水稻稻曲病菌分离鉴定与稻曲病抗性鉴定技术规范(T-GDPPS 007—2023).pdf

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1、ICS65.020CCS B 15团体标准T/GDPPS 0072023水稻稻曲病菌分离鉴定与稻曲病抗性鉴定技术规范Technical specification for isolation Ustilaginoidea virens and evaluation ofresistance against rice false smut2023-12-22 发布2023-12-22 实施广东省植物保护学会发 布T/GDPPS 0072023I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不

2、承担识别专利的责任。本文件由广东省植物保护学会提出并归口。本文件起草单位：广东省农业科学院植物保护研究所。本文件主要起草人：杨健源、冯爱卿、封金奇、陈凯玲、陈炳、林晓鹏、苏菁、陈深、汪文娟、汪聪颖、梁美玲、朱小源。T/GDPPS 00720231水稻稻曲病菌分离鉴定与稻曲病抗性鉴定技术规范1范围本文件规定了水稻稻曲病菌的采集、分离、鉴定、保存技术；水稻品种（系）、种质资源等材料对稻曲病的抗性鉴定和评价方法。本文件适用于稻曲病菌的分离、鉴定和保存；水稻品种（系）等材料对稻曲病抗性的室内鉴定和抗性评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引

3、用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 3625稻曲病抗性鉴定技术规程DB35/T 1575水稻稻曲病菌分离鉴定技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1稻曲病 rice false smut由病原真菌无性态为稻绿核菌Ustilaginoidea virens(Cooke)Takahashi，有性态为绿糙棒菌Villosiclava virens所引起的一种水稻穗部病害。该病菌主要为害谷粒，且在水稻灌浆乳熟期表现症状。菌丝在受害谷粒内形成块状，逐渐膨大，形成比正常谷粒大34倍的菌块，呈球形，称为稻曲球。发病初

4、期，稻谷颖壳缝合处出现乳白色薄膜包裹的米粒大小稻曲病粒，随着病粒变大，乳白色包膜破裂呈现淡黄色、黄色，后至墨绿色，最后孢子座表面龟裂，散出墨绿色粉状物，有毒。孢子座表面可产生黑色、扁平、硬质的菌核。3.2分离物 isolate从发病部位分离获得，并经过科赫氏法则验证的纯培养物。3.3接种体 inoculum用于人工接种水稻的病菌孢子悬浮液。3.4试验品种（系）testing variety（line）抗病性鉴定参试的水稻品种（系）。3.5感病对照品种 susceptible control variety抗病性鉴定时选定的当地相应熟期的感病品种。3.6抗性鉴定 resistance ident

5、ification在水稻某个适宜的生长发育阶段，通过人工接种、自然诱发等方法使水稻感染病原菌，以确定水稻试验品种（系）对病原菌的抗感反应类型。4稻曲病菌分离鉴定T/GDPPS 007202324.1标样的采集与保存从田间适时剪取带有发病初期的新鲜黄色稻曲球的稻穗，将单个稻穗装入采样纸袋，注明采集时间、地点、水稻品种和采集人等信息，带回实验室于4冰箱保存，尽快分离。4.2培养基4.2.1马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）。称取 200 g 马铃薯，洗净去皮切碎，加入 1000 mL 水煮沸 20 min，纱布过滤后补水至 1000 mL，再加入蔗糖 20 g 和琼脂 20 g，搅拌均匀，121高压灭

6、菌 20 min。4.2.2马铃薯蔗糖培养基（PSB）。称取 200 g 马铃薯，洗净去皮切碎，加入 1000 mL 水煮沸 20 min，纱布过滤后补水至 1000 mL，再加入蔗糖 20 g，搅拌均匀，121高压灭菌 20 min。4.2.3水琼脂培养基（WA）。琼脂 20 g，用水定容至 1000 mL，121高压灭菌 20 min。4.3病原菌分离培养4.3.1以常规组织分离法从稻曲球上分离病原物。在超净工作台上切除稻曲球外层组织，将最内层的白色部分切成约 0.2 cm 0.3 cm 的病组织小块，先用 75%乙醇溶液消毒 15 s，再用灭菌水冲洗 3 次，滤纸吸干后置于 PSA 平板

7、上，恒温培养箱中 28培养。4.3.2分离物培养 7 d 以后，从菌落边缘挑取少量菌丝转入新的 PSA 培养基上。10 d 15 d 后菌落表面开始形成分生孢子，从菌落表面刮取少量分生孢子至含无菌水的离心管中，配成每 mL 含 1104个孢子的悬浮液，吸取 100 L 孢子悬浮液均匀涂布于 WA 培养基上，在超净工作台中吹干。28条件下培养至分生孢子萌发。4.4病原菌鉴定4.4.1病原菌形态学鉴定选取质地致密、直径2 mm 3 mm的黄色或白色小菌落，用灭菌接种针从菌落边缘挑取菌丝块，在光学显微镜下镜检观察厚垣孢子和分生孢子的形态。4.4.2病原菌分子鉴定按照DB35/T 1575中4的规定。

8、4.5病原菌中长期保存4.5.1斜面培养基保存法。从经鉴定的菌株挑取萌发的单个分生孢子，移至 PSA 斜面培养基中 28恒温培养 10 d 后，保存于 4 冰箱中，保存备用。4.5.2滤纸片保存法。将待保存的菌株接种在 PSA 培养基上，在其四周摆放已灭菌的小滤纸片，28恒温培养至菌丝长过滤纸片，在超净工作台中用灭菌镊子将滤纸片揭下，装入灭菌的硫酸纸袋，再将硫酸纸袋装入灭菌的牛皮纸袋，在超净台吹干，密封于装有硅胶干燥剂的塑料包装容器中，在-20低温保存。5稻曲病抗性评价5.1接种体繁殖与准备5.1.1将培养好的病原菌，在无菌条件下用直径 5 mm 的灭菌打孔器，自菌落边缘切取菌块 3 块，接种

9、于 100 mL 的 PSB 液体培养基中，在振荡摇床中 28 150 rpm/min 培养 5 d 7 d 后，获得大量菌丝和薄壁分生孢子。将振荡培养液倒入组织捣碎机，高速打碎菌丝，形成菌丝片段与薄壁分生孢子的混合液，用灭菌的 PSB 培养基调整每 mL 含 5105个分生孢子，作为接种体。5.1.2接种用分离物应采用当地致病力较强、致病性较稳定的优势菌株。5.2抗病性鉴定5.2.1鉴定材料的种植与管理T/GDPPS 007202335.2.1.1将参试材料种子用 3%双氧水浸种 1 d 后，用清水反复冲洗后再按常规进行浸种催芽，每个材料选取发芽良好的种子 40 粒50 粒，按顺序分别穴播于

10、盛有肥沃土壤的育苗盆内，浇水盖土，保证正常出苗生长。在室外自然光照下育苗，幼苗应生长健壮、一致。5.2.1.2约 6 片7 片叶时进行移栽至具备加湿条件的温网室水泥池内。每个参试材料每个重复栽 10穴，每穴 1 棵2 棵基本苗，株行距为 16.6 cm 20.0 cm 或按当地生产实际情况进行设置。试验设 3次重复，均为随机排列。每 5 份参试材料后面或每个水泥池插植 1 行感病对照品种。5.2.1.3水稻材料幼穗分化以后宜保持水泥池中 3 cm 5 cm 水层以增加相对湿度。施肥量略高于当地生产水平。接种前一周施氮肥 1 次，纯氮用量为 75 kg/hm2。参试材料在全生育期内不使用杀菌剂，

11、接种前后避免施用任何药剂。防虫不防病。纹枯病严重时可施 1 次井冈霉素。5.2.2接种时期水稻破口前5 d 8 d（约幼穗分化第期）。避开高温时段，16：00 18：00进行接种为宜。5.2.3接种方法采用注射接种方法。将孢子菌丝混合液注射入穗苞中上部，直至穗苞中充满菌液，并从穗尖溢出为宜。避免针头穿透和穗苞机械损伤。每个稻株接种2个3个穗，选择生育进程相近的穗苞。5.2.4接种期管理5.2.4.1水泥池安装适当的喷水雾设施以增加相对湿度利于发病。接种期间保持相对湿度大于 90%。5.2.4.2接种前 1 周开始每隔 3h 喷雾 1 次，雾滴布满稻株至滴落为止。注射接种前应充分喷雾，接种后 2

12、4 h 内不进行喷雾，之后的 1 周照上述喷雾，之后可以白天喷雾 4 次、夜间 2 次。5.2.4.3若条件允许，宜安装小型气象自动记录仪。5.2.5调查时间水稻腊熟期至黄熟期。5.2.6调查方法与病情记载对参试材料进行调查，每个重复连续调查10穴，每穴调查最严重的稻穗，记录1个数据，共调查1次。原始数据记载采用附录表A.1。5.3抗病性评价5.3.1评价标准稻曲病病情分级标准描述见表1。表 1稻曲病病情级别分级标准病情级别稻曲球数（个/穗）0011325357699105.3.2病情指数计算计算各参试材料相应的病情指数（DI）。计算公式见式（1）：DI=BiBd?MMd 100(1)式中：T

13、/GDPPS 00720234DI-病情指数；Bi-各级病情级别病穗数；Bd-各级病情级别代表值；M-调查总穗数；Md-病情级别最高级代表值（即9）。5.3.3评价结果据参试材料3次重复的病情指数（DI）的平均值评价其抗病性水平。参NY/T 3625，评价标准见表2。表 2稻曲病抗性评价标准病情指数（DI）抗性水平0.0 5.0高抗5.1 10.0抗10.1 20.0中抗20.1 40.0中感40.1 60.0感60.1 100.0高感5.3.4鉴定有效性判别当设置的感病对照品种病情指数（DI）大于40时（即感至高感），该批次稻曲病抗性鉴定视为有效。5.3.5评价报告格式抗性评价结果记载参附录

14、表格A.2，保存原始记录资料。5.3.6试验后材料的处理5.3.6.1接种后剩余的接种体应作灭菌处理。5.3.6.2调查后的稻株应进行无害化处理。T/GDPPS 00720235附录A（规范性）稻曲病抗性评价记载表表 A.1 稻曲病抗性鉴定调查记载表编号品种名称稻曲球数（个/穗）水稻穴号12345678910重复I重复II重复III重复I重复II重复III注1：播种日期：；接种日期：；调查日期：注2：接种菌株编号：；调查生育期：注3：特殊气象等情况：注4：调查人：；记录人：表 A.2 稻曲病抗性评价记载表编号品种名称重复病情指数平均病指抗性评价IIIIIIIIIIII注1：播种日期：；接种日期：；调查日期：注2：接种菌株编号：；调查生育期：注3：特殊气象等情况：注4：调查人：；记录人：