QRT-PCR引物设计protocol.docx

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1、QRT-PCR 引物设计概述：在 QRT-PCR 过程中，由于涉及到模板定量，所以要求引物特异性强，并且不能扩增出基因组 DNA假设用 DNA 酶处理干净另当别论，所以要求跨外显子设计可以不用考虑基因组 DNA 污染，或跨内含子设计检验 DNA 酶是否处理干净， 即无基因组 DNA 污染。下面是自己在设计过程的一些心得体会，与大家共享之！要求：1. 上下游引物的长度一般为 18-30bp 之间，且 Tm 值在 58-62之间，上下游引物的 Tm 值相差最好不超过 2。2. GC=30-80%；3. 应避开引物中多个重复的碱基消灭，尤其是要避开 4 个或超过 4 个的 G 碱基消灭。引物的 3端

2、最好不为 G 或/和 C。引物 3端的 5 个碱基不应消灭 2 个 G 或/和 C。4. PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在 80-250bp 之间都可；80150 bp 最为适宜可以延长至 300 bp；5. 要特别留意避开引物二聚体和非特异性扩增的存在；6. 而且引物设计时应当考虑到引物要有不受基因组 DNA 污染影响的力气，即引物应当跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组 DNA 污染的影响；7. 至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS 都可以的；8. 关于 BLAST 的作用应当是通过比对，觉察你所设计的

3、这个引物，在已经觉察并在 GENEBANK 中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在一样的序列，如和你的目标序列之外的序列一样的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用；9. 避开引物内消灭反向重复序列形成发夹二级构造，同时也应避开引物间配对形成引物二聚体。设计方案：I. 跨内含子设计方案尽量不承受，假设方法 II 没有适宜的引物，在考虑I1. 上下游引物分别在两个外显子上，如以以下图所示，这样设计的引物可以检验是否有基因组 DNA 污染；II. 跨外显子设计方案尽量承受这种方案设计1. 上游A或下游B或上下游引物C

4、跨在两个外显子上，如以以下图所示，这样设计的引物不能从基因组 DNA 扩增,从而消退基因组 DNA 污染的影响这要求目的基因具有较多的外显子，从而有较多的选择，引物本身质量可能不好，同时留意：引物在两个外显子上分布，在“内侧”要少些，8bp 左右。2. 外显子拼接： 以 NM-005101 为例，首先把该基因的基因组序列拷入EditSeq 软件，依据外显子位置指示，按 Ctrl+J，弹出如下框，填入 78。按 Ctrl+N，弹出一的序列框，拷贝 178 位碱基到该序列框中，然后如法炮制，拷贝 4861041 位碱基到该序列框的 178 后面，即为拼接后的外显子序列，按 Ctrl+A，然后按 C

5、trl+C 拷贝该序列到 Primer Premier 5 软件中，假设有 3 个以上外显子，也按上述方法拼接起来。3. 引物设计：拷贝待设计外显子序列到 Primer Premier 5 后，点击Gentank 框左上角的 Primer 按钮，如以以下图所示：然后消灭如下引物设计框，点击 Search 按钮：然后消灭如下参数设定框，我们依据外显子与内含子的接头位置78和引物设计条件，将上游引物限定在 5590 之间，将下游引物设定在 90634 之间， 将引物长度设定在 80150 之间，将引物长度设定在 246。注：这里要求依据外显子在基因组中的位置计算外显子在 mRNA 中位置，以便于填

6、写 Search Ranges，如：NM-004335 的外显子在基因组中的位置分别为：1285、1139 1205、13871447、17521896、22502630，则其在 mRNA 中的位置：1285、286352、353413、414558、559939，这一点尤其重要，且工作量很大点击确定，消灭确认框，点击 OK，消灭如下对话框，每一行代表一对引物， 点击引物所在行，即可在引物设计栏中查看该引物的具体状况，依据前面所述引物设计要求选择适宜的引物，每个基因设计两对引物。4. 引物保存：点击 Primer Premier 5 菜单栏的 Edit，点击 Copy，将上下游引物拷入引物设计

7、结果相应的位置，如以以下图所示：点击菜单栏的 File，点击 Print，Current Pair，将引物设计结果打印成PDF 文件或直接打印出来，以备后续参考。5. 将设计好的引物在 NCBI 进展 Blast，Blast 时，可在上下游引物之间加空格或换行，留意记住上下游引物的长度，如分别是 20bp 和 19bp，然后进展Format，结果完全出来后，查找有没有和 1-20、21-39 同时完全匹配的基因这种一般就是要扩增的基因，假设不是，那么就是非特异性扩增，其他的就不用考虑了。查看以下三个网站是否有适宜的已经证明的 QRT-PCR 的扩增引物,探针以及反响条件.RTPrimerDB, PrimerBankReal Time PCR Primer Sets假设没有适宜的或者已经证明的可以供给参考,以下的设计方案仅供参考: A.最广泛使用的商业化的软件 Beacon DesignerB.DIY 的软件 Primer ExpressC.假设 Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择 Sigma-Genosys )的效劳方案,具体周到D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序: