waters-液质联用.docx

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1、1. 适用范围本设备配备 ACQUITY UPLC 液相色谱仪、 Xevo TQ- Smicro MS/MS 质谱仪，适用于食品、药品中各种有机物的定性、定量分析，是一种具有高灵敏度的检测仪器，仪器由主机、计算机和数据处理软件等组成。2. 职责2.1 操作人员依据本规程操作仪器，认真填写试验使用记录。2.2 保管人员负责对仪器进展定期维护和保养。2.3 科室负责人负责监视检查规程的执行。3操作程序日常操作步骤：预备 UPLC 设置样品表 运行样品定量打印报告。注：假设一个星期内不运行样品请不要关质谱仪，使其保持真空。 建立方法和 project 的操作步骤： 预备 UPLC 建立的projec

2、t 用标准品调谐编辑质谱方法编辑 UPLC 方法设置样品表运行样品定量 打印报告。3.1 开机：3.1.1 彻底开机挨次仪器已关闭 确定 MS 及其它仪器电源电缆已连接 ，开氮气发生器、开氩气，小表 等待 windows 正常启动 电脑界面右下角网络图标红叉。翻开 UPLC 自动进样器电源，等到电脑界面右下角网络图标消灭感慨号！。翻开UPLC 泵电源，等约 30s 或者是有响声。翻开质谱电源 ，等待 5min， 离子源透视镜里面亮。翻开 Masslynx 软件，masslynx 主界面 -左侧 instrument-Mass tune-界面菜单栏 vacuum-pump 同样界 面 左 侧 偏

3、 上 diagnostics-vacuum-analyser MS1 turbo speed%要在 5 分钟内升到 80。至少抽真空 4 个小时 查看真空状- 1 -态主界面 mass console-界面左侧 xevo tq ms detector 加号开放-ms display 碰撞室真空度 到达 1.32E-5 mBar。3.1.2 日常开机挨次仪器未关闭 开氮气发生器、开氩气，小表 预备样品 灌注二元泵 灌注自动进样器 建立液相方法 平衡液相3.3.1. 预备流淌相 用 0.22um 的膜过滤缓冲液，全部的缓冲液和超纯水都要配制，超纯水和缓冲液使用不得超过二天，缓冲盐肯定要是可挥发的，

4、而且浓度不要大于 10mM。3.3.2. 样品要求 全部样品尽量用流淌相初始梯度比例的溶剂来溶解，并用 0.22um 的膜过滤。3.3.3 灌注二元泵 在 Masslynx 主界面，单击 MS Console, 进入UPLC 交互显示界面，点击左栏 Acquity UPLC System Control Start Up System ，单击 QSM，选择需要用到的流淌相位置，如 A 和B，选择 seal wash，时间设为 3 分钟。单击 SM，选择 Strong Wash5 cycles , Sample syringe 20 单击 Equilibrate to Method，将流速设为

5、0 ,单击 Start 开头灌注. 时间大约为 9 min 左右。设定流速，平衡液相 在 Masslynx 主界面，单击 Inlet Method 图标 ，翻开 液 相 方 法 编 辑 窗 口 ， 单 击 status ACQUITY Additional Status ，进入液相掌握台，单击 A 或 B 或流速的位置，消灭流速、比例设定对话框, 设定液相流速与比例，单击对勾，开头平衡液相，假设后面要做调谐，可设定流速 0.2 ml/min,有机相与水相的比例为50:50。3.4 预备质谱3.4.1. 计算化合物单同位素养量数 Masslynx 主界面 单击Tools Molecular We

6、ight Calculator, 输入化合物的分子式大写-留意 Cl、Br 等正确的输入方法 ,留意选单同位素 Monoiso ,Ion Mode: 离子化模式， +ve 正离子， -ve 负离子 , 单击 Calculate。3.4.2 用 Intellistart 进展自动调谐 在 Masslynx 主界面单击 MS Tune 图标，翻开调谐窗口，单击 Ion Mode ES+ 或 ES- ，单击API Gas 图标 翻开氮气， 单击 翻开高压 选择 MS Mode 图标 ，设定液相流速 0.2 ml/min, 水：乙腈的比例为 50:50。把标准品调谐液放入质谱仪塑料瓶位置处的 A或 B

7、号位(注:浓度在 200 ppb 左右) 单击 Fluidics ,选择 Reservoir 为 A ,Flow State 为 LC 模式，点击Purge 图标。Purge 完毕后，将 Flow State 改为 Combine 模式，设定 Function 为 MS1 scan，Mass 为计算出化合物的质量数，span 为5，点击进样，开头进样，直到离子的响应比较稳定。保存调谐文件：File Save As 至已建的工程下。 在 Masslynx 主界面，选择Ms Console Xevo TQ MS Detector 选 择 Intellistart ， 选 择Sample Tune

8、and Develop Method ，ES+ 单击 Start 图标 ，消灭Intellistart 自动调谐编辑窗口， 选择 Switch to Advanced mode ， 输 入 Compound name ( 化 合 物 名 称 ) ， Molecular Mass/Formula ( 分子量或分子式 ) Adduct A+ M+H + ， 选择Load Existing Sample Tune , 在 Sample Tune Name 方框后的“。”处调用开头保存的调谐文件，在 Develop MRM Method 前的方框打钩，并在方框出输入 MRM 方法的文件名 ，路径为已建

9、的项目下。在 Print Report 前方框打钩， Cone Voltage ，Collision Energy 处为默认值， Fluidics 下的 Flow Path 选择 Combined 模式， Sample Reservoir 和 Sample Flow Rate 参数与 Fuldics 下Combined 模式下的进样参数保持全都。单击右边的 Start 开头自动调谐。调谐成功，会有绿勾消灭 ，查看 intellistart 报告。3.4.3 查看 intellistart 中自动生成的质谱方法： 从 MassLynx主窗口， 单击 MS Method ， 消灭 MS Metho

10、d 编辑对话框, 选择File open, 选择 Intellistart 中保存的质谱方法的文件，双击方法, 如觉察自动调谐生产的质谱方法中局部参数有误，则可以在Channels 窗口手动修改参数，填写 relentinon window 中的 end 时间 ，此时间必需与液相色谱方法运行时间保持全都，选择Auto Dwell,单击OK，点击 File Save As, 保存质谱方法文件。3.5 建立液相方法3.5.1 编辑液相方法 在液相方法编辑窗口，单击 Inlet，输入溶剂名称，run time 及梯度洗脱程序，梯度洗脱程序中最终阶段时间必需与 run time 符合，单击 OK, 选

11、择 File Save As 保存方法 ，单击Load Method ，平衡液相。3.5.2 建立样品列表 在 Masslynx 主窗口，选择 File New 建立一个空白的表 samplelist。输入文件名 File Name ，样品信息File Text ，双击 MS File ，选择质谱方法 ，双击 Inlet File, 选择液相方法 ，在 Bottle 中输入样品瓶的位置 ，在 Inject Volume 中输入进样体积，可右键 Add, 增加样品表的行数，保存样品表： File Save As 。3.6 数据采集和处理3.6.1. 选中要采集的样品， 单击 Run Start

12、, 选择 Acquire Sample Data only,，单击OK 开头进样并采集 。3.6.2 在采集过程中，可查看色谱图，点击 Chromatogram 窗口 ，点击 Real-time Update icon . 假设不能见整个 TIC 图，单击 Default Range 图标。假设方法中包括多个通道，可通过 Display Mass 查看 假设方法中包括多个检测器或多个 Function,可通过 Display TIC 查看3.6.3 处理多个 Function 的数据 假设质谱方法中有多个Function，如有三个 Function，如想看其次个 Function，MS Sca

13、n 的数据。3.6.3.1 在色谱图窗口，点击 Display TIC，选中 MS Scan ，选择Add trace ，单击 OK。3.6.3.2 如想查其次个 Function, Daughter Scan 质谱图 ，在色谱图中，选择 Display TIC, 选择 ScanWaveDS Add trace ，单击OK。3.6.3.3. 选择 Process Combine spectra. 分别用右键输入信号和本底噪音.单击 OK. 得到 Daughter Scan 的质谱图， 单击Process Smooth ，单击 OK。3.7 数据处理-外标定量法3.7.1 在 Masslynx

14、主页面单击 Targetlynx/Edit method，消灭定量方法编辑对话框， 单击建方法图标，建一个定量方法。3.7.2 单击 Add new compound (添加的化合物)图标，添加一个的化合物。3.7.3 单击菜单栏 update,选中 Quantitation Ion 和 Compound Name前面打勾 在 Masslynx 主页面，翻开中等偏下低浓度标准品的色谱图，Display/Mass chromatogram 选出要定量的化合物的离子对， 一般强度高的化合物用来做为定量离子，另一个离子对则作为确证离子，用鼠标右键在定量离子对色谱图上拉一下，则compound nam

15、e, Acquisition Function Number, Quantification Trace, Predicted Retention Time 和 Retention Time window 将自动输入到定量方法中。留意：在色谱图上拉的时候，要遵循两个原则，拉的位置要以色谱峰的峰尖左右对称，拉的宽度要超过峰的起点和终点。3.7.4 单 击 工 作 曲 线 图 标 ， 在 工 作 曲 线 设 置 页 面 ， 填 入Concentration Units: 浓度单位， 例如 ng/ml, ug/kg ， ppb, ppm 等 。 Concentration of Standard:

16、Level 选 择 Conc.A 。Polynomial Type 选择 Linear. 可依据自己行业的规定 Calibration Origin_ 选择 exclude( 排解原点) ， include( 包含原点)，force(强制过原点) Weithting Function( 权重)_1/x 依据自己行业规定 Propagate Calibration Parameters_假设全部的化合物均用一样的工作曲线的参数，选 Yes3.7.5 翻开积分参数列表，选中 Apex Track Enabled 打勾，YES ， IntegrationWindow Extent 输入 2 ， 选中

17、 Propagate Integration Parameters ( 打勾)，假设色谱峰并不是很对称的色谱图，可先在色谱图上先设定参数，积分，好积分参数满足之后， process/integrate/copy ,在 Targetlynx 方法中 Edit/Past 就可将其粘贴到 Targetlynx 方法中。建议用 Apex Track 积分方法， Smooth 方法建议用 smooth iteration 1,smooth width 2。重复上面的过程，把其他几个化合物的信息全部参加，保存方法： File/Save As, 保存到当前工程的 MethDB 文件夹中，正确的 sample

18、list 表格模板，除了前面进样时的选项之外，还要有 sample type, ConA, 等选中要处理的样品，单击 Process Samples，消灭以下图的对话框，确保选中,Integrate 、sample ， calibrate Standard ， Quantify Sample,选择刚刚编辑的 Targetlynx 方法，单击 OK 后，消灭定量结果对话框。可依据自己的需要，用鼠标右键， Chang Column Order 来增加或削减 Summary 中的选项。3.8 关机程序3.8.1 日常关机：3.8.1.1 假设流淌相中有缓冲盐必需先将缓冲盐换成水，灌注 2 分钟，流速

19、设为 0.2ml/min，80%水相，冲洗至少 30 分钟，换成 80%有机相，冲洗至少 20 分钟，停流速，水相，冲洗至少 30 分钟，换成80%有机相，冲洗至少 20 分钟，停流速，柱温为室温。3.8.1.2 关质谱：主界面 mass tune 或者电脑下面仪器图标 界面左侧偏上 fluidics-flow state 选择为 waste、关氩气，mass tune 界面或者电脑下面仪器图标工具栏第 6 个 关高压 mass tune 界面右下角 等待去溶剂气温度降低至 100 度以下 mass tune 界面或者电脑下 面 仪 器 图 标 左 侧 偏 上 。 ES+source-temp

20、erature-desolvation 关氮气 ，点击氮气发生器开启开关。3.8.2 彻底关机3.8.2.1 先完成日常关机3.8.2.2 泄真空: tune vacuum vent-yes 等待涡轮分子泵转速降到 10 以下 ，masslynx 主界面 -左侧 instrument-Mass tune-界面左侧偏上 diagnostics-vacuum-source turbo speed%3.8.2.3 退出软件，其他界面先退出，主界面最终退出3.8.2.4 关质谱电源 关全部 UPLC 电源，计算机电源 ，仪器三个电源挨次无所谓，关氮气发生器，氩气。3.8.2.5 假设有UPS，关闭UP

21、S 电源，计算机电源。4 日常维护、保养及留意事项4.1 仪器室要保持干净、干净、无尘；配套设施布局合理。4.2 仪器室温度应相对稳定，一般应掌握在 20-25，保持恒温；相对湿度最好为 50-70%，室内应备有温度计和湿度计，一般承受空调和吸湿机调整温度和湿度。4.3 气压过滤机械泵油 ，停顿样品采集、停顿流淌相、关闭高压、关闭全部气流，关闭离子源内的真空隔离阀。用一字镙丝刀顺时针方向拧开机械泵上的 Gas Ballast 阀四分之一圈，运行 30 分钟后再把Gas Ballast 阀旋转到原来关闭的位置。对于 ESI 源，至少每星期做一次，对于 APCI 源，每天做一次。4.4 开高压之前

22、肯定要先开氮气，关氮气之前肯定要先关高压。4.5 ESI 离子化与溶剂亲热相关，在使用某些溶剂和添加物需要留意以下几个方面：三氟乙酸 TFA多用于蛋白质和多肽分析，但对ESI 离子化有抑制效应；三乙胺TEA在 m/z 102 处有较强的M+H+ 峰，有可能会抑制某些碱性化合物在正离子 ESI 条件下的离子化，也有可能会增加某些碱性化合物在负离子 ESI 条件下的响应；4.6 要避开使用非挥发性的盐 (phosphate, borate, citrate,etc.)；外表活性剂、清洁剂和去污剂 (会抑制离子化)；以及无机酸(sulphuric acid, phosphoric acid etc.

23、)等。4.7 连接 UPLC 泵、色谱柱、注射泵以及 ESI 探头时，要将仪器置于standby 状态。4.8.当转变区分率的时候，仪器的质量数也会有稍微的偏移，所以在不同区分率的条件下，应当做质量数校正。4.9 样品贮存在塑料离心管中，其中的添加剂很简洁混入，尤其是被有机溶剂浸泡时间较长时，会产生干扰物信号。4.10 工作站计算机不要安装与仪器操作无关的软件，要常常清理计算机磁盘碎片，定期查杀病毒，定期备份试验数据。4.11 仪器应定期检查，并有专人治理，负责维护保养及清洁。4.12 试验完毕要清洗进样针、进样阀等，用过含酸的流淌相后，色谱柱、离子源都要用甲醇/水冲洗，延长仪器寿命。4.13 定期清洗样品锥孔：关闭隔断阀，取下样品锥孔，先用甲醇： 水：甲酸45：45：10的溶液超声清洗 10 分钟，然后在分别用超纯水和甲醇各溶液超声清洗 10 分钟，待晾干后再安装到仪器上。当灵敏度下降时，需要清洗 Source、二级锥孔和六级杆。4.14 定期每星期检查机械泵的油的状态，假设觉察浑浊、缺油等状况，或者已经累积运行超过 3000 小时，要准时更换机械泵油。5 支持性文件 Waters Xevo-TQ-Smicro 液质联用仪使用手册。