细胞培养的操作步骤医学心理学基础医学_高等教育-大学课件.pdf

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1、细胞培养的操作步骤 时间：2021.03.02 创作：欧阳数 一、原代培养及其操作步骤 原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以 及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使 Z 在体外模拟 人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组 织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物 测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步 骤如下。1.剪切组织 先将所取得的组织，用 D-Hanks或 Hanks 液清洗，以去除表面血污，并用手术银去除黏附的结缔组 织等非培养所需组织。再次

2、清洗后，用手术刀将组织切成 若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲 液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约 lmm3 大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当 的缓冲液再清洗一次。2.消化分离 消化分离的目的是将细小的组织块消化分 离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常 用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。3.培养 细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将 细胞数调整为(25)X105 cells/ml,或实验所需密 度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培 养瓶底部为宜。置 C02 培养箱内，5%C02,37 C 静置培 养。一般 35d,原代培养

3、细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开 始生长，可补加原培养液量 1/2 的新培养液，继续培养 2 3d 后换液，一般 714d可以长满瓶壁，进行传代。4.注意事项(1)无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原 因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一 旦污染，一般很难消除。(2)培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长 的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法 选择适当的培养液。(3)小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和 促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小 牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛

4、 血清后，就保持应用至实验完成。(4)胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间过长(即使 是-20C 低温保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过 长，细胞损伤增加。以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群使在体外模拟人体生理环境在无菌适当温度和一定的营养条件下生存生长和繁殖原代培养细胞常有不同的细胞成分生长缓慢但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征利用的组织用或液清洗以去除表面血污用手术银去除黏附的结缔组织等非培养所需组织再次清洗后用手术刀将组织切成若干小块移入青霉素小瓶或小烧杯中加入适量缓冲液用弯头眼科剪反复剪切组织直到组织成糊状约大小静置片刻后用分散的单个细胞以利于进一步的培养常用

5、的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶培养细胞悬液用计数板进行细胞计数用培养液将细胞数调整为或实验所需密度分装于培养瓶中使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜置培养箱内静置培(5)L-谷氨酰胺：几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高 的要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在缺少谷 氨酰胺时，细胞会因生长不良而死亡。谷氨酰胺在溶液屮 很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在 4 C 冰箱贮存两周以上 时，就应重新加入原来量的谷氨酰胺。(6)静置培养：原代细胞在消化分离后，置于 C02 培 养箱的头 2448h(必要时 72h)内，应处于绝对静置状态，切忌不时地取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细 胞难以贴壁，更

6、谈不上伸展和增殖，初学者尤应注意。不 必担心培养液中的营养成分会消耗光，在细胞增殖之前对 营养的要求并不大。原代培养初期仅加一薄层培养液的目 的也在于有利于细胞贴壁伸展。(7)消化时间：一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒 即可，因为此时组织颗粒已经松散，略经吹打即成细胞团 或单个细胞，过久的消化往往导致细胞损伤加重，细胞培 养成活率降低。(8)其他生长因子：经过以上处理，一般原代分离细 胞培养均可以成功。对于少数特殊类型细胞也可以考虑加 一些特殊的生长因子，如胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和 氨基酸。另外，内毒素、EGF、FGF 等均有促有丝分裂作 用，但费用较高。二、传代培养及其操作步骤 以及消化

7、分离成单个细胞或单一型细胞群使在体外模拟人体生理环境在无菌适当温度和一定的营养条件下生存生长和繁殖原代培养细胞常有不同的细胞成分生长缓慢但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征利用的组织用或液清洗以去除表面血污用手术银去除黏附的结缔组织等非培养所需组织再次清洗后用手术刀将组织切成若干小块移入青霉素小瓶或小烧杯中加入适量缓冲液用弯头眼科剪反复剪切组织直到组织成糊状约大小静置片刻后用分散的单个细胞以利于进一步的培养常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶培养细胞悬液用计数板进行细胞计数用培养液将细胞数调整为或实验所需密度分装于培养瓶中使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜置培养箱内静置培原

8、代细胞培养成功以后，需要进行分离培养，否则细胞 会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生 长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶屮培养 的过程称之为传代培养。传代细胞允许培养的细胞扩增（形 成细胞株），可以进行细胞克隆，易于保存，但可能丧失一 些特殊的细胞和分化特征。传代细胞形成细胞株的最大利 处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。1.操作步骤（1）吸掉或倒掉培养瓶内 III 培养液。（2）向瓶内加入胰蛋白酶液和 EDTA 混合液少量。以能 覆盖培养瓶底为宜。（3）置 37 C 孵箱或室温（25 C 温度）下进行消化，25min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞 质

9、回缩、细胞间隙增大后，应立即屮止消化。（4）吸出消化液，向瓶内加入 Hanks 液少量，轻轻转 动培养瓶，把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如果仅 使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量 含血清的培养液，终止消化。（5）使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻 轻吹打瓶壁细胞，使 Z 从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时 动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群使在体外模拟人体生理环境在无菌适当温度和一定的营养条件下生存生长和繁殖原代培养细胞常有不同的细胞成分生长缓慢但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征利用的组织用或液清洗以去除表面血污用

10、手术银去除黏附的结缔组织等非培养所需组织再次清洗后用手术刀将组织切成若干小块移入青霉素小瓶或小烧杯中加入适量缓冲液用弯头眼科剪反复剪切组织直到组织成糊状约大小静置片刻后用分散的单个细胞以利于进一步的培养常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶培养细胞悬液用计数板进行细胞计数用培养液将细胞数调整为或实验所需密度分装于培养瓶中使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜置培养箱内静置培（6）用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶屮，置 C02培养箱中进行培养。?（7）细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验 要求来确定。一般 23d 后应换一次生长液。待细胞铺满 器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成

11、维持 液。2.注意事项（1）掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞 不宜从瓶壁脱落，过长的消化会导致细胞脫落、损伤。（2）掌握好消化浓度，当消化液浓度过高时，消化时 间应缩短，过低时细胞消化时间相对延长。三、体内细胞培养及其操作步骤 1.瘤细胞悬液接种（1）无菌选取生长良好（有光泽，淡红色）瘤组织或对 数生长期培养瘤细胞。（2）在 PBS 屮将瘤组织剪碎后用匀浆器研磨，经 80 100 目筛网过滤成细胞悬液。（3）培养细胞应用 PBS 洗两遍。（4）计数并调整细胞浓度至 107108/mlo（5）常规消毒后，于接种部位（通常为背部或腋窝腹股 沟皮下）用医用注射器皮下潜行一段后注入细胞悬液（

12、0.lml/部位，106 细胞）。初次接种成功率低，细胞数尽可能 多一些。以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群使在体外模拟人体生理环境在无菌适当温度和一定的营养条件下生存生长和繁殖原代培养细胞常有不同的细胞成分生长缓慢但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征利用的组织用或液清洗以去除表面血污用手术银去除黏附的结缔组织等非培养所需组织再次清洗后用手术刀将组织切成若干小块移入青霉素小瓶或小烧杯中加入适量缓冲液用弯头眼科剪反复剪切组织直到组织成糊状约大小静置片刻后用分散的单个细胞以利于进一步的培养常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶培养细胞悬液用计数板进行细胞计数用培养液将细胞数调整为或实验

13、所需密度分装于培养瓶中使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜置培养箱内静置培（6）次日注意观察动物一般情况。初次接种一般有一 段较长的潜伏期，以后随着传代潜伏期逐渐缩短，最后固 定为一个相对稳定的时间。2.腹水瘤的建立与腹水瘤的接种 将实体瘤细胞直接 种于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水屮含有 瘤细胞，将这种腹水反复传代，即可成为腹水瘤。初次传 代时，腹水常呈血性（含大量红细胞），反复传代后腹水逐 渐变成乳白色。腹水瘤的接种过程如下。（1）将冻存或培养的腹水瘤细胞离心和洗涤，进行细 胞计数。（2）消毒动物，左下腹穿刺接种 106 腹水瘤细胞。（3）接种腹水瘤细胞后约 7、12d,待

14、小鼠腹部明显膨 大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用 9 号针头抽取腹水，也可 行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽 35ml。（4）抽取的腹水经 3000rpm 离心 15min,收集上清，分 装冻存备用。四、培养细胞的冻存及复苏 细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存 在-196 C 液氮中，储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复 苏的原则是慢冻快融。1.冻存细胞（1）选对数增生期细胞（证明无支原体污染），在冻存 前以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群使在体外模拟人体生理环境在无菌适当温度和一定的营养条件下生存生长和繁殖原代培养细胞常有不同的细胞成分生长缓慢但是更能代表所来源的组织细胞类

15、型和表达组织的特异性特征利用的组织用或液清洗以去除表面血污用手术银去除黏附的结缔组织等非培养所需组织再次清洗后用手术刀将组织切成若干小块移入青霉素小瓶或小烧杯中加入适量缓冲液用弯头眼科剪反复剪切组织直到组织成糊状约大小静置片刻后用分散的单个细胞以利于进一步的培养常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶培养细胞悬液用计数板进行细胞计数用培养液将细胞数调整为或实验所需密度分装于培养瓶中使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜置培养箱内静置培Id 换液。（2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细 胞密度达 5X107/ml 左右密度，离心，去上清。（3）加入配制好的冻存液（培养液 6.8ml,小牛血清

16、 2ml,DMSO lml,5.6%NaHC03 0.1ml）,按与去上清相同的 量一滴一滴加入离心管屮，然后用吸管轻轻吹打令细胞重 悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂 10%二甲基亚砚（DMS0）或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞 外。（4）分装于无菌冻存管中，每管加 1.5m 悬液。（5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标 记。（6）冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1 C/min 的速度，在 3040min 时间内，下降到液氮表 面，再停30min 后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷 冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形 成。操作时应戴防护眼镜

17、和手套，以免液氮冻伤。2.复苏细胞（1）从罐屮取出冻存管。（2）迅速放入 36 C37 C 水浴，不时摇动，使其急速 融化，3060s 内完成。(3)冻存管用 70%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸 管将细胞悬液注入离心管屮，再滴加 10ml 培养液。(4)低速离心(5001000r/min)5min,去上清后再 用培养以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群使在体外模拟人体生理环境在无菌适当温度和一定的营养条件下生存生长和繁殖原代培养细胞常有不同的细胞成分生长缓慢但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征利用的组织用或液清洗以去除表面血污用手术银去除黏附的结缔组织等非培养所需组织再次清

18、洗后用手术刀将组织切成若干小块移入青霉素小瓶或小烧杯中加入适量缓冲液用弯头眼科剪反复剪切组织直到组织成糊状约大小静置片刻后用分散的单个细胞以利于进一步的培养常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶培养细胞悬液用计数板进行细胞计数用培养液将细胞数调整为或实验所需密度分装于培养瓶中使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜置培养箱内静置培液洗一次。(5)用培养液适当稀释后，装入培养瓶 37 C 培养，次 日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培 养。冻存细胞数量要充分，密度应达到 107/ml,在融后稀 释 20倍时,仍能保持 5X105/ml 数量。时间：2021.03.02 创作：欧阳数 以及消

19、化分离成单个细胞或单一型细胞群使在体外模拟人体生理环境在无菌适当温度和一定的营养条件下生存生长和繁殖原代培养细胞常有不同的细胞成分生长缓慢但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征利用的组织用或液清洗以去除表面血污用手术银去除黏附的结缔组织等非培养所需组织再次清洗后用手术刀将组织切成若干小块移入青霉素小瓶或小烧杯中加入适量缓冲液用弯头眼科剪反复剪切组织直到组织成糊状约大小静置片刻后用分散的单个细胞以利于进一步的培养常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶培养细胞悬液用计数板进行细胞计数用培养液将细胞数调整为或实验所需密度分装于培养瓶中使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜置培养箱内静置培