DB65∕T 4669-2023 小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重实时荧光定量PCR检测方法(新疆维吾尔自治区).pdf

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1、ICS 65.020.30CCS B 41B65新 疆维吾 尔自治 区地方 标 准DB 65/T 46692023小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重 实时荧光定量PCR检测方法Detection method of peste des petits ruminants virus and orf virus by duplex real-time fluorescence quantitative PCR2023-07-20 发布2023-09-20 实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局 发 布JDB 65/T 466920231/1刖 3本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第

2、1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件由新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心提出。本文件由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局归口并组织实施。本文件起草单位：新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心、北京亿 森宝生物科技有限公司、新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）、新疆生 产建设兵团畜牧兽医工作总站。本文件主要起草人：马晓艳、孙雨、王文、刘亚涛、惠志华、王新杰、夏俊、马伟、李舵、苏贵成、苏晓慧、薛文、秦菊、努尔麦麦提阿穆提、居马别克夏拉巴依、马亚珍、符玉涓、艾日登才次克、李 璐、张丹、沙那瓦尔塔希、任娟、美热木古丽巴依待拉提、乌那尔汗吉斯

3、汗、孙晓明、冯冰、陈玲、高姗姗、颜成旭、陆桂丽、茹仙古丽木明、加米拉、加伊娜古力、特列克库拉别克。本文件实施应用的疑问，请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局（乌鲁木齐市新华南路408号、新疆 维吾尔自治区动物疾病预防控制中心（新疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区蓝天路268号）、中国动物疫 病预防控制中心（北京市大兴区天贵大街17号）、北京亿森宝生物科技有限公司（北京市北京经济技术开 发区（通州）科创东五街2号）、新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）（新 疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区冬融街726号）、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站（新疆乌鲁木齐 市米东区米东南路2188

4、号红光雅居小区7号公建楼）、新疆维吾尔自治区市场监督管理局（新疆乌鲁木齐 市新华南路167号）。对本文件的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局（乌鲁木齐市新华南路408号、新 疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心（新疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区蓝天路268号）、中国动物 疫病预防控制中心（北京市大兴区天贵大街17号）、新疆维吾尔自治区市场监督管理局（新疆乌鲁木齐市 新华南路167号）。新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话：0991-8568089；传真：0991-8527722；邮编：830004新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心联系电话：0991-4626082；传真：0991-

5、4641491；邮编:830013中国动物疫病预防控制中心联系电话:010-59198917,传真：010-59198917；邮编：100125北京亿森宝生物科技有限公司联系电话：010-67832149,传真：010-65502970；邮编：100176 新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话：0991-2818750；传真：0991-2311250；邮编：830004IDB 65/T 46692023小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重 实时荧光定量PCR检测方法1范围本文件规定了小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重实时荧光定量PCR检测方法的试剂和引物、仪器用具与耗材、实验步骤、检测结果

6、的判定。本文件适用于新疆小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒的核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4试剂和引物处规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验室用水应符合GB/T 6682的规定执行；pH 7.4磷 酸盐缓冲液（PBS）溶液配制应符合GB/T 27982的规定；DNA/RNA提取相关试剂见附录A,实时荧光PCR 检测引物探针见附录B。5仪器用具与耗材高速冷冻离心机、电子

7、天平、高通量核酸提取仪、荧光定量PCR仪、-20低温冰箱和-80超低温 冰箱、高通量研磨仪、pH计、高压灭菌锅、生物安全柜、微量振荡器、瞬时离心机、可调移液器（10包，20吐，100此，200吐，1000（iL）和对应的无RNA灭菌可调移液器吸头、无RNA灭菌离心管、研磨管、吸附柱等。6操作步骤6.1 样品的采集、存储6.1.1 拭子样品选择处于发热期（体温40 C41）、排出脓性、浆液性眼分泌物、出现口腔溃疡症状的活畜采 集样品，采集眼结膜拭子2个、鼻粘膜拭子2个，分别置于4 c条件下保存的1000此灭菌磷酸盐缓冲液 DB 65/T 46692023(0.01 mol/L pH 7.4,PB

8、S)中。将含有渗出物的棉拭子在微量振荡器上充分混合，捻动、挤压干后弃 去拭子。12000 r/min离心5 min,吸取上清300凡于1.5 mL灭菌离心管中，编号备用。6.1.2全血样品按照常规方法抽取2 mL3 mL血液，放置含有EDTA-Na?抗凝剂的5 mL试管中，编号备用。6.1.3组织样品选择刚被扑杀或者死亡时间不超过24 h的病畜采集组织样品。无菌采集肠系膜和支气管淋巴结各3 个4个，脾、胸腺、肠粘膜和肺组织各约25 g50 g,分别置于50 mL离心管或密封袋中。每份组织分 别从三个不同位置取样，称取样品约1g,用手术剪剪碎的样品混匀后取0.1 g装入研磨管，于高通量研 磨仪中

9、研磨，加入1.5 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBS继续研磨，待匀浆后转至1.5 mL灭菌离心管中，12000 r/min,离心2 min,取上清300比，编号备用。拭子、全血、组织样品的采集与处理均应符合GB 19489 的规定。6.2样品存储6.2.1拭子样品样品采集后，放置有冰盒的采样箱里送至实验室，在24 h内进行检测。6.2.2组织样品样品采集后，储存应置于-70 冰箱。6.3 DNA/RNA 的提取6.3.1取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600此，充分颠倒混匀，室温静置3 min5 min。6.3.2 将液体吸入吸附柱中，12000 r/min离心

10、30 s。6.3.3弃去收集管中液体，加入600此洗涤液，12000 r/min离心30 s。6.3.4重复上述步骤6.3.3。6.3.5弃去收集管中液体，12000 r/min离心2 min,以除去残留的洗涤液。6.3.6将吸附柱移入新的1.5 mL无菌离心管中，向柱中央加入洗脱液60此。6.3.7室温静置2 min,12000 r/min离心1 min,离心管中液体为核酸模板。得到的核酸模板尽量在 2 h内进行实时荧光扩增，若需长时间保存须放置-70 冰箱，但应避免反复冻融。6.3.8若使用核酸提取仪提取核酸，则按DNA/RNA提取试剂盒说明书进行操作。6.4试剂准备6.4.1试验前20

11、min从-20 冰箱中取出试剂盒等相应试剂，使试剂完全溶解。6.4.2每个检测反应体系总量为15血：14此的荧光PCR反应液，1也的酶混合物。6.4.3盖紧PCR反应管盖后将PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-20。冰箱冷冻保存。6.5加样(样本准备区)6.5.1分别向上述PCR反应管中加入已提取样本核酸模板各5pL,阳性对照和阴性对照核酸模板各加 5pL,记录加样顺序。2DB 65/T 466920236.5.2盖紧管盖，瞬时离心30 s,PCR样本管转移至扩增区。6.6 荧光PCR检测6.6.1开机预热，检查仪器性能。6.6.2将PCR反应管放在样品槽中相应位置，填写原始记录单。6

12、.6.3 PCR 扩增6.6.4设置扩增参数，PPRV-FAM通道采集荧光信号；ORFV-HEX通道采集荧光信号。荧光PCR反应程序 为：45 10 min,1 个循环；95 10 min,1 个循环；95 15 s,60 45 s,40 个循环，在每 次循环的退火时收集荧光。检测过程中应分别设立阴性对照、阳性对照。以含小反刍兽疫病毒、羊传染 性脓疱病毒阳性质粒作为阳性对照，同时以双蒸水代替模板作为阴性对照。分别提取样品和对照品的 DNA/RNA进行实时荧光PCR检测。检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。6.7 结果判定6.7.1结果分析条件设定直接读取检测结果。合理调整阈值线，阈值设定

13、可根据仪器噪音情况进行调整。6.7.2对照结果的判定6.7.2.1阴性对照:无扩增曲线且Ct值38或无Ct值。6.7.2.2阳性:Ct值W30,有明显指数增长，呈典型的S型曲线。6.7.2.3以上:Ct值W30,有明显指数增长，呈典型的S型曲线。.7检测结果的判定7.1 阳性若被检样本的PCR反应体系通道出现2条典型扩增曲线，且Ct值W35,则判定样本中同时存在小反刍 兽疫病毒和羊传染性脓疱病毒核酸。若在“FAM”标记下出现典型的扩增曲线且Ct值W35,则判定样本中 小反刍兽疫病毒核酸阳性。若在“HEX”标记下出现典型的扩增曲线且Ct值W35,则判定样本中羊传染性 脓疱病毒核酸阳性。小反刍兽疫

14、病毒与羊传染性脓疱病毒双重实时荧光定量PCR检测典型扩曲线示意图 见附录B.2。7.2 阴性若被检样本的PCR反应体系通道无典型扩增曲线，且Ct值38或无Ct值，则判定样本小反刍兽疫病 毒和羊传染性脓疱病毒核酸阴性。7.3 可疑若被若被检样本的PCR反应体系通道出现典型扩增曲线，且Ct值在3538之间，此时应对样本进行 重复检测。如重复实验结果Ct值仍在3538之间，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。3DB 65/T 46692023附录A(规范性)标准中涉及的试剂配制A.3裂解液A.1PH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)氯化钠 8.00 g氯化钾 0.20 g二水合磷酸氢二钠 1.44

15、g磷酸二氢钾 0.24 gHC1 调pH至7.4灭菌双蒸水 加至1000 mL在1.034x1()5 pa高压下蒸汽灭菌20 min。保存于室温。A.2EDTA-Na2(0.5 mol/L,pH=8.0)溶液配制EDTA-Na2 18.61 g灭菌双蒸水 80 mL氢氧化钠 调pH至8.0灭菌双蒸水 加至100 mLA.4洗涤液异硫氟酸服 236.40 g氯化钠 11.70 g三羟甲基氨基甲烷 9.46 g0.5 mol/L乙二镂四乙酸二钠溶液(EDTA-Na2)(pH=8.0)40 mL灭菌双蒸水 加至2000 mL磷酸氢二钠 143.20 g磷酸二氢钾 62.40 g氯化钠 18.00 g

16、灭菌双蒸水 加至2000 mL再加入6000 mL无水乙醇，充分混匀。A.5洗脱液磷酸氢二钠 143.20 g磷酸二氢钾 62.40 g灭菌双蒸水 加至2000 mL4DB 65/T 46692023附录B（规范性）实时荧光PCR检测B.1引物序列根据已报道的PPRV和0RFV的基因组序列各设计1套用于特异性扩增的引物和探针，具体引物信息与 基因片段大小见表B.1和B.20表B.1小反刍兽医病毒引物序列及目的片段长度引物引物序列（5,一 3，）预期片段大小/bp正向引物CACAGCAGAGGAAGCCAAACT115反向引物TGTTTTGTGCTGGAGGAAGGA引物探针FAM-CTCGGA

17、AATCGCCTCGCAGGCT-BHQ1表B.2羊传染性脓疱病毒引物序列及目的片段长度引物引物序列（5,一 3，）预期片段大小/bp正向引物TTGCACATGTCCGTGAAGAAGT64反向引物AGGCGGTGGAATGGAAAGAC引物探针HEX-CGGGTAGTCTTTGGAGTC-TAMRAB.2荧光PCR检测典型扩增曲线示意图小反刍兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重实时荧光定量PCR检测典型扩曲线示意图见B.1。题期也果渥标引序号说明：1一一小反刍兽疫病毒阳性对照;2一一羊传染性脓疱病毒阳性对照；3一一小反刍兽疫病毒阳性样品;5DB 65/T 466920234一一羊传染性脓疱病毒阳性样品；5一一阴性对照。图B.1荧光PCR检测典型扩增曲线示意图6