反向液相色谱的工作原理.docx

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1、谁能告知我一下反向液相色谱的工作原理吗？它与正向的有什么区分吗？高效液相色谱法按分别机制的不同分为液固吸附色谱法、液液安排色谱法正相与反相、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。1. 液固色谱法 使用固体吸附剂，被分别组分在色谱柱上分别原理是依据固定相对组分吸附力大小不同而分别。分别过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧 化铝，粒度 510m 。适用于分别分子量 2001000 的组分，大多数用于非离子型化合物， 离子型化合物易产生拖尾。常用于分别同分异构体。2. 液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体外表，或化学键合于担体外表而形成的固定相，分别原理是依据被分别的组

2、分在流淌相和固定相中溶解度不同而分别。分别过程是一个安排平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流淌相必需预先用固定相饱和，以削减固定相从担体外表流失；温度的变化和不同批号流淌相的区分常引起柱子的变化；另外在流淌相中存在的固定相也使样品的分别和收集简洁化。由于涂布式固定相很难避开固定液流失，现在已很少承受。现在多承受的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流淌相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法 承受极性固定相如聚乙二醇、氨基与腈基键合相；流淌相为相对非极性的疏水性溶剂烷烃类如正已烷、环已烷，常参与乙醇、异丙醇、四氢呋

3、喃、三氯甲烷等以调整组分的保存时间。常用于分别中等极性和极性较强的化合物如酚类、胺类、羰基类及 氨基酸类等。反相色谱法 一般用非极性固定相如 C18、C8；流淌相为水或缓冲液，常参与甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调整保存时间。适用于分别非极性和极性较弱的化合物。RPC 在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC 应用的 80%左右。随着柱填料的快速进展，反相色谱法的应用范围渐渐扩大，现已应用于某些无机样品或 易解离样品的分析。为把握样品在分析过程的解离，常用缓冲液把握流淌相的pH 值。但需要留意的是，C18 和C8 使用的pH 值通常为 2.57.528，

4、太高的 pH 值会使硅胶溶解， 太低的pH 值会使键合的烷基脱落。有报告商品柱可在pH 1.510 范围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法 反相色谱法固定相极性 高中 中低流淌相极性 低中 中高组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界限如氨基键合固定相。3. 离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架， 在外表未端芳环上接上羧基、磺酸基称阳离子交换树脂或季氨基阴离子交换树脂。被分别组分在色谱柱上分别原理是树脂上可电离离子与流淌相中具有一样电荷的离子及被 测组分的离子进展可逆交换，依据各离子

5、与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分别。缓冲液常用作离子交换色谱的流淌相。被分别组分在离子交换柱中的保存时间除跟组分别子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流淌相的 pH 值和离子强度影响。pH 值可转变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流淌相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。4. 离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是依据被测组分别子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分别效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用

6、的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用ODS 柱即C18，流淌相为甲醇-水或乙腈-水，水中参与 310 mmol/L 的离子对试剂，在确定的pH 值范围内进展分别。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流淌相组成及其pH 值、离子强度有关。5. 排阻色谱法 固定相是有确定孔径的多孔性填料，流淌相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流淌相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻力气的

7、差异而完成分别。常用于分别高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。色谱法的根本原理利用样品混合物中各组分理、化性质的差异，各组分程度不同的安排到互不相溶的两相中。当两相相对运动时，各组分在两相中反复屡次重安排，结果使混合物得到分别。两相中，固定不动的一相称固定相；移动的一相称流淌相。分类：依据流淌相分以气体作流淌相气相色谱固定相为液体 气-液色谱固定相为固体 气-固色谱以液体作流淌相液相色谱固定相为液体 液-液色谱固定相为固体 液-固色谱当流淌相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体时超临界色谱依据固定相的附着方式固定相装在圆柱管中柱色谱固定相涂敷在玻璃或金属板上薄膜色谱平板色谱液体

8、固定相涂在纸上纸色谱平板色谱依据分别机理安排色谱样品组分的安排系数不同吸附色谱 样品组分对固定相外表吸附力不同体积排阻色谱利用固定相孔径不同，把样品组分按分子大小分开离子交换色谱不同离子与固定相商相反电荷间的作用力大小不同依据极性流淌相极性固定相极性-反相色谱流淌相极性固定相极性-正相色谱气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC 则适合于分析 那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。所以，HPLC 的应用范围已经远远超过气相色谱。一、吸附色谱adsorption chromatography又叫液固色谱法：流淌相是液体，固定相

9、是固体。分别原理：固定相是固体吸附剂，吸附剂是多孔性微粒物质外表有吸附中心。样品组分与流淌相竞争吸附中 心。各组分的吸附力气不同，使组分在固定相中产生保存时间不同和实现分别。固定相： 固定相通常是强极性的硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂。活性硅胶最常用。流淌相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃己烷、戊烷、庚烷等、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。应用： 对于极性，构造异构体分别和族分别仍是最有效的方法，如农药异构体分别、石油中烷、烯、芳烃的 分别。 缺点是简洁产生不对称峰和拖尾现象。二、安排色谱原理： 固定液机械的吸附在惰性载体上，样品分子依据他们在

10、流淌相和固定相间的溶解度不同，分别进入两相安排而实现分别。固定相：将一种极性或非极性固定液吸附在惰性固相载体上。如全多孔微粒硅胶吸附剂。依据极性不同分类：正相安排色谱固定相载体上涂布的是极性固定液；流淌相是非极性溶剂；可分立极性较强的水溶性样品； 弱极性组分先洗脱出来。反相安排色谱固定相载体上涂布的是非极性或弱极性固定液； 流淌相是极性溶剂；强极性组分先洗脱出来。液-液安排色谱固定相中的固定液体往往简洁溶解到流淌相中去，所以重现性很差，且不能进展梯度洗脱，已经不大为人们所承受。三、键合相色谱考虑安排色谱法中固定液的缺点，因此将各种不同的有机关能团通过化学反响共价结合到固定相惰性载体上，固定相就

11、不会溶解到流淌相中去了。键合固定相优点： 对极性有机溶剂有良好的化学稳定性 使色谱柱的柱效高、寿命长 试验重现性好 几乎适于各种类相的有机化合物的分别，尤其是k宽范围的样品 可以梯度洗脱依据极性不同分类：正相键合相色谱固定相极性流淌相极性固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。适于分别脂荣、水溶性的极性、强极性化合物反相键合相色谱固定相极性流淌相极性固定相：烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS 柱或C18 柱就是最典型的代表，其极性很小。适于分别非机性、弱极性离子型样品， 是当今液相色谱的最主要分别模式。正相HPLCnormal phase HPLC：是由极性固定相和非极

12、性或弱极性流淌相所组成的HPLC 体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流淌相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相HPLCreversed phase HPLC：由非极性固定相和极性流淌相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC 体系正好相反。其 代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS 柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流淌相是甲醇和乙腈。四、体积排阻色谱SEC，size exclusion chromatograghy又称凝胶色谱和分子筛色谱原理： 以多孔凝胶如葡萄糖，琼脂糖，硅胶，聚丙烯酰胺等作固定相，依据样品分子量大小到达分别目的。大分子

13、不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱； 小分子进入大局部凝胶孔洞，在柱中被强滞留，后被洗脱。依据样品性质分类：凝胶过滤GFC用于分析水溶性样品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核苷酸、多糖。凝胶渗透GPC用于分析脂溶性样品，如测定高聚物的分子量。SEC 主要依据分子量大小进展分别，因此与样品、流淌相间的相互作用无关。因此不采用转变流淌相的组成来改善分别度。五、离子交换色谱ion exchange chromatography, IEC分别原理：使用外表有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团如磺酸基和羧酸基可以用于阳离子的分别；带正电荷的交换基团如季胺盐可以用于阴离子的分别。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保存时间长短不同，从而被相互分别。