DB32_T 4368-2022 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 时间分辨荧光免疫层析定量法.docx

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1、ICS65.120CCSB4632江苏省地方标准DB32/T43682022饲料中玉米赤霉烯酮的测定时间分辨荧光免疫层析定量法DeterminationofzearalenoneinfeedsTimeresolvedfluorescenceimmunochromatographyquantitativemethod2022-09-06发布2022-10-06实施江苏省市场监督管理局发布目次前言.III1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14原理.15试剂和材料.26仪器和设备.37样品制备.38样品前处理.39标准曲线制定.310检测过程.311结果计算.412方法性能.4DB32/T

2、43682022前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省畜牧业标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位：江苏省家禽科学研究所、上海雄图生物科技有限公司。本文件主要起草人：施寿荣、汪劲能、张鹏飞、肖蕴祺、胡艳、邵丹、沈一茹、张珊、王强。IIIDB32/T43682022饲料中玉米赤霉烯酮的测定时间分辨荧光免疫层析定量法1范围本文件规定了饲料中玉米赤霉烯酮测定的原理、试剂和材料、仪器和设备、样品制备、样品前处理、标准曲线制定、检测过程、结果计算和方法性

3、能。本文件适用于饲料原料、浓缩饲料、配合饲料、精料补充料等试样中玉米赤霉烯酮的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1时间分辨荧光微球timeresolvedfluorescentmicrosphere形状为球形，直径在几纳米至几十微米之间，微球表面或内部负载有荧光物质，在受到

4、一定的能量激发时能够发出荧光的微粒，比普通荧光半衰期长。微球表面修饰有合适密度的羧基或其它功能基团，用于与蛋白或抗体的共价偶联；微球所包理的镧系稀土元素经过了鳌合，无需解离增强步骤。3.2时间分辨荧光免疫层析定量法timeresolvedfluorescenceimmunochromatographyquantitativemethod用时间分辨荧光微球标记抗原或抗体制作层析试纸条，根据时间分辨荧光微球的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨的方法，可有效地排除非特异性荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。4原理试样中玉米赤霉烯酮与时间分辨荧光微球标记的特异性抗

5、体结合后，抑制了层析过程中标记抗体与试纸条T线玉米赤霉烯酮抗原的免疫反应，使T线时间分辨荧光强度降低，质控线C线结合的荧光1DB32/T43682022标记物浓度与样品中玉米赤霉烯酮的浓度无关。层析结束后，通过仪器检测计算试纸条T线和C线的时间分辨荧光强度比值和设定的标准曲线进行准确定量分析。5试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。5.1十二水磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）。5.2磷酸二氢钾（KH2PO4）。5.3氯化钾（KCl）。5.4氯化钠（NaCl）。5.5盐酸（HCl）。5.6甲醇（CH3OH）。5.7蔗糖（C12H22O11）。5

6、.8吐温-20（C58H114O26）。5.9磷酸盐缓冲溶液：取2.178g磷酸氢二钠（5.1）、0.144g磷酸二氢钾（5.2）、0.12g氯化钾（5.3）、4.8g氯化钠（5.4），溶解于1L水中，用适量盐酸（5.5）调pH至6.87.2。5.10提取液：取800mL甲醇（5.6）用纯水定容至1L，用于样品提取。5.11稀释液：在1L磷酸盐缓冲溶液（5.9）中分别加入1.0g蔗糖（5.7）、2.0g吐温-20（5.8）混匀，用于样品上清的稀释。5.12玉米赤霉烯酮标准溶液：浓度50mg/L。5.13玉米赤霉烯酮标准储备液：取玉米赤霉烯酮标准溶液（5.12）1mL于2mL容量瓶中，用甲醇定容

7、，混合均匀，制备成浓度为25mg/L的储备液。5.14ID卡：用于存储标准曲线和项目信息，直接插入荧光免疫定量分析仪使用。5.15玉米赤霉烯酮时间分辨荧光免疫层析定量试纸条（图1）：灵敏度不低于20g/kg。试纸条结构图如下：图1玉米赤霉烯酮时间分辨荧光免疫层析定量试纸条结构示意图说明：结合垫包被荧光微球标记的玉米赤霉烯酮抗体，T线包被玉米赤霉烯酮封闭抗原，C线包被二抗。2DB32/T436820225.16阴性样本：玉米基质空白样本，玉米赤霉烯酮含量5g/kg。6仪器和设备6.1天平：感量0.01g，最大量程500g。6.2涡旋振荡器：0r/min2500r/min。6.3离心机：转速400

8、0r/min。6.4微量可调移液器：20L200L，0.1mL1mL。6.5干式恒温孵育器：37.02.0（不带鼓风）。6.6时间分辨荧光免疫定量分析仪：激发波长：365nm5nm、发射波长：615nm5nm，用于读取试纸条的荧光信号并自动计算定量的检测结果。7样品制备按GB/T14699.1取样，按照GB/T20195制样，备用。8样品前处理8.1称取1.0g0.02g样品于10mL离心管中，用移液器（6.4）加入5mL提取液（5.10），用涡旋振荡器（6.2）振荡提取5min，用离心机（6.3）4000r/min离心1min，上清备用；如果样品浓度过高，用提取液（5.10）稀释。8.2取1

9、00L样品提取液（8.1），加入到600L稀释液（5.11），混匀后待点样检测。9标准曲线制定9.1空白基质溶液制备：取10g阴性样品于100mL离心管中，加入50mL提取液（5.10），用涡旋振荡器（6.2）振荡提取5min，用离心机（6.3）4000r/min离心1min，上清备用。9.2分别吸取玉米赤霉烯酮标准储备液（5.13）0.000mL、0.004mL、0.010mL、0.020mL、0.060mL、0.120mL、0.200mL、0.300mL、0.400mL于5mL容量瓶中，用空白基质溶液（9.1）定容，分别相当于0ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、

10、300ng/mL、600ng/mL、1000ng/mL、1500ng/mL和2000ng/mL浓度标准工作溶液。9.3取100L标准工作液（9.2）分别加入600L稀释液（5.11），混匀后由低浓度到高浓度进行检测（10）。仪器软件可根据T线信号值与C线信号值的比值（T/C）和标准工作溶液浓度的自然对数值（Inc）建立标准曲线。9.4同批次试纸条只需建立一次标准曲线，将建立好的标准曲线与项目信息存储于ID卡中，便于样品随时随地检测。10检测过程10.1将干式恒温孵育器（6.5）开机，设置温度37，待温度升至37后方可使用。10.2时间分辨荧光免疫定量分析仪（6.6）预热5min后，插入试纸条所

11、对应的ID卡（5.14）。3DB32/T4368202210.3从铝箔袋中取出玉米赤霉烯酮荧光免疫定量检测试纸条（5.15），水平放置于干式恒温孵育器（6.5）。10.4用移液器（6.4）吸取100L经过前处理的待测样品（8.2）加入试纸条的加样孔中，盖上孵育器盖开始计时孵育6min。10.5孵育结束后将试纸条（5.15）插入荧光免疫定量分析仪（6.6）的试纸条插槽中，点击读数。11结果计算样品中玉米赤霉烯酮含量以质量分数X计，数值以微克每千克（g/kg）表示。仪器按如下公式自动计算。X=PVn1000m1000(1)式中：P从标准曲线上查得的待测液中玉米赤霉烯酮含量的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V样品待测液体积的数值，单位为毫升（mL）；n样品稀释倍数；m样品质量的数值，单位为克（g）。计算结果保留至小数点后两位。12方法性能方法的检出限为5g/kg，定量限为20g/kg，检测线性范围为20g/kg2000g/kg。重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的20%。AA4