WB标准protocol.docx

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1、模拟试卷成功完成 Western Blot 检测，必需满足 4 个条件：1. 凝胶洗脱：转移期间蛋白质必需从凝胶中洗脱出来，假设蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进展分析2. 吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必需吸附到膜上，假设蛋白不吸附，将无法在膜上进展分析3. 处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必需保持吸附在印迹膜上4. 处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必需能够与检测试剂接触，假设蛋白质被掩盖则无法检测成功进展 WB 检测，则设置适宜正确的比照是必不行少的，只要正确设置了这些比照，即可快速和准确的找到 WB 的问题所在，并保证明验结果的准确性和特异性！一般需要设置的比照方下：

2、阳性比照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率 阴性比照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性 二抗比照：不加一抗，用于检测二抗的特异性 内参比照：检测标本的质量和二抗系统 空白比照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果WB 检测根本过程1、猎取细胞或组织裂解物1) 依据检测蛋白的位置选择适宜的裂解 buffer：蛋白位置推举 buffer习题集全细胞胞浆可溶性蛋白 胞浆骨架结合蛋白 膜蛋白NP-40 or RIPATris-HCl Tris-TritonNP-40 or RIPA核蛋白RIPA or 核蛋白提取试剂盒线粒体蛋白RIPA or 线粒体分别试

3、剂盒亦可购置商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量2) 选择适宜的蛋白酶抑制剂，避开蛋白降解，从而保证检测的准确性！2、蛋白定量常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或 BCAassay。定量后，可依据状况将标本保存在-20C /-80C 备用，进展免疫沉淀IP或者直接进展电泳分别蛋白3、电泳分别蛋白质依据待测蛋白状态确定电泳条件：待测蛋白状态凝胶条件上样 buffer蛋白分子量kDa凝胶浓度Reduced - Denatured复原，变性含 -巯基乙醇或 DTT，含 SDS Reduced -Native复原，不变性含 -巯基乙醇或 DTT，不含 S

4、DS Oxidized - Denatured不复原，变性不含 -巯基乙醇或 DTT，含 SDS Oxidized - Native不复原，不变性不含 -巯基乙醇或 DTT，不含 SDS 依据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度电泳 buffer含 SDS不含 SDS含 SDS不含 SDS4-402012-451510-7012.515-1001025-20084、转膜蛋白结合力量100-200ug/cm2适用于 SDS80-100ug/cm2存在时与蛋白结合400ug/cm2适用染色方法胶体金、丽春红、酰胺黑、印胶体金、丽春红、酰胺不能用阴离子染料度墨汁、考马斯亮兰黑、印度墨汁适用检测方法显色法、

5、化学发光、荧光、放显色法、化学发光、荧显色、化学发光、放射射性、化学荧光、快速免疫检光、放射性测性一般蛋白 WB、糖蛋白检测、一般蛋白 WB、氨基酸低浓度小分子蛋白、适用范围蛋白质测序、氨基酸分析、重分析、重复 检测。酸性蛋白、糖蛋白、蛋复检测0.1um 膜适用于 7kDa白多糖、核酸检测常价格高以下蛋白较低用低依据不同的检测目的和待测蛋白的特性，选择适宜的膜类型。常用的转移膜类型有：PVDF 膜、硝酸纤维素膜NC 膜和尼龙膜，其中PVDF 和 NC 膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：PVDF 膜NC 膜尼龙膜灵敏度和区分率高高高背景低低较高机械强度强干的膜易脆软而结实溶剂抗性强差

6、差使用前是否需要浸润100%甲醛润湿缓冲液润湿缓冲液润湿5、封闭去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含 BSA 或者脱脂奶粉的 TBST 或 TBS6、一抗孵育一抗的选择成功与否，是整个 WB 试验成功的关键：选择一抗有以下几个留意点： 选择适合检测标本种属的一抗说明书有验证 选择适用于 WB 试验方法的一抗说明书有验证 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体一抗的保存和使用： 依据说明书的要求条件进展抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入 -20度保存，确定避开反复冻融。 抗体的工作液最好现配现用，在 4 度保存最好不要超过 2 周 依据说明书推举浓度使用 TBST

7、 稀释一抗。由于试验室条件和检测方法等的差异，说明书推举的稀释比例只作参考，需要在说明书推举的浓度周边 进展多个浓度梯度的试验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进展试验。假设说明书没有推举浓度，可进展多个稀释比例进展摸索最正确稀释度1:100-1:3000。孵育条件：推举4C 孵育过夜一般大于18 个小时，依据抗体亲和力不同孵育时间有所区分内参的选择和使用：WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准！WB 常用内参及其技术参数：内参名称beta-actin分子量大小43kDa适用范围胞浆和全细胞GAPDH30-40kDa胞浆和全细胞Tubulin55kDa胞浆和全细胞VCDA1/Porin31kDa

8、线粒体COXIV16kDa线粒体TBP38kDa细胞核7、二抗孵育依据说明书推举浓度使用 TBST 稀释一抗。假设说明书没有推举浓度，可进展多个稀释比例进展摸索最正确稀释度1:1000-1:20000。孵育条件一般为室温 1-2 小时8、底物孵育选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节约抗体用量9、结果分析和检测凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片WB 过程中常见的问题及可能缘由分析问题可能缘由验证或解决方法膜没有完全均 使用 100% methanol匀湿透浸透膜靶蛋白分子量 选择小孔径的膜，缩短小于 10,000转移时间可尝试使用其他缓冲靶蛋白等电点 液 如 CAP

9、S缓 冲 液等于或接近转 pH10.5)或使用低 pH转膜不充移缓冲液pH 值值缓冲液如乙酸缓冲分液过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分别，从而沉淀在凝胶中，同时甲醇浓度过高 会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异Note：从封闭开头，每步之间都需要用 TBST 进展洗涤，3 次，每次 5min WB 常见问题及技术要点：转移时间不够丙醇代替对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转Thick gel移时间膜没有完全均 使用 100% methanol匀湿透浸透膜洗膜不充分阻断不充分增加洗液体积和洗涤次数增加封闭液孵育时间， 或者提高温度。选择适宜的封闭试剂脱

10、脂奶粉，BSA，酪蛋白等背景高二抗浓度过高 降低二抗浓度检测过程中膜 保证充分的反响液，避枯燥免消灭干膜现象曝光过度缩短曝光时间检测抗体与阻断蛋白抗体与阻断蛋白有穿插反响的穿插反响性，选择无穿插反响的封闭剂。洗涤液中参加 Tween-20 可削减穿插反响抗体染色不充 增加抗体浓度，延长孵分育时间直接将酶和底物进展混合，假设不显色则说酶失活 明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物设置阳性比照，假设阳性比照有结果，但标本标本中不含靶 没有则可能是标本中没有阳性蛋白或靶蛋白 不含靶蛋白或靶蛋白条带含量太低含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的缘由。一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与

11、酶试剂不匹配系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性选择在有效期内抗体；一抗失效并选择现配现用的工作液HRP 抑制剂所用溶液和容器中避开含有叠氮化钠抗体染色不充 增加抗体浓度，延长孵分育时间直接将酶和底物进展混合，假设不显色则说酶活性降低明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物标本中靶蛋白 增加标本上样量。含量太低洗膜过度缩短洗涤时间有阳性条HRP 抑制剂带， 但条所用溶液和容器中避开含有叠氮化钠带比较弱选择在有效期内的抗 抗体活性降低 体，工作液现配现用，避开长时间放置蛋白转移不充 见上述分削减封闭剂的量或缩封闭过度短时间；换用不同封闭剂类型曝光时间过短 延长曝光时间所用

12、溶液和容器中避HRP 抑制剂免含有叠氮化钠增加一个比照：不加一抗，其他操作过程不二抗的非特异 变，即可验证背景是否性结合由二抗系统来源。选择其他二抗特异性更强的，只针对重链的条带位置一抗的特异性 大小不够使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性不对； 或使用颖制备的标本，有非特异蛋白降解并使用蛋白酶抑制剂性条带二聚体或多聚 增加蛋白质变性过程体存在及强度降低抗体一抗、二抗 抗体浓度过高 浓度，可以削减非特异性条带蛋白上样量过 降低上样量大背景有斑集体封闭剂中有聚 使用前过滤封闭试剂点HRP 耦联二抗 过滤二抗试剂，去除聚中有聚拢体集体膜上消灭反像 暗背景上白HRP 含量过高 降低酶联二抗的浓度色带-整理于 2015.12.13冉