微生物基本操作规范高等教育生物学高等教育生物学.pdf

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1、培养基概念：是指以液体、半固体或固体形式，包含天然或合成成分，用于促进微生物的繁殖或保持其活力的物质组成。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。培养基的分类：按功能分类：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、特殊培养基。按物理性状分类：液体培养基、固体培养基、半固体培养基。液体培养基：所配制的培养基是液态的，这种培养基被用来微生物的增菌和生长状态观察。固体培养基和半固体培养基：在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂。固体培养基琼脂用量%，半固体

2、培养基琼脂用量在1%之间。固体培养基用作微生物的分离、鉴定、计数、保藏等。半固体培养基被用来观察微生物的动力和保藏菌种。今天给大家展示一下各种培养基的制备。培养基制备的基本过程：调配成分、溶解、校正 pH、分装、灭菌、质量检查和保存 所需物品：试剂、锥形瓶、天平、量筒、微波炉、高压蒸汽灭菌器、玻璃试管、玻璃平板、接种工具。（1）调配成分：在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水 200ml，1 蛋白胨，NaCL，牛肉膏（g/v），准确称取各种成分，使其充分混合。注意事项 培养基调配溶解：先在锥形瓶底加入少量的蒸馏水，再加入培养基成分，以防其粘在锥形瓶底部烧结。制备培养基时，除玻璃容器时，还可用铝锅

3、，搪瓷桶，但不可用铁，铜等容器，以免铁和铜离子进入培养基（培养基中铁离子含量超过 L时抑制细菌毒素的产生，含铜量超过 L时抑制细菌的生长）。培养基中若需加入染料，胆盐，指示剂等，应在校正 pH后加入。（2）溶解：将配制好的混合物微波炉加热 8min，使其完全溶解，补足失水。（3）校正 PH：不同的细菌需要在含不同 pH培养基上生长，一般将培养基的 pH调至。商品化的试剂配制后可省略该步骤，无需校正 PH。根据所需的培养基用途不同分别加入不同含量的琼脂，制成半固体培养基和固体培养基。（4）分装：（液体培养基、半固体培养基和部分固体培养基的分装可在灭菌钱也可在灭菌后）基础培养基：一般分装于容量为

4、500ml 锥形瓶灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；琼脂斜面：通常在融化后分装于试管，量约为试管高度的1/41/3，灭菌后倾斜放置。半固体培养基：分装量为试管容量的 1/41/3，灭菌后直立放置。液体培养基：分装量为管长的 1/5，灭菌后直立放置。（5）灭菌：分装好的培养基常用高压蒸气灭菌，条件为，温度 1211520min；于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加

5、入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培含糖培养基以，1015min 为宜，以免破坏糖类物质；不耐高热的物质配制成的培养基，常用流通蒸气灭菌或滤过除菌。琼脂平板制备：先将灭菌琼脂融化后冷却至 50左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内（内径 75mm的平皿约 8-9ml），水平旋转平皿，待琼脂

6、凝固后将平皿翻转，置 4保存备用。营养平板制备：先将灭菌琼脂融化后冷却至 50左右，以无菌操作加入 10%无菌的脱纤维羊血（临用前置 37水浴预温 30min），轻轻摇匀（避免产生气泡），倾注于灭菌平皿内（内径 75mm的平皿约8-9ml），水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置 4保存备用。注意事项 平板的浇注：倾注培养基时，切勿将皿盖全部开启，以免空气中尘埃及细菌等微生物的落入。倾注时若培养基温度过高，则冷凝水过多，易致污染，不易分离到菌落；若温度过低，部分琼脂凝固，倾注平板表面高低不平。可在无菌室或接种罩内倾注培养基后，将皿盖稍开一缝隙，在紫外灯照射下待凝，这样利于蒸气散发，减少平板内

7、冷凝水。倾注血液琼脂时，由于加血时琼脂表面容易产生气泡，倾注时适时转动锥形瓶，使气泡附于瓶壁，以减少血平板表面的气泡。（6）质量检查：需做无菌试验和效果试验。无菌试验：将灭菌后的培养基置 37孵育 24h，无任何微生物生长为合格。效果试验：将已知的标准参考菌株接种于待检的培养基中，检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符和。（7）保存：经过质量检查合格的培养基注明名称，制作日期存放于冷暗处或 4于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养

8、基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培冰箱（固体培养基应将平皿的底朝上，盖朝下或用保鲜袋包裹，以减少水分蒸发，液体培养基应直立放置，以免污染）。微生物的分离培养和接种技术 接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活

9、的生物体内的过程叫做接种。将微生物混和培养物通过一定的接种技术接种到人工培养基中得到纯培养的过程称为分离纯化。今天给大家展示一下各种培养基的分离培养的接种技术和细菌的生长状态。1.接种所需物品：接种工具（接种环、接种针等）、酒精灯、待接种菌种。接种环用于固体和液体培养基的接种，接种针用于固体培养基和半固体培养基的接种。接种技术要求：用灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于灭菌培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。接种工具的灭菌方法：通常接种环或接种针在火焰上外焰灭菌。灭菌后的接种工具在接种微生物前需先冷却，可接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用

10、它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。接种后将接种工具再次灭菌才可放置。2.接种环境：为避免接种过程中标本中的微生物污染环境及空气中的微生物污染培养物，微生物的接种应在特定环境内接种。常用的设备有接种罩、超净工作台或无菌室等。3.接种方法：根据待检标本性质、培养目的和所用培养基的性质采用不同的接种方法。（1）平板划线分离培养法：通过平板划线分离培养使混合细菌培养于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基

11、和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培物在培养基表面分散生长，各自形成菌落，根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获得纯种细菌（纯培养）。平板划线分离培养法常用来分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。根据划线的方式不同有连续划线分离法、分区

12、划线分离法、棋盘划线分离法等。a.连续环线分离法：先将接种环火焰灭菌,待冷后取培养物少许。左手拿起平板，并用拇指和食指将平板盖打开，右手迅速将取有培养物的接种环从打开的空间插入平板内，使接种环与培养基表面呈 45角，先在平板上1/5 处轻轻涂布，然后即可左右来回以曲线形式作连续划线接种，线与线间留有适当距离，将整个平板表面划满曲线。注明标识后，置35培养箱中培养，一般在 1824 小时后观察结果。b.分区划线分离法：用接种环先将培养物涂布于平板 1 区并作数次划线,再在 2、3区依次划线。每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域。每一区域的划线均接触上一区域的接种线 12 次，使

13、接种量逐渐减少，以获得单个菌落。其他操作与上述曲线划线分离法相同。c.棋盘格线划线分离法：将培养物涂布于平板上 1/5 处，接种环经火焰灭菌后，自 1/5 划线处作平行划线 56 条，将接种环灭菌后，划垂直线 56 条，使呈正方形格。其他操作同前。于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基

14、琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培（2）斜面接种培养法：主要用于纯菌移种，以进一步鉴定或保存菌种。接种方法是以灭菌的接种环挑取细菌后伸入斜面培养基管，在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。取出接种环，火焰灭菌管口，加塞；最后将接种环经火焰灭菌放好。做好标识，置 35培养箱中培养 1824 小时。（3）液体接种法：主要用于微生物的增菌和生长状

15、态观察。接种方法是以灭菌的接种环挑取细菌后伸入培养基管中，在接近液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体调和，使细菌混合于培养基的液体中。取出接种环，火焰灭菌管口，加塞；最后将接种环经火焰灭菌放好。做好标识，置 35培养箱中培养 1824 小时。（4）半固体培养基穿刺接种法：多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以用于观察细菌的某些生化反应。以灭菌接种针挑取细菌后，垂直刺入培养基的中心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底部（但不能完全刺到管底），接种针应沿原路退出。细菌的生长现象 细菌在不同的培养基上接种后，在一定的培养条件下（通常为35培养箱中培养 1824 小时），可表现不同的生长现象

16、。（1）固体培养基：细菌在固体培养上生长后可表现出 2 种生长情况：菌落和菌苔。于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分

17、在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培菌落：单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团。菌苔：多个细菌分类繁殖后形成密集一片的细菌集团。（2）液体培养基：细菌在液体培养基中生长后可表现 3 种生长情况：表面生长、均匀浑浊、沉淀生长。（3）半固体培养基：细菌在液体培养基中生长后可表现 2 种生长情况：沿穿刺线呈羽毛状或云雾状混浊生长和沿穿刺线呈线性生长。于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性

18、状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培常用染色液配制 实验室观察微生物的形态结构主要通过一定的染色方法后在显微镜下，常用的染色方法有革兰染色、抗酸染色等。革兰染色液配制（1）结晶紫染液：称取结晶紫 48g，溶于 100ml 95%乙

19、醇中制成饱和液。取 20ml 饱和液与 80ml 10g/L 草酸钾溶液混合即成，用滤纸过滤备用。（2）卢氏碘液：先将 2g 碘化钾溶于 10ml 蒸馏水中，再加 1g 碘，待碘全部溶解后再加蒸馏水至 300ml 即成。（3）95乙醇或丙醇乙醇溶液（95乙醇 70ml丙醇 30ml）（4）稀释石炭酸复红液：称取 4g 碱性复红溶解于 100ml 95乙醇，即成碱性复红乙醇饱和液，吸取 10ml 饱和液和 90ml 50mgL石炭酸水溶液，混匀，即成石炭酸复红饱和液，再量取 10ml 石炭酸复红饱和液加 90ml 蒸馏水混匀即成。抗酸染色液配制（1）石炭酸复红液：碱性复红 8g 溶于 100ml

20、 95%乙醇制备成碱性复红饱和液，取 10ml 饱和液与 90ml 5%石炭酸水溶液混匀。（2）盐酸酒精：5%盐酸乙醇液（5ml 浓盐酸+95ml 95%乙醇），使用时 10 倍稀释即可。（3）亚甲兰液：0.3g 亚甲蓝+50ml 95%乙醇，待溶后，加蒸馏水 100ml，混匀，使用时 10 倍稀释。细菌涂片制作、染色观察和细菌基本形态观察 所需物品：细菌培养物、革兰染色液、细菌接种工具、载玻片、生理盐水、光学显微镜。1.细菌涂片标本的制作 细菌进行染色检查前首先要制备细菌涂片，制作细菌涂片一般包括涂片、干燥、固定三步。（1）涂片：用灭菌的接种环挑取 1-2 环生理盐水涂于洁净的载玻片上，将接

21、种环灭菌后挑取固体培养基上细菌培养物少许于生理盐水中磨匀，呈轻度混浊。涂好菌膜大小一般以 1cm2左右为宜。注意事项：1)细菌涂片制作每次挑取细菌培养物前后都要注意无菌操作。2)若是细菌培养物在液体培养基（如肉汤、浓汁、痰液、咽拭子）中，可用灭菌接种环直接挑取 1-2 环液体培养物涂布于洁净的载玻片上，不需要另外添加生理盐水。3)若多个标本同时进行同样染色，可用蜡笔在玻片上画出数格，做于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观

22、察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培好标记再分别涂片，以免混淆。4)用火焰烧灼沾有菌液的接种环时，为防止菌液受热溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。（2）干燥：涂片最好在室温

23、下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰半尺高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。（3）固定：细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在酒精灯火焰中通过 3 次。固定的目的在于杀死细菌，并使细菌菌体与玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉，同时固定可凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。2.革兰染色法（1）原理：1)革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，不易被脱色；而革兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易透入，易被脱色。2)革兰阳性菌等电点叫阴性菌低（PI2-3、PI4-5），在相同条件下，革兰阳性菌所带负电荷较阴性菌多，与带正电荷的染料（结晶

24、紫）结合较牢固且不易脱色。3)革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固地结合成大分子复合物，不被乙醇脱色；而革兰阴性菌细胞内含有极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较少，易被乙醇脱色。（2）方法：1)初染：将结晶紫染液加于制好的涂片的菌膜上，染色 1min，用细水流冲洗，甩去积水。2)煤染：加卢戈碘液作用 1min，用细水流冲洗，甩去积水。3)脱色：滴加 95%乙醇数滴，摇动玻片数秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，再滴加酒精，直至流下酒精无色为止（约），用细水流冲洗，甩去积水。4)复染：加稀释石炭酸复红染，用细水流冲洗，甩去积水，用吸水纸吸干后，在涂片菌膜上滴加

25、香柏油，置油镜下检查。注意事项：操作因素：涂片太厚或太薄，固定菌体过分受热或脱色时间长短，染液冲洗方法不同，都会影响染色结果。细菌因素：细菌的菌龄不同，染色结果也有所差异。染液因素：所有染液应防止染液蒸发而改变浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去煤染作用，涂片积水过多会改变染液浓度，影于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固

26、剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培响染色效果。抗酸染色法 1.细菌制片：同革兰染色（但需厚涂片）。2.抗酸染色 初染：将固定好的涂片置于染色架上，滴加饱和石炭酸复红染液，并于载玻片下方以弱火加热至出现蒸汽（勿煮沸或煮干）随时补充染液以防止干枯，持续 5min,水洗。脱色：3%盐酸酒精脱色，直至涂片无红色染液脱下为止，然后水洗。复染：美

27、蓝染液复染 1min，水洗，印干（印干用的滤纸只能使用一次，以防止假阳性）。印干后，在涂片菌膜上滴加香柏油，置油镜下检查。3.细菌基本形态观察 革兰染色后的细菌涂片可在普通光学显微镜的油镜下观察细菌具体形态。普通光学显微镜由光学方法系统和机械装置两部分组成，光学放大系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等，机械装置一般包括底座、镜臂、镜台、物镜转换器、镜筒等。普通光学显微镜油镜使用方法 普通光学显微镜的接物镜一般有 3 种，即低倍镜、高倍镜和油镜。检查微生物形态时常用的是油镜。油镜的标志是：透镜直径最小；油镜长度大于低倍镜和高倍镜；油镜头的下缘有一圈黑线或白线有放大倍数 100X 的标记。当接目

28、镜倍数为 10X，接物镜用油镜时，显微镜放大倍数为 1000 倍，可观察到细菌的形态。油镜观察的原理：油镜的透镜很小，自标本片透过的光线，因玻片和空气介质密度不同，而使部分光线经载玻片和空气折射后而不能进入接物镜，致使射入光线较少，物象不清晰。在油镜和标本之间滴加与玻璃折光率相近的香柏油，则使进入油镜的光线增多，视野光亮度增强，物象清晰。1)显微镜在使用时应平放在实验台适宜的位置。用油镜时，勿使镜臂和载物台倾斜，以免镜油流出，影响观察。2)油镜检查染色标本时，光线宜强，可将聚光器上升到最高位置，将光圈全部打开，以获得最佳光度。3)将染色后待检查的标本置于载物台上，用标本推进器固定，将待检标本的

29、菌膜移于接物镜下。4)标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换成油镜，缓慢转动粗调节于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在

30、锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培器，使油镜头浸没在油滴中，当油镜头几乎接触玻片时停止转动。观察接物镜，缓慢调节粗调节器，使镜筒上升（不能下降，以免压碎标本片和损伤油镜），待看到模糊物象使，再调节细调节器，直至清晰看到细菌。调节过程中若油镜末端已离开油面，应按上述过程重复操作。5)观察标本时应两眼同时睁开，以减少眼睛疲劳，同时调节两个目镜之间的距离直至获得最佳视觉效果。注意事项 1)显微镜是精密的光学仪器，使用时应注意爱护，各部分结构不得随意拆卸，以免损坏。2)取送搬移显微镜时，要一手持镜臂，一手托镜底，平端在胸前，轻拿轻放。3)避免强酸、强碱

31、、氯仿、乙醇、乙醚等化学药品与显微镜接触。显微镜光学部分必须保持清洁，避免阳关直接照射。细调节器是显微镜精细而脆弱的部分，不要向同一方向连续转动数周，应轻微地来回旋转。4)镜头必须保持清洁，只能用软且无毛的擦镜纸擦拭。油镜使用后应立即用擦镜纸拭去镜油，若油镜头的油迹未擦干净，应先将二甲苯滴在擦镜纸上擦拭镜头，再用干净擦镜纸擦去镜头上残留的二甲苯。5)显微镜擦净后，接物镜转成“品”字形，下降聚光器，套上显微镜套，放入实验柜中。细菌的基本形态观察 经革兰染色后油镜观察：细菌染色可分为两种：革兰阳性（紫色）、革兰阴性（红色）；细菌形态可分为 3 种：球形、杆形、螺形。经抗酸染色后油镜观察：在淡蓝色背

32、景下可见染成红色细长或略带弯曲的杆菌，并有分枝生长趋向，此为抗酸染色阳性菌。其他细菌和细胞均被染成蓝色。于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管

33、玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培 细菌的生化反应 不同的细菌具有不同的酶系统，对底物的分解能力及代谢产物都不同。这些代谢产物具有不同的生物化学特性，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌，称为细菌的生化反应。生化反应的分类：1.碳水化合物的代谢试验（糖、苷、醇类发酵试验；氧化-发酵试验；七叶苷水解试验；甲基红试验；V-P 试验）2.蛋白质和氨基酸的代谢试验（吲哚试验；硫化氢试验；尿素分解试验；苯丙氨酸脱羧酶试验；氨基酸脱羧试验）3.碳源和氮源利用试验（枸橼酸盐利用试验）4.细菌酶试验（凝固酶试验、过氧化氢酶试

34、验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、CAMP试验、胆汁溶菌试验）5.抑菌试验（杆菌肽试验、0/129 试验）。今天示教一下细菌常见的生化反应接种方法和结果。1.糖发酵试验 组成：培养基+糖（苷、醇）+指示剂（溴甲酚紫）原理：各种细菌含有不同的分解糖（苷、醇）的酶，对糖（苷、醇）分解能力也各不相同，有的不分解，有的分解仅产酸，有的分解产酸又产气，故可用来鉴别细菌。方法：将待检菌接种糖发酵管（液体培养基接种法），35培养箱中培养 1824 小时，观察结果。结果：见示教管。2.甲基红试验 组成：葡萄糖蛋白胨水培养基+指示剂（甲基红）于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我

35、们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸、乙酸等

36、酸性物质，故培养基 PH在以下，加入甲基红试剂呈红色（阳性）。某些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步转化为醇、酮等非酸性物质，使培养基 PH在以上，加入甲基红试剂呈黄色（阴性）。方法：将待检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中（液体培养基接种法），35培养箱中培养 1824 小时，加入甲基红指示剂 2-3d，立即观察结果。结果：见示教管。试验 组成：葡萄糖蛋白胨水培养基+NaOH+-萘酚-乙醇 原理：某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸可进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下被氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为 V-P试验阳性。不变红色为阴性。方法：

37、将待检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中（液体培养基接种法），35培养箱中培养 2448 小时，加入 V-P试验甲液和乙液各 1d，立即观察结果（红色为阳性、不变色为阴性）。结果：见示教管。4.吲哚试验（靛基质试验）组成：蛋白胨水培养基+吲哚试剂。原理：细菌具有色氨酸酶，分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，与吲哚试剂形成红色化合物。于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成

38、固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培方法：将待检菌接种到蛋白胨水培养基中（液体培养基接种法），35培养箱中培养 18-24 小时，加入吲哚试剂数滴，静置半分钟，观察结果（培养物液面上层呈玫瑰红色为阳性，不变色者为阴性）。结果：见示教管。5.苯丙氨酸脱氨酶试验 组成：苯丙氨酸培养基+三氯化铁。原理：某些细

39、菌具有苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂螯合成绿色化合物。方法：将待检菌接种到苯丙氨酸培养基中（液体培养基接种法），35培养箱中培养 18-24 小时，加入三氯化铁试剂，观察结果（绿色为阳性，不变色为阴性）。结果：见示教管。6.尿素酶试验 组成：尿素培养基+指示剂（酚红）。原理：具有尿素酶的细菌能分解尿素产氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂变红色。方法：将待检菌接种到尿素培养基中（半固体培养基接种法），35培养箱中培养 18-24 小时，观察结果（培养基变红为阳性，反之为阴性）。结果：见示教管。7.枸橼酸盐利用试验 组成：枸橼酸盐+指示剂（溴麝香草酚蓝）于各类微生物对营养

40、的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培原理：当细菌

41、可以利用铵盐作为唯一的氮源，同时利用枸橼酸盐为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基生长，并分解枸橼酸盐为碳酸盐，使培养基产碱，指示剂溴麝香草酚蓝变色。方法：将将待检菌接种到尿素培养基中（半固体培养基接种法），35培养箱中培养 18-24 小时，观察结果（培养基由绿色变成蓝色，则为阳性，不变色则为阴性）。结果：见示教管。8.氧化发酵（O/F）试验 组成：无氧的葡萄糖发酵管。原理：根据细菌在有氧和无氧情况下对葡萄糖代谢情况，确定细菌的代谢类型。O型（有氧情况下分解糖），F型（有氧和无氧情况下分解糖），K型（无氧和有氧情况下均不分解糖）。方法：取 2 支含葡萄糖培养管，置沸水中，驱除培养基中的氧气。冷却后，

42、2 只培养管均接种待检菌，1 管加灭菌石蜡置于培养基上层隔绝空气，1 管不加石蜡，35培养箱中培养 18-24 小时，观察细菌在有氧和无氧情况下对葡萄糖分解能力。结果：见示教管。9.硝酸盐还原试验 组成：硝酸盐培养基+醋酸+对氨基苯磺酸+-萘胺。原理：某些细菌还原硝酸盐生成亚硝酸盐，与醋酸生成亚硝酸，与对氨基苯磺酸生成重氮苯磺酸，加入-萘胺生成偶氮苯磺酸，形成红色化合物。于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和

43、半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培方法：将待检菌接种到硝酸盐培养基中，35培养箱中培养 18-24 小时，加入硝还试验甲和乙试剂，观察结果（红色为阳性，不变红为阴性）。结果：见示教管。注意事项：本试验阴性结果可能有两种情况：真阴性和假阴性，通常要用 Zn

44、粉还原试验验证是否是假阴性。10.氧化酶试验 组成：氧化酶试剂（盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺）。原理：细菌具有氧化酶，可与氧化酶试驾反应生成红色化合物。方法：用滤纸条沾取待检菌，吸管滴加氧化酶试剂，变红色为阳性，不变色为阴性。结果：见操作。11.触酶试验 组成：触酶试剂（H2O2）。原理：细菌具有触酶（过氧化氢酶），能分解 H2O2，产生氧分子，出现气泡。方法：挑取待检菌培养物于洁净玻片上，滴加 3%H2O2数滴，观察结果，出现气泡为阳性，不出现气泡为阴性。结果：见操作。12.凝固酶试验 组成：新鲜抗凝血浆。原理：金黄色葡萄球菌具有游离型凝固酶，可使新鲜抗凝血浆重新发于各类微生物对营

45、养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培生凝固。方

46、法：将待检菌接种到 1：4 稀释的新鲜抗凝血浆，置 37水浴 3-4h，观察结果，血浆凝固为阳性，不凝固为阴性。结果：见示教管。复合试验（克氏双糖铁）组成：培养基+底物 乳糖、葡萄糖（1/10）、酚红、硫代硫酸钠、FeSO4。原理：该培养基使用酚红作为指示剂，酸性呈黄色，碱性呈红色。细菌若能发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则斜面与底层呈黄色，且有气泡。若只发酵葡萄糖不发酵乳糖，则斜面呈红色，底层呈黄色。若分解硫代硫酸钠产生硫化氢与铁生成黑色硫化铁，培养基变黑。方法：将待检菌接种 KIA培养基（固体斜面培养基接种法），35培养箱中培养 1824 小时，观察结果。结果：见示教管。复合试验 组成：半固体培

47、养基+底物 色氨酸、尿素、酚红 原理：细菌具有脲酶可分解尿素产碱酚红变色；细菌具有色氨酸酶分解色氨酸产生吲哚，加入吲哚试剂培养基变红，有动力的细菌在半固体培养基中沿穿刺线扩散生长）。方法：将待检菌接种 MIU培养基（穿刺接种），35培养箱中培养 1824小时，观察动力和脲酶反应后，再滴加吲哚试剂。结果：见示教管。于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和

48、半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基用作微生物的分离鉴定计数保藏调配成分溶解校正分装灭菌质量检查和保存所需物品试剂锥形瓶天平量筒微波炉高压蒸汽灭菌器玻璃试管玻璃平板接种工具调配成分在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水蛋白胨牛肉膏准确称取各种成分使其充分混合注意事项培消毒灭菌 消毒灭菌即是用物理或化学方法来抑制或杀死外环境中及机体体表的微生物，以防止微生物污染或病原微生物传播的方法。实验室常用消毒灭菌方法主要为：紫外线杀菌和高压蒸汽灭菌。1.紫外线杀菌试验 原理：波长 240-300nm的紫外线具有杀菌作用，其中以波长 266nn 紫外线杀菌

49、作用最强。紫外线作用生物细胞的 DNA，使 DNA 链上两个相邻的 T以共价键结合，形成二聚体，干扰 DNA 的复制与转录，导致细菌的变异或死亡。特点：杀菌效果受紫外线照射波长、距离、时间的影响；杀菌效果的穿透力弱，易被物品遮挡；杀菌效果无选择性（生物核酸亦受影响）。方法：将待检菌接种到无菌培养基（连续密集划线），使细菌均匀涂布于平板的表面，在紫外线灯下，开启平板盖的一半，距离紫外灯管1 米以内，接受紫外线照射 30min，盖好平板，35培养箱中培养 1824小时，观察结果。结果：见示教平板。2.药物敏感性试验（K-B法）所需物品：细菌菌种、MH 琼脂、无菌生理盐水、麦氏标准比浊管（ml）、抗

50、菌药物纸片、无菌棉拭、镊子、毫米尺、接种环。原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长受到于各类微生物对营养的要求不同培养目的和检测需要不同因而培养基的种类很多我们可根据某种标准将种类繁多的培养基划分为若干类型培养基的分类按功能分类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基按物理性状生长状态观察固体培养基和半固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基常用作凝固剂的物质有琼脂固体培养基琼脂用量半固体培养基琼脂用量在之间固体培养基