northernblot实验方法步骤中学实验_-中学实验.pdf

《northernblot实验方法步骤中学实验_-中学实验.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《northernblot实验方法步骤中学实验_-中学实验.pdf（6页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、Nor 輻 er n B I ot 实验 方法步骤 本页仅作为文档封面，使用时可以删除 This document is for reference only-rar21 year.Marcl Northern Blot 实验方法步骤 实验原理 在变性条件下将待检的 RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同 Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有 基因的转录产物（mRNA）及其含量。实验试剂 1.NorthernMax Kit（Cat.#1940,Ambion,Inc.）2.琼脂糖 3.DEPC 4.X光底片 5.底片暗盒 6 Random

2、Primer 7.dNTP Mixture 8.Ill TBq/mmola-32PdCTP 9.Exo-free Klenow Fragment 和 10 X Buffer 10.Sephadex G-50 ll.SDS 12.双氧水 灭菌水等 实验设备 1.恒温水浴箱 2.电泳仪 3凝胶成像系统 4.真空转移仪 5.真空泵 6.UV交联仪 7.杂交炉 8 恒温摇床 9.脱色摇床 10.漩涡振荡器 11.分光光度计 12.微量移液器 13.电炉（或微波炉）14离心管，烧杯，量筒，三角瓶等 实验材料 总 RNA样品或 mRNA样品，探针模板 DNA（25 ng）,尼龙膜 实验步骤 糖凝胶电泳继而

3、按照同相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测用途检测样品中是否含有基因的转录产物及其含量实验试剂琼脂糖光底片底片暗盒和双氧水灭菌水等实验设备恒温水浴箱电泳仪凝胶成像系统真空转移仪真空泵交联样品或样品探针模板尼龙膜实验步骤用具的准备度烤器皿三角锥瓶量筒银子刀片等小时电泳槽清洗梳子和电泳槽并用双氧水浸泡过夜用水冲洗干燥备用处理水备用用去除用具表面的酶污染用擦洗梳子电泳槽刀片等然后用水冲洗二次分在通风厨中加入的轻轻振荡混匀注意尽量避免产生气泡将熔胶倒入制胶板中插上梳子如果胶溶液上存在气泡可以用热的玻璃棒或其它方法去除或将气泡到胶的边缘注胶的厚度不能超过胶在室温下完全凝固后将胶转移到电泳槽中加1.用具

4、的准备：180 度 烤器皿：三角锥瓶、量筒、银子、刀片等 4 小时。电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用 DEPC水冲洗，干燥备 用。处理 DEPC水（2L）备用。2.用 RNAZaP去除用具表面的 RNase 酶污染 用 RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用 DEPC水冲洗二次，去除 RNAZap o 3.制胶 1）称取琼脂糖加入三角锥瓶中，加入水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60 C空气浴平衡溶液（需加 DEPC水补充蒸发的水分）。2）在通风厨中加入的 10*Denaturing Gel buffer,轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。3）将熔胶倒入制胶板中，插上梳

5、子。如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶 的边缘。注：胶的厚度不能超过。4）胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入 lxMOPS Gel Running buffer 盖过胶面约 lcm,小心拔出梳子。（配制 250ml 1*MOPS Gel Running buffer,在电泳过程中补充蒸发的 buffero）5）检查点样孔。4.RNA样品的制备 在 RNA样品中加入 3 倍体积的 formaldehyde load dye和适、勺的 EB（终浓度为 10ug/ml）。混匀后，65 C空气浴 15mino 短暂低速离心后，立即放置于冰上 Smino 5

6、.电泳：1）将 RNA样品小心加到点样孔中。2）在 5V/cm 下跑胶（5 x 14cm）o 在电泳过程中，每隔 30min 短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的澳纷蓝（500bp）接近胶的边 缘时终止电泳。3）紫外灯下，检验电泳情况,并用尺子测量 18S、28S、漠纷蓝到点样孔的距 离O 注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。6.转膜 1）用 3%双氧水浸泡真空转移仪后，用 DEPC水冲洗。2）用 RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用 DEPC水冲洗二次。3）连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶 屏孔口的 5mm）,膜在 Transfer

7、buffer 浸湿 5 分钟后，放置在多孔渗水屏的适 当位置。4）盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。糖凝胶电泳继而按照同相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测用途检测样品中是否含有基因的转录产物及其含量实验试剂琼脂糖光底片底片暗盒和双氧水灭菌水等实验设备恒温水浴箱电泳仪凝胶成像系统真空转移仪真空泵交联样品或样品探针模板尼龙膜实验步骤用具的准备度烤器皿三角锥瓶量筒银子刀片等小时电泳槽清洗梳子和电泳槽并用双氧水浸泡过夜用水冲洗干燥备用处理水备用用去除用具表面的酶污染用擦洗梳子电泳槽刀片等然后用水冲洗二次分在通风厨中加入的轻轻振荡混匀注意尽量避免产生气泡将熔胶倒入制胶板中插上梳子如果胶溶液上存在气泡可以

8、用热的玻璃棒或其它方法去除或将气泡到胶的边缘注胶的厚度不能超过胶在室温下完全凝固后将胶转移到电泳槽中加 5)糖凝胶电泳继而按照同相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测用途检测样品中是否含有基因的转录产物及其含量实验试剂琼脂糖光底片底片暗盒和双氧水灭菌水等实验设备恒温水浴箱电泳仪凝胶成像系统真空转移仪真空泵交联样品或样品探针模板尼龙膜实验步骤用具的准备度烤器皿三角锥瓶量筒银子刀片等小时电泳槽清洗梳子和电泳槽并用双氧水浸泡过夜用水冲洗干燥备用处理水备用用去除用具表面的酶污染用擦洗梳子电泳槽刀片等然后用水冲洗二次分在通风厨中加入的轻轻振荡混匀注意尽量避免产生气泡将熔胶倒入制胶板中插上梳子如果胶溶液上

9、存在气泡可以用热的玻璃棒或其它方法去除或将气泡到胶的边缘注胶的厚度不能超过胶在室温下完全凝固后将胶转移到电泳槽中加将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约 2mm,以防止漏气。6）将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。7）打开真空泵，使压强维持在 5058mbar；立即将 transfer buffer 加到胶面和 四周 o 每隔 lOmin 在胶面加上 lml transfer buffer,真空转移 2 小时。8）转膜后，用银子夹住膜，于 lx MOPS Gel Running buffer 中轻轻泡洗 10 秒，去除残余的胶和盐。9）用吸水纸吸取膜上多

10、余的液体后，将膜置于 UV交联仪中自动交联。10）将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。（避免太长的紫外曝光 时间）12）将膜在20 C保存。7 探针的制备 1）在离心管中配制以下反应液：模板 DNA（25 ng）lul Random Primer 2ul 灭菌水 llul 总体积：14ul 2）95 C加热 3 分钟后，迅速放置于冰冷却 5mino 3）在离心管中按下列顺序加入以下溶液：lOxBuffer dNTP Mixture 111 TBq/mmola-32PdCTP 5 ul Exo-free Klenow Fragment 1 ul 4）混匀后（25ul）,37 七下反应

11、30 分钟。短暂离心，收集溶液到管底。5）65 C加热 5min 使酶失活。8.探针的纯化及比活性测定：1）准备凝胶：将 lg 凝胶加入 30ml 的 DEPC水中，浸泡过夜。用 DEPC水洗涤 膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的 TE（）o 2）取 lml-次性注射器，去除内芯推抨，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞 住，在注射器中装填 Sephadex G-50凝胶。3）将注射器放入一支 15ml 离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g 离心 4 分钟，凝胶压紧后，补加 Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度 达注射器刻度处。4）lOOulSTE缓冲

12、液洗柱,1600g 离心 4min。重复 3 次。5）倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的离心管置于管中，再将装填了 Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准离心管。6）将标记的 DNA样品加入 25ulSTE,取出点样于 DE8 paper 上，其余上样于 层析糖凝胶电泳继而按照同相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测用途检测样品中是否含有基因的转录产物及其含量实验试剂琼脂糖光底片底片暗盒和双氧水灭菌水等实验设备恒温水浴箱电泳仪凝胶成像系统真空转移仪真空泵交联样品或样品探针模板尼龙膜实验步骤用具的准备度烤器皿三角锥瓶量筒银子刀片等小时电泳槽清洗梳子和电泳槽并用双氧水浸泡过

13、夜用水冲洗干燥备用处理水备用用去除用具表面的酶污染用擦洗梳子电泳槽刀片等然后用水冲洗二次分在通风厨中加入的轻轻振荡混匀注意尽量避免产生气泡将熔胶倒入制胶板中插上梳子如果胶溶液上存在气泡可以用热的玻璃棒或其它方法去除或将气泡到胶的边缘注胶的厚度不能超过胶在室温下完全凝固后将胶转移到电泳槽中加柱上。7）1600g 离心 4min,DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的 dNTP则保留在层析柱中。取己纯化的探针点样于DE8-papero 8）测比活性（试剂比活要求:106cpm/ml）。9.预杂交：1）将预杂交液在杂交炉中68 C预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。2）加入适当的ULRAh

14、yb到杂交管中（以 100cm2膜面积加入 lOmlULRAhyb杂交 液）,42 C预杂交 4 hr。10 探针变性：1）用 10 mM EDTA将探针稀释 10 倍。2）90 C热处理稀释后探针 lOmin 后，立即放置于冰上 5min。3）短暂离心，将溶液收集到管底。杂交：1）加入 ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。2）42 C杂交过祓（1424hr）。杂交完后，将杂交液收集起来于一 20 C保存。12.洗膜：1）低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#l（100cm2膜面积加入 20ml洗膜溶液），室温下，摇动洗膜 5mi

15、n 两次。2）高严紧性洗膜：加入 High Stringency Wash Solution#2（100cm2膜面积加入 20ml 洗膜溶液），42 匸摇动洗膜 2（泊两次。13曝光：1）将膜从洗膜液中取 出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。2）检查膜上放射性强度，估计曝光时间 3）将 X光底片覆盖与膜上，曝光 4）冲洗 X光底片，扫描记录结果。14去除膜上 的探针:将 200ml%SDS（ill DEPC水配制）煮沸后,将膜放入,室温下让 SDS 冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存儿个月。15.杂交结 果。注意事项 操作应该小心，但不必紧张。用于 RNA电泳、转膜的所有器械、用

16、具均须处理 以除去 RNAse酶，以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有 气泡。糖凝胶电泳继而按照同相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测用途检测样品中是否含有基因的转录产物及其含量实验试剂琼脂糖光底片底片暗盒和双氧水灭菌水等实验设备恒温水浴箱电泳仪凝胶成像系统真空转移仪真空泵交联样品或样品探针模板尼龙膜实验步骤用具的准备度烤器皿三角锥瓶量筒银子刀片等小时电泳槽清洗梳子和电泳槽并用双氧水浸泡过夜用水冲洗干燥备用处理水备用用去除用具表面的酶污染用擦洗梳子电泳槽刀片等然后用水冲洗二次分在通风厨中加入的轻轻振荡混匀注意尽量避免产生气泡将熔胶倒入制胶板中插上梳子如果胶溶液上存在气泡可以用热的玻璃棒或其它方法去除或将气泡到胶的边缘注胶的厚度不能超过胶在室温下完全凝固后将胶转移到电泳槽中加