分光光度技术.docx

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1、分光光度技术一.概念分光光度法(Spectrophotogniphy),又称为比色法，它是采用物质特有的汲取光 谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。有色溶液对光线有选择性的汲取作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波 长的光的汲取力量不同，因此，每种物质都具有其特异的汲取光谱。比色法只限于可见光区，分光光度法可扩展到紫外光区和红外光区。使用的光谱 范围 200lOOOnm紫外光区：200-400nm可见光区：400760nm红外光区：760-lOOOnm二.基本原理物质的汲取光谱与它们的本身的分子结构有关，不同物质由于其分子结构不 同，对不同波长光线的汲取力量也不同。每种物质都具有特定的汲取

2、光谱，在肯 定条件下，其汲取程度与该物质浓度成正比，因此可采用各种物质不同的汲取光 谱及其强度，对不同物质进行定性和定量分析。分光光度法依据的原理是Lambert-Beer定律，该定律阐明白溶液对单色光 汲取程度与溶液浓度及溶液厚度之间的关系。1 .朗伯(Lambert)定律：当单色光通过一汲取光的介质时，其光强度随汲取光 介质的厚度增加而成指数削减，即I / Io = eK1LIo：入射光强度，I：出射光强度，L：介质的厚度e:自然对数的底，即2.718K/溶液的吸光率In (Io/I) =Kil换算成常用对数式，即log (Io/I) =0.4343 Kil令 K = O.4343K1则

3、log (10/1) =K1此处以K为吸光率也就是说：在溶液浓度不变时，溶液对光的汲取随溶液厚度的增大而增大。2 .比尔(Beer)定律：单色光通过一光汲取介质时，光强度随介质浓度增长而 成指数削减，即I / Io = e-K2LC：溶液浓度log (Io/I)= KC也就是说：溶液厚度不变时，溶液对光的汲取随溶液浓度的增大而增大。3 .LambertBeer 定律假如同时考虑汲取溶液的浓度和厚度对光汲取的影响，将以上两式结合，则得出 log (Io/I) =KC1令丁二 (I/Io) A=log (Io/I)则 A = KC1A为吸光度，T为透光度TTCL-niorcm-1)是一常数，即削光

4、系数，也叫摩尔吸光度；三.计算.标准管法(标准比较法)用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，在依据公式计算。Ai=KiCiLiA2=K2c2L2Ai：已知浓度标准管A2：未知浓度测定管Ai/A2= (K1C1L1) / (K2C2L2)由于使用的比色杯径长相同，即Li=L2,所以上式可改写为：Ai/A2= (K1C1) / (K2C2)又由于标准液和测定液中的溶质为同一物质，所以K值相同，即：Ki=K2所以上式可改写为A1/A2=C1/C2所以 C2= (A2/A1) Cl试验中，由于比色皿本身和溶剂也会产生肯定的光汲取，所以设置一个空白管， 即其中除了待测溶质以外，其他的成分

5、完全相同。以空白管对准光路对仪器调零, 消退非待测物的汲取，所测值即为待测物的光汲取。1 .标准曲线法制备一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别 读取各管吸光度三.仪器的结构1 .定义：对某一波长的光汲取值(吸光度)进行测定的仪器称为分光光度计。2 .分类：依据所测光谱范围分为：紫外、可见、红外分光光度计及万用(全波 段)分光光度计。3 .结构组成光源：要求能供应所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。常用光源有：鸨灯或卤铝灯：工作范围360lOOOnm,用于可见光区，近紫外光 区和近红外光区氢灯或笊灯：工作范围150 400nni,可作紫外光分光光度计的光源分光系

6、统(单色器)：把混合光分解为单一波长光的装置，多用棱镜或光栅作 为色散元件，将不同波长的光分开汲取池(比色皿、比色池)：用来盛待测溶液。一般用玻璃、石英制成。小于330nm的光不能用玻璃比色皿，所以紫外汲取时要用石英比色皿。检测器：光电池、光电管、光电倍增管组成测量装置：以电流表、波长分度盘和测量读数盘的形式输出测量结果，现代的 仪器长附有自动纪录器，可自动描出纪录曲线。蛋白质化学试验一.双缩麻测定蛋白含量1 .原理：蛋白分子中含有很多肽键，与双缩版结构类似，在碱性溶液中与Cu2+ 结合形成紫色化合物，此反应称为双缩胭反应，紫色化合物在520nm波长下有 最大光汲取。在肯定浓度范围内，颜色的深

7、浅与蛋白质浓度成正比，所以可用比 色法测定蛋白质含量。含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。 2.方法：采纳标准曲线法标准曲线制作（1）取小试管6支，编号，按下表操作双缩胭法操作步骤表试剂（mL）管号123456标准蛋白质溶液0. 10.30.50.70.9生理盐水0.90.70.50.30. 11.0双缩胭试剂4.04.04.04.04.04.0（2）混匀后，于37水浴中保温15min,在520nm波长下比色，以第6管调零 点，测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度的克数为横 坐标，绘成曲线。样品测定 取蛋白质样品0. 1mL,加生理盐水0. 9mL,再加双缩

8、月尿试剂4mL, 于37。水浴中保温15min,在520nm波长下比色，测得其吸光度，依据吸光度值 查标准曲线即得出每100mL样品中蛋白质的克数。二.考马斯亮兰法测定蛋白质含量L原理：考马斯亮兰G250存在着两种不同的颜色，红色和蓝色。它与蛋白质通 过范德华力结合，染料与蛋白质结合后颜色由红色变成蓝色，最大汲取峰从 465nm变成595nm,通过测定595nm处的光汲取的增加量可知与其结合蛋白质的 量。此结合物1小时内稳定。2 .优点：灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达lug;测定速度快、简便，只需 一种试剂；干扰物质少。3 .方法：采纳标准管法取试管3支，编号，按下表操作考马斯亮兰法测定蛋白

9、质表试剂（血）空白管标准管标本管一生理盐水671标准蛋白溶液0.1样品0. 1考马斯亮兰试剂5.05.05.0混匀，室温放置5min,在波长595nm处，以空白管调零点。测定各管的吸光 度值。计算（切标本/勿标准）X50 =样品中蛋白质的含量Hg/mL三.紫外分光光度法测定蛋白质含量1 .原理：蛋白质分子中含有的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基的苯环含有共 辄双键，使蛋白质具有汲取紫外光的性质，汲取高峰在280nm波特长。由于各种 蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内汲取峰的吸光度值 与其浓度成正比，可作定量测定。由于各种蛋白质中芳香族氨基酸含量的不同， 因而此法适于测定与所

10、采纳的标准蛋白质的氨基酸组成相像的蛋白质，以削减误 差。一般核酸在280nm波特长也有汲取，对蛋白质测定有干扰作用，但核酸的汲 取高峰在260nni,因此溶液中同时存在核酸时，必需同时测定嬴。和桃也 通过 计算消退核酸对蛋白质的影响算出蛋白质的含量。由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在280nm处具有最大汲取， 且各种蛋白质的这三种氨基酸含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的 吸光度值是最常用的紫外汲取法。2 .方法：采纳标准曲线法标准蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏定氮法测定蛋白质的含量，用 生理盐水稀释至浓度为Img/mLo3 取试管6支，编号，按下表操作。紫外汲取法标准曲线制作步骤表混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第6管调零点，在280nm波长下测 定各管的吸光度值，以各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度的克数为横坐标, 绘成曲线。试剂（mL） _管号123456标准蛋白质溶液0. 51.01.52.02. 50生理盐水3.53.02.52.01.54.0标本的测定：用生理盐水将待测标本的蛋白质浓度稀释成大约lmg/矶，取标 本1.0mL,加生理盐水3. 0mL,混匀，按上述方法测其02%,依据标准曲线得出 蛋白质的浓度。