浓缩，使污泥SV值和SVI值升高，造成活性污泥膨胀。根据活性污泥中丝状菌与菌胶团细菌的比例，可将丝状菌分成五个等级：o 级：污泥中几乎无丝状菌存在；级：污泥中存在少量丝状菌；十 级：存在中等数量的丝状菌，总量少于菌胶团细菌；级：存在大量丝状菌，总量与菌胶团细菌大致相等；级：污泥絮粒以丝状菌为骨架，数量超过

10、菌胶团而占优势。2高倍镜观察 用高倍镜观察，可进一步看清微型动物的结构特征。观察时注意微型动物的外形和内部结构，如钟虫体内是否存在食物胞，纤毛环的摆动情况等。观察菌胶团时，应注意胶质的厚薄和色泽、新生菌胶团出现的比例。观察丝状菌时，注意丝状菌生长、细胞的排列、形态和运动特征，以判断丝状菌的种类，并进行记录。3油镜观察 鉴别丝状菌的种类时，需要使用油镜。这时可将活性污泥样品先制成涂片后再染色，应注意观察丝状菌是否存在假分支和衣鞘，菌体在衣鞘内的空缺情况，菌体内有无贮藏物质的积累和贮藏物质的种类等，还可借助鉴别染色技术观察丝状菌对该染色的反应。(三)微型动物的计数 1取活性污泥法曝气池混合液盛于烧

11、杯内，用玻棒轻轻搅 匀，如混合液较浓，可稀释成1：1的液体后观察。2取洗净的滴管1支（滴管每滴水的体积应预先测定，般可选一滴水的体积为120mL的滴管），吸取搅匀的混合液，加一滴到计数板的中央方格内（见下图）。然后加上一块洁净的大号盖玻片，使其四周正好搁在计数板四周凸起的边框上。微型动物计数板 3用低倍镜进行计数。注意所滴加的液体不一定布满整个100格小方格。计数时，只要把充有污泥混合液的小方格挨着次序依次计数即可。观察时，同时注意各种微型动物的活动能力、状态等。若是群体，则需将群体上的个体分别计数。4计算 设在一滴水中测得钟虫50只，样品按1：1稀释，则每毫升混合液中含钟虫数应为：50只20

12、22000只。四、结果与分析 将观察结果填入下表，在符合处打“”表示：样品名称：观察人：日期：试比较生活污水中活性污泥与工业废水处理系统中的活性污泥性状以及微型动物的种类、数量等有何差异?五、问题与思考 怎样通过了解微型动物种类或数量变化，来反映废水处理情况？实验三实验三大肠杆菌生长曲线的测定大肠杆菌生长曲线的测定 实验目的实验目的 实验原理实验原理 实验器材实验器材 实验方法实验方法 实验结果实验结果 注意事项注意事项 思考题思考题1.了解细菌生长曲线的基本特征，测定大肠杆菌在不同了解细菌生长曲线的基本特征，测定大肠杆菌在不同培养条件下的生长曲线。培养条件下的生长曲线。2.掌握利用细菌悬液的

13、混浊度间接测定细菌生长的方法。掌握利用细菌悬液的混浊度间接测定细菌生长的方法。实验目的实验目的 生长曲线就是把一定量的单细胞微生物接种到恒定生长曲线就是把一定量的单细胞微生物接种到恒定容积的液体培养基中，在合适的条件下进行培养，在此过容积的液体培养基中，在合适的条件下进行培养，在此过程中，其细胞数目将随培养时间的延长而发生规律性的变程中，其细胞数目将随培养时间的延长而发生规律性的变化，如以细胞数目的对数值（或化，如以细胞数目的对数值（或OD值）为纵坐标，以培值）为纵坐标，以培养时间为横坐标作一条曲线，即为微生物的生长曲线，它养时间为横坐标作一条曲线，即为微生物的生长曲线，它反映了微生物群体的生

14、长规律。依据其生长速率的不同，反映了微生物群体的生长规律。依据其生长速率的不同，可把生长曲线分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个可把生长曲线分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养时期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此测定微生物的生长曲线，可条件的不同而有所改变。因此测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。意义。实验原理实验原理 测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数法、平测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数法、

15、平板菌落计数法、称重法、比浊法等。板菌落计数法、称重法、比浊法等。本实验采用分光光度计本实验采用分光光度计(spectrophotometer)进行光进行光电比浊测定，由于细菌悬浮液的浓度与混浊液成正比，因电比浊测定，由于细菌悬浮液的浓度与混浊液成正比，因此，可利用分光光度计测定菌悬浮的光密度来推知菌液的此，可利用分光光度计测定菌悬浮的光密度来推知菌液的浓度，并将所测得的光密度值（浓度，并将所测得的光密度值（OD值）与其对应的培养时值）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的实生长曲线。间作图，即可绘出该菌在一定条件下的实生长曲线。实验原理实验原理1.菌种菌种 培养培养1820h的大

16、肠杆菌的大肠杆菌(Escherichia coli)培养培养液。液。2.培养基培养基（1）牛肉膏蛋白胨液体培养基）牛肉膏蛋白胨液体培养基（2）葡萄糖铵盐合成培养基）葡萄糖铵盐合成培养基3.仪器或其他用具仪器或其他用具 721型分光光度计，水浴振荡摇床，型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。无菌试管，无菌吸管等。实验器材实验器材葡萄糖葡萄糖 2.0gK2HPO4 7.0gKH2PO4 2.0g柠檬酸钠柠檬酸钠2H2O 0.5gMgSO4 7H2O 0.1g（NH4）2 SO4 2.0g水水 1 000mlpH 7.2葡萄糖铵盐合成培养基：葡萄糖铵盐合成培养基：1.菌种的培养菌种的培养

17、 取大肠杆菌斜面菌种取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作支，以无菌操作挑挑 取取1环，接入牛肉膏蛋白胨培养液中，静止培养环，接入牛肉膏蛋白胨培养液中，静止培养1824h 左右。此菌液用作左右。此菌液用作“种子种子”培养液。培养液。2.分装培养基分装培养基 将牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐将牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐 液体培养基分装液体培养基分装11支试管，每管内支试管，每管内5ml。用记号笔标明。用记号笔标明 培养时间，即培养时间，即0、1.5,、3、4、6、8、10、12、14、16 和和20 h。实验方法实验方法3.接种接种 用用1 ml无菌吸管，每次准确地吸取无菌吸管，每次准确

18、地吸取0.2ml大肠杆大肠杆菌培养液分别接种到已编号的菌培养液分别接种到已编号的11支牛肉膏蛋白胨液体培支牛肉膏蛋白胨液体培养基和养基和11支葡萄糖铵盐液体培养基试管中，接种后振荡，支葡萄糖铵盐液体培养基试管中，接种后振荡，使菌体混匀。使菌体混匀。4.培养培养 将已接种的试管置摇床将已接种的试管置摇床37振荡培养，振荡频率振荡培养，振荡频率250 r/min（温度和频率可随需要调节）。分别在（温度和频率可随需要调节）。分别在0、1.5,、3、4、6、8、10、12、14、16和和20 h将标有相应将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一

19、同比浊测定其光密度值。定其光密度值。5.比浊侧定比浊侧定 分别以未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基分别以未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐液体培养基作空白对照，选用和葡萄糖铵盐液体培养基作空白对照，选用600 nm波波长进行光电比浊测定。从最稀浓度的菌悬液开始依次长进行光电比浊测定。从最稀浓度的菌悬液开始依次测定，对细胞密度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白测定，对细胞密度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐液体培养基适当稀释后测胨液体培养基和葡萄糖铵盐液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在定，使其光密度值在0.1 0.65之内之内(测定测定OD值前，将值前，将待测定的培养

20、液振荡，使细胞均匀分布待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)，记录，记录OD值值时，注意乘上所稀释的倍数。时，注意乘上所稀释的倍数。实验结果实验结果1.将测定的将测定的OD600值填入下表：值填入下表：光光密密度度值值OD天天然然培培养养基基合合成成然然培培养养基基1212 培养时间（培养时间（h）0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 18 20 2.绘制大肠杆菌的生长曲线：绘制大肠杆菌的生长曲线：以上述表格中的时间为横坐标，大肠杆菌的以上述表格中的时间为横坐标，大肠杆菌的OD值为纵坐值为纵坐标，在坐标纸上作图。所绘制成的曲线即为大肠杆菌在本标，在坐标纸上作图。所绘制成的曲线即为大

21、肠杆菌在本实验条件下的生长曲线。实验条件下的生长曲线。在生长曲线测定中，一定要用空白对照管的培养在生长曲线测定中，一定要用空白对照管的培养液随时校正仪器的零点。液随时校正仪器的零点。注意事项注意事项 1.如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么优缺点两者各有什么优缺点?2.细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短短?若细胞密度为若细胞密度为103/ml，培养，培养4.5 h后，其密度高达后，其密度高达2 108/ml，请计算出其代时。，请计算出其代时。3.次生代谢产物

22、的大量积累在哪个时期次生代谢产物的大量积累在哪个时期?根据细菌生长繁根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多?思考题思考题实验四实验四 细菌、霉菌、酵母菌、细菌、霉菌、酵母菌、放线菌形态的观察放线菌形态的观察 一、一、实验目的目的v进一步掌握显微镜的使用方法。进一步掌握显微镜的使用方法。v观察几个典型细菌的形态观察几个典型细菌的形态(示范片示范片)。v观察几个典型细菌的构造观察几个典型细菌的构造(示范片示范片)。v观察霉菌、酵母菌、放线菌的形态和构观察霉菌、酵母菌、放线菌的形态和构 造，以便找出它们之间及与细菌之间的区造，以便找

23、出它们之间及与细菌之间的区别点。别点。二、二、实验器材器材 1 1、显微镜、擦镜纸、镜油（香柏油）、二甲苯等。显微镜、擦镜纸、镜油（香柏油）、二甲苯等。2 2、示范片示范片：金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、四联球菌、尿八联金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、四联球菌、尿八联球菌、链球菌、球衣细菌、大肠杆菌、霍乱弧菌等。球菌、链球菌、球衣细菌、大肠杆菌、霍乱弧菌等。枯草杆菌芽孢、假单胞杆菌鞭毛、固氮菌荚膜等。枯草杆菌芽孢、假单胞杆菌鞭毛、固氮菌荚膜等。酵母菌、霉菌、放线菌等。酵母菌、霉菌、放线菌等。三、三、实验内容内容细菌基本构造观察细菌特殊构造观察放线菌形态结构 是一类具有丝状分枝细胞的革兰氏阳性细菌，因

24、菌落呈放射状而得名。放线菌的形态和大小 v放线菌呈分枝丝状；v菌丝无隔膜，单细胞；v菌丝直径与细菌相似，小于1微米。放线菌菌丝形态和功能 菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基基内菌丝内菌丝、气、气生菌丝生菌丝和和孢子丝孢子丝三种。三种。产生无性孢子是放线菌主要的繁殖方式。产生无性孢子是放线菌主要的繁殖方式。霉菌的形态结构观察霉菌（霉菌（mould，mold）凡生长在营养基质上形成绒毛凡生长在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的小型真菌，统称为霉菌。状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的小型真菌，统称为霉菌。霉霉菌菌的的营营养养体体由由分分支支或或不不分分支

25、支的的菌菌丝丝构构成成。许许多多菌菌丝相互交织形成菌丝体丝相互交织形成菌丝体。菌菌丝丝的的大大小小：直直径径约约为为 2 10m，在在光光学学显显微微镜镜下，菌丝细胞呈管状。下，菌丝细胞呈管状。霉菌的形态和大小霉菌的菌丝v从结构来看，霉菌的菌丝有两种：从结构来看，霉菌的菌丝有两种：无无隔隔菌菌丝丝：低低等等霉霉菌菌如如根根霉霉、毛毛霉等；霉等；有有隔隔菌菌丝丝：高高等等霉霉菌菌如如青青霉霉、曲曲霉等。霉等。v在功能上，霉菌的菌丝已有分化，在功能上，霉菌的菌丝已有分化，可分为：可分为：营养菌丝：营养菌丝：气生菌丝：气生菌丝：繁殖菌丝：繁殖菌丝：霉菌的繁殖方式和繁殖结构v霉菌主要靠形成各种无性孢子

26、和有性孢子进行繁殖。v霉菌的无性孢子J 厚垣孢子J 节孢子J分生孢子J 孢囊孢子 根霉根霉v产淀粉酶等，用于甜产淀粉酶等，用于甜酒的酿制酒的酿制v生产多种有机酸生产多种有机酸v转化甾体类物质转化甾体类物质v产蛋白酶、淀粉酶等，产蛋白酶、淀粉酶等，用于腐乳的酿制用于腐乳的酿制v生产多种有机酸生产多种有机酸v转化甾体类物质转化甾体类物质 毛霉毛霉 曲霉曲霉v产蛋白酶、淀粉酶等，产蛋白酶、淀粉酶等，用于酱油的酿制用于酱油的酿制v生产多种有机酸生产多种有机酸v产毒素产毒素v生产青霉素v纤维素酶和有机酸等v果品腐烂v产生毒素l青霉菌菌丝与曲霉相似，但无足细胞。青霉菌菌丝与曲霉相似，但无足细胞。l分生孢子

27、梗顶端不膨大，无顶囊。分生孢子梗顶端不膨大，无顶囊。l分生孢子小梗多次分枝呈扫帚状。分生孢子小梗多次分枝呈扫帚状。l分生孢子颜色为青绿色。分生孢子颜色为青绿色。青霉青霉四、四、实验报告告v复习显微镜的使用方法，重点放在油镜的使用部分。v严格按照显微镜的使用方法，依次逐个观察细菌的形态、构造及酵母菌、霉菌、放线菌的形态。分别绘出其形态、构造图。实验五 培养基的制备与灭菌一、实验背景及目的：一、实验背景及目的：培养基是人工配制的、用于微生物培养的混合基质。培养基的制备是微生物学实验课程中的基础的实验项目。有关微生物学的实验工作均开始于相关培养基的制备。了解微生物培养基及其制备原理和培养基的种类；掌

28、握培养基制备的一般方法和操作步骤。二、基本原理：二、基本原理：培养基是根据微生物以渗透吸收方式获取营养的特性，人工配制的可以满足微生物生长、繁殖对营养需求的混合养料。培养基中一般应含有六大营养要素，即碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水。培养基中的六大营养要素可根据具体的微生物的特性和试验工作的目的要求，决定加入与否。如：培养自生固氮菌时，培养基中就无需加入氮源。实验五 培养基的制备与灭菌实验五 培养基的制备与灭菌 在不同的试验工作中，选用不同的培养基，有利于工作的顺利进行。选用选选择择性性培培养养基基可以从混合有多种微生物的样品中分离出某一种或一类微生物；选用鉴鉴别别性性培培养养基基，可以

29、对形态上相似，但属不同种类的微生物做出鉴别、判断；分离、筛选微生物时，常用固体培养基固体培养基；微生物的大规模发酵生产中，常用液液体体培培养基养基等。实验五 培养基的制备与灭菌制备各种培养基的程序大致相同：1、按照选定的培养基配方，称取各营养物（药品），先用少于总量的水将其溶解（一般需加热，并应不时搅拌，以防烧焦或溢出以防烧焦或溢出。配置固体培养基溶解凝固剂时要特别注意此点）；2、溶解后补足所需水分，调整pH值，分装到合适的容器中；3、加塞，包扎，标记，及时灭菌。灭菌后，经灭菌效果检验正常即可待用。实验五 培养基的制备与灭菌三、实验材料与仪器设备：三、实验材料与仪器设备：1.根据选定的培养基选

30、用相应的药品（各类营养物）；以常用的分别培养细菌、放线菌和土壤真菌的培养基为例：（1）用于细菌培养的牛肉膏蛋白胨固体培养牛肉膏蛋白胨固体培养基（营养琼脂）基（营养琼脂）：属天然培养基。牛肉膏：3g；蛋白胨：10g；NaCI：5g；琼脂：1520g；蒸馏水：1000mL；pH：7.07.2。实验五 培养基的制备与灭菌（2）用于放线菌培养的高氏一号固体培养基高氏一号固体培养基：属合成培养基。可溶性淀粉：20g；NaCI：0.5g；KNO3：1g；K2HPO43H2O：0.5g；MgSO47H2O：0.5g；FeSO47H2O：0.1g；琼脂：1520g；水：1000mL；pH：7.47.6。实验五

31、 培养基的制备与灭菌（3）用于分离、培养土壤真菌的马丁氏培马丁氏培养基养基：属选择性合成培养基。KH2PO4：1g；MgSO47H2O：0.5g；蛋白胨：5g；葡萄糖：10g；孟加拉红：33mg；琼脂：1520g；蒸馏水：1000mL；pH：自然；临用时，以无菌操作向100mL培养基中加入1%链霉素0.3mL 实验五 培养基的制备与灭菌四、实验步骤：四、实验步骤：1.称量：按培养基配方的要求及配制培养基的总量称取药品（各营养物）置于量杯中；2.溶解：取少于培养基总量的水于量杯中，加热溶解，不时搅拌；待药品均溶解后，补足水分，调整pH值；实验五 培养基的制备与灭菌3.过滤、分装：按要求过滤后（无

32、特殊要求的此步可省略），将配制好的培养基分装到适当的容器中。试管：液体培养基分装试管的量约为试管高度的1/4左右；半固体培养基约为试管高度的1/3左右；固体培养基约为试管高度的1/5左右；三角瓶：根据实验的要求分装。做液体培养时，一般在250ml三角瓶中装50100ml或适量的培养基；用于存放固体培养基时，不超过三角瓶容积的1/2；实验五 培养基的制备与灭菌4.加（棉）塞：装有培养基的容器均需加塞，其作用是防止杂菌侵入和有利于气体交换。常用自制的棉塞制作方法见下页。做液体培养的三角瓶口使用八层纱布制成的通气塞。5.包扎：试管每710只捆成一捆，在棉塞上包两层报纸（废报纸应裁成适当的大小），并做

33、好标记标记！标记内容：培养基名称、制备日期、制作组别等。实验五 培养基的制备与灭菌棉塞制作塞方法：棉塞：A正确B、C不正确实验五 培养基的制备与灭菌6.灭菌：一般培养基采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。高压蒸汽灭菌时应根据培养基的性质采用相应的灭菌温度。本实验中的牛肉膏蛋白胨固体培养基和高氏一号培养基采用121，灭菌20分钟；马丁氏培养基采用113，灭菌30分钟。实验五 培养基的制备与灭菌7.搁置斜面：灭菌完成后，将需要制成斜面的固体培养基试管在未凝固前（约60左右时），斜放在实验台面上，搁置成斜面，斜面的长度约为试管长度的1/2，待凝。8.灭菌效果检验：培养基冷却后，随机取出少量培养基，置于37培

34、养箱中，24小时，观察有无杂菌生长，无杂菌生长说明灭菌效果良好。贮存，待用。实验五 培养基的制备与灭菌五、实验结果：五、实验结果：1、记录你制备的培养基的种类、名称、数量等；2、实验过程中有何问题，请分析原因。实验六实验六 微生物的染色微生物的染色实验目的实验目的实验目的实验目的染色原理染色原理染色原理染色原理染色方法染色方法染色方法染色方法实验材料实验材料实验材料实验材料实验内容与步骤实验内容与步骤实验内容与步骤实验内容与步骤注意事项注意事项注意事项注意事项实验结果实验结果实验结果实验结果一、实验目的一、实验目的 学习微生物的染色原理、染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染

35、色法。二、染色原理二、染色原理 由于微生物细胞含有大量水分，对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。经测定，细菌等电点pH在2-5之间，故在中性、碱性或偏酸性溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带

36、负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。三、染色方法三、染色方法(一一)简单染色法简单染色法 简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。(二二)复染色法复染色法 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革

37、兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细细胞壁的成分和结构胞壁的成分和结构不同而造成的。四、实验材料四、实验材料1.显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯等。2.石炭酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、95乙醇、蕃红染液3.菌种：金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌 五、实验内容与步骤五、实验内容与步骤(一一)细菌的简单染色步骤细菌的简单染色步骤 涂片干燥固定染色水洗干燥镜检1涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种(金黄色葡萄球菌或枯草杆菌)与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上

38、涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。2干燥 涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。3固定 固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过23次，共约23秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60）,放置待冷后，进行染色。4染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。5水洗 斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止

39、。6干燥 用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。7镜检 用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。(二二)细菌的革兰氏染色步骤细菌的革兰氏染色步骤 涂片干燥固定初染水洗媒染水洗脱色水洗复染水洗干燥观察1取大肠杆菌和枯草杆菌(均以无菌操作)分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。2用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。3加碘液媒染1min后水洗。4斜置载玻片，滴加95乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色 为止，大约需时2030s，随即水洗。5用蕃红染液复染1min，水洗。6用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的

40、颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。六、注意事项六、注意事项 1革兰氏染色成败的关键是脱色时间关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须 严格把握脱色时间。2 选用培养18-24小时菌龄小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。思考题及实验作业思考题及实验作业1 不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？2 通过革兰氏染色，你认为它在微生物学中有何实践意义？七、实验结果七、实验结果简单染色：金黄色葡萄球菌和枯草杆菌染成（）色。革兰氏染色：大肠杆菌与

41、枯草杆菌染色结果填于下表中。大肠杆菌革兰氏染色大肠杆菌革兰氏染色 炭疽杆菌的革兰氏染色炭疽杆菌的革兰氏染色 革兰氏染色可见大量细菌革兰氏染色可见大量细菌 革兰氏染色后在显微镜下观察革兰氏染色后在显微镜下观察 染色显示染色显示革兰氏阴性阳性细菌革兰氏阴性阳性细菌微生物的纯种分离、培养及接种技术实验七一、实验目的一、实验目的 通过学习学习微生物的纯种分离，培养和接种技术，进而学会微生物生理生化反应的实验，为废水处理服务。在水处理的细菌检查中，细菌的分离，培养和接种也是一个重要的环节。微生物的纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。二、实验器材二、实验器材1.无菌培养皿（直径90mm），无菌吸

42、管，无菌锥形瓶，无菌试管，5管无菌水（每管有9mL灭菌过的自来水）。2.营养琼脂培养基（已灭菌的），活性污泥。3.接种环，酒精灯，恒温箱等。三、三、实验内容实验内容 （一）培养基的制备及灭菌（一）培养基的制备及灭菌1.玻璃器皿的包扎与灭菌 （1）六套培养皿一组,用报纸包装。（2）取四支吸量管，在其吸端塞少许棉花后用长报纸条包扎。（3）干热灭菌:上述玻璃器皿在160C烘箱内2小时。2.无菌水的制备 在3支试管中各装入9mL自来水，塞上硅胶塞,同下述培养基一起用高压蒸汽灭菌。3.培养基的制备 称量：牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 自来水 0.75g 1.5g 0.75g 3g 150mL 溶化：用

43、烧杯在电炉上将上述各物依次溶解，注意补充水。调pH值：溶液稍冷后用pH试纸、10%NaOH或10%HCl 调整溶液 的 pH在7.6左右。分装：试管4支各装其高度1/5的溶液，其余溶液装锥形瓶。加塞包扎：锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。湿热灭菌：（高压蒸汽灭菌）1.05kg/cm2(103kPa)、121灭菌 20min。搁置斜面：试管培养基冷至50时斜搁使斜面长度不 超过试管一半。（二）微生物的分离、培养及形态观察（二）微生物的分离、培养及形态观察1.平板划线分离法 (1)倒平板:将融化并冷至50的细菌培养基倒约1520mL于无菌培养皿中，立即放在桌上轻轻转动使之均匀。冷后成平板。（3个）(2)

44、划线：在火焰旁，左手拿平板，右手拿接种环，取一环菌液（原污水）在平板上划线。常用划线方法见下图。划线完毕后盖上皿盖，倒置于37恒温箱中培养48小时后观察结果。2.稀释平板分离法 (1)取样 (2)稀释水样 以无菌操作按十倍稀释法用无菌吸量管和无菌水将10-3倍的水样稀释至10-4、10-5、10-6倍。(3)平板制作 将三套无菌培养皿编号，将上述三种浓度的水样各吸0.5mL 于相应的培养皿中。加热融化培养基，待其冷至约45时以无菌操作倾注1015mL 入培 养皿中，马上将培养皿平 放桌上 轻轻转 动使之混合均匀，冷却后 成平板。倒置，于 37培 养48小时后观察 结果。10-110-210-3

45、10-410-510-6（三）其他一些接种的操作技术（三）其他一些接种的操作技术 1斜面接种技术 2液体接种 3由液体培养基接种到液体培养基 4穿刺接种 无菌操作无菌操作四、思考题四、思考题1、分离活性污泥为什么要稀释水样？你考虑怎样来进行生物膜法生物膜的纯种分离和培养？2、用一根无菌吸管取几种浓度的水样时，应从哪一个浓度开始？为什么？实验八实验八 纯培养菌种的菌体、纯培养菌种的菌体、菌落形态观察菌落形态观察 一、实验目的要求一、实验目的要求1、观察细菌、放线菌、酵母菌、霉物具体菌种菌落的形态特征。2、总结几类微生物菌落的一般特征并能识别。二、在固体培养基上形成的菌落的特征二、在固体培养基上形

46、成的菌落的特征 菌落：单个菌体在固体平面培养基上生长繁殖形成的肉眼可见的群体。区分和识别各类微生物可从菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面进行，菌落形态是无数细胞形态的集中反映，因此，每一大类微生物都有其一定的菌落特征，可通过这些特征差异区分和识别之。特征描述：形状、大小、颜色、边缘、隆起、光泽、质地等。细菌菌落特征：凝胶状、表面较光滑、湿润、与培养基结合不紧密，易挑取，正反颜色一致。观察溶血现象（完全溶血、半溶血及不溶血）观察溶血现象（完全溶血、半溶血及不溶血）示教：血平板上细菌的生长现象示教：血平板上细菌的生长现象放线菌特征：致密、坚硬、多皱、不易用针挑起，不透明。孢子成熟后，

47、表面粉末状，干燥。酵母菌菌落特征：与细菌相似，但比细菌大而厚，不透明，表面光滑、湿润、粘稠，易用针挑起，多呈乳白色。霉菌的菌落特征：比细菌菌落大，由菌丝组成疏松的绒毛状、絮状或蜘蛛网状，有的无固定大小，延至整个培养基中，产色素，使菌落显色。三、斜面培养基上生长状态三、斜面培养基上生长状态 可见有均匀一致的菌苔，如有不同的菌落出现，可见有均匀一致的菌苔，如有不同的菌落出现，则表明污染了杂菌。则表明污染了杂菌。四、液体培养基中生长状态四、液体培养基中生长状态 培养前的液体培养基多为清彻透明的。接种培养前的液体培养基多为清彻透明的。接种细菌后，由于细菌种类不同，可有以下三种生细菌后，由于细菌种类不同

48、，可有以下三种生长形式。长形式。均匀混浊生长：液体变为混浊。均匀混浊生长：液体变为混浊。表面生长：液体澄清，表面有一薄膜。表面生长：液体澄清，表面有一薄膜。沉淀生长：管底有沉淀物。沉淀生长：管底有沉淀物。示教：菌膜，混浊，沉淀示教：菌膜，混浊，沉淀表表面面生生长长 沉沉淀淀生生长长 混混浊浊生生长长 液体培养基液体培养基五、半固体中生长状态五、半固体中生长状态 动力阴性（无鞭毛）的细菌在半固体培养动力阴性（无鞭毛）的细菌在半固体培养基中生长，只能沿着接种线生长，因此生基中生长，只能沿着接种线生长，因此生长线清晰；动力阳性（有鞭毛）的细菌在长线清晰；动力阳性（有鞭毛）的细菌在半固体培养基中生长，

49、可扩散生长，因此半固体培养基中生长，可扩散生长，因此生长线模糊，呈羽毛状。生长线模糊，呈羽毛状。无动力有动力半固体培养基：六、结果记录1、借助放大镜分别观察各类微生物的菌落的大小，表面粗糙及含水分状况，边缘，致密程度、透明程度，及厚度等特征，并填写记录表。2、根据观察结果总结各类微生物菌落的一般特征。微生物菌落观察记录表实验目的实验目的实验目的实验目的实验用具实验用具实验用具实验用具培养基及染色试剂培养基及染色试剂培养基及染色试剂培养基及染色试剂 水样的采集和保存水样的采集和保存水样的采集和保存水样的采集和保存 实验方法及步骤实验方法及步骤实验方法及步骤实验方法及步骤思考题思考题思考题思考题实

50、验九实验九 微生物的生理生化特性微生物的生理生化特性 一、实验目的一、实验目的 在水处理工程中，水源水要经过处理后才能供给用户。饮用水要求清澈、无色、无臭，更重要的是没有病原菌。因此，自来水在出厂以前要作水质的物理化学分析和细菌检验，本实验结合给水净化工程中的细菌检验，作细菌总数和大肠菌群的测定。通过大肠菌群的测定，了解大肠杆菌的生理生化特性。大肠菌群数系指每升水样中所含有的大肠菌群的数目。大肠菌数一般包括大肠埃希氏杆菌、产气杆菌、枸椽酸盐杆菌和副大肠杆菌。本实验的发酵试验采用含有乳糖的培养基，故测定结果不包括副大肠杆菌。细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，于37C经24h培养后，所生长