抗冻蛋白和冰核蛋白对植物抗冻性能的作用机制.doc

《抗冻蛋白和冰核蛋白对植物抗冻性能的作用机制.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗冻蛋白和冰核蛋白对植物抗冻性能的作用机制.doc（6页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、经济林研究2009, 27 (2) : 1252130N onw oodF ores t R esea rch抗冻蛋白和冰核蛋白对植物抗冻性能的作用机制樊绍刚, 张党权, 邓顺阳, 明付焕( 中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室, 湖南 长沙 410004)摘 要: 植物抗冻蛋白是避免植物寒害冻害发生的重要物质, 相对而言, 极地的鱼类和昆虫的抗冻蛋白具有低热滞活性和高重结晶抑制活性的特征。 冰核活性蛋白是由冰核活性细菌、真菌或昆虫合成的生物冰核 剂, 降温初期可提高水溶液的冰核形成的温度, 温度过低时可降低水的过冷却点。 比较分析了抗冻蛋白和冰 核蛋白的生物学特性、蛋白特征

2、及其对水分子固液两相间变化的调控机制, 这对于揭示植物抗冻性能的复杂 的作用机制和植物抗冻基因工程应用的研究有着重要的意义。关键词: 过冷却; 抗冻蛋白; 冰核蛋白; 植物抗冻性; 综述中图分类号:文献标识码:文章编号: 1003- 8981 ( 2009) 02- 0125- 06Q 51AM echan ism of An t if reeze Pro te in an d Ice Nuc leopro te inon P lan t An t if reeze A c t iv ityFA N Shao- gan g, ZHA NG D an g- quan , D ENG Shun -

3、 yan g, M ING Fu- huan(Key L ab o f N o n2w oo d Fo re st P ro duc t s o f S ta te Fo re st ry A dm in ist ra t io n,C en t ra l So u th U n ive r sity o f Fo re st ry and T ech no lo gy, C h ang sh a 410004, H unan, C h ina)A bstrac t: P lan t an t if reeze p ro te in is a k ind o f im po r tan t m

4、 a te r ia ls w h ich avo id co ld and f ro zendam age. Com p a red w ith f ish e s and in sec t s in po la r reg io n, p lan t an t if reeze p ro te in s h ave low h y ste re sis ac t iv ity and inh ib ito ry ac t iv ity o f h igh rec ry sta lliza t io n. Ice nuc leop ro te in s a re b io lo g ica

5、l ice nuc le i agen t o f ac t ive bac te r ia, fung i and in sec t s, w h ich inc rea se aqueo u s so lu t io n tem p e ra tu re o f ice nuc le i fo rm a t io n in ea r ly coo ling stage, and dec rea se sup e r coo ling po in t o f w a te r tem p e ra tu re. B io lo g ica l and p ro te in ch a rac

6、te r ist ic s o f an t if reeze p ro te in and ice nuc leop ro te in, regu la to ry m ech an ism o f so lid2liqu id p h a se ch ange s o f w a te r m o lecu le s w e re ana lyzed, w h ich w a s o f g rea t sign if icance in revea ling com p lica ted an t if reeze m ech an ism and p lan t an t if ree

7、ze app lica t io n s o f gene t ic eng inee r ing re sea rch e s.Key words: sup e r coo ling; an t if reeze p ro te in; ice nuc leop ro te in; p lan t an t if reeze ac t iv ity,lite ra tu re rev iew有关低温科学研究的结果表明, 纯水在冰点 (0) 以下仍能保持液体状态而不结冰, 而体积非常微小的液滴 ( 10 L ) 甚至可以冷却至- 39以下仍不结冰。这种低于冰点温度但不发生冻结的现象即是过冷却

8、( sup e r coo lin g)。在致冷因素持续作用下降至某温度时, 过冷状态迅速瓦解发生冻结, 该温度即组织的过冷却点 ( sup e r coo lin g po in t)。 植物细胞水具有过冷却作用, 即使在- 7 或- 8 的低温下也不结冰, 生物体正是通过调节体内的过冷却点以适应生存环境的, 生物学研究中常把过冷却点作为生物体抗寒性和抗冻性的重要评价指标。收稿日期:基金项目: 作者简介: 通讯作者:2008211220国家自然科学基金 ( 30700643) 。樊绍刚 ( 1983- ) , 男, 河南郑州人。 硕士研究生, 主要从事植物分子生物学的研究。张党权 ( 197

9、6- ) , 男, 江西临川人。 副教授, 博士, 主要从事植物分子生物学与森林培育学的研究。E 2m a il: zh angdangquan 163. com 。菌、病毒、血液等是自然界活性最强的冰核剂, 可使水在较高的亚低温下 (- 2 - 5 ) 都能结冰。植物抗冻蛋白 (A F P ) 是植物体经低温诱导后产生的一类具有热滞活性和重结晶抑制活性的抗逆蛋白, 普 遍存在于越冬植物体内, 通过抑制细胞外重结晶和控制冰晶生长, 从而避免了大冰晶对机体的损伤。 冰核蛋白( IN P s) 的存在提高了植物细胞水冰点温度, 使得冰核活性细菌具有在较高温度 (- 2 5 ) 下形成规则、细腻、

10、微小异质冰晶的能力。 研究者发现, 冰核蛋白与抗冻蛋白在控制冰晶形态和抑制重结晶上有着异曲同工之处,比较两者的生物结构和作用机制, 可为植物抗冻基因工程的研究和制定相应的抗冻策略提供新的思路。1植物抗冻蛋白1. 1 植物抗冻蛋白的生物学特性早在 20 世纪 60 年代抗冻蛋白已被发现, 但直到 1992 年加拿大的 G r iff ith 等人1 才第 1 次分离纯化得到植 物抗冻蛋白。 他们从经过低温诱导的冬黑麦中发现了由内源产生的A F P s, 且从冬黑麦叶片的质外体中提取并部分纯化了这种蛋白, 结果发现了其非依数性地降低水的冰点并改变冰晶的正常生长模式。这一特性与之前发现的极地鱼类和昆

11、虫抗冻蛋白的特性相一致。 抗冻蛋白非依数性降低水溶液的冰点 (f reezin g po in t, F P ) 而不 影响熔点 (m e lt in g po in t, M P ) 的特性仍由溶液的依数性决定, 从而导致熔点和冰点之间出现差值, 即为热滞 活性 ( th e rm a l h y ste re sis ac t iv ity, T HA ) , 抗冻蛋白也因此被称为热滞蛋白或温度迟滞蛋白 ( th e rm a l h y ste re sis p ro te in s, T H P s) 2 。这种只影响结冰而不影响熔化的热滞效应就是A F P s 的重要特征。A F P

12、 还具有冰晶形态 效应和重结晶抑制 ( rec ry sta lliza t io n in h ib it io n , R I) 效应, A F P 改变了冰晶在纯水中以平行于晶格基面 a 轴的 方式生长, 在低浓度A F P s (m o l/L ) 下优先抑制冰沿 a 轴的生长, 高浓度下冰晶主要沿 c 轴生长, 形成六边双棱 锥及针形晶体3 。并且, 它可抑制冰晶重结晶的发生, 使形成的冰晶小而均匀, 防止大冰晶对细胞的伤害。植物 A F P s 的主要功能为: 即通过调整原生质溶液的状态, 降低过冷却点, 避免植物体内形成冰晶, 抑制冰晶的重结 晶和修饰胞外冰晶的生长形态。1. 2

13、 植物抗冻蛋白的功能特征就目前已被纯化的胡萝卜、冬黑麦、欧白英、黑麦草、沙冬青等植物抗冻蛋白而言, 其分子量与氨基酸组成 各不相同, 个体之间几乎没有同源性, 抗冻蛋白的多样性为其科学研究和应用提供了更大的选择空间。 植物抗冻蛋白的 T H 活性低于鱼类 ( 0. 1 0. 5 ) , 远远小于昆虫, 但植物A F P s 的重结晶抑制活性比鱼类和昆虫的A F P s 要高出 10 100 倍。因此, A F P s 提高植物抗冻性的主要途径不是阻止冰晶的形成, 而是调控胞外冰晶的 增长及抑制冰的重结晶, 一方面将冰晶的形成控制在细胞之外, 另一方面控制冰晶的形状和重结晶, 使形成的冰晶小而均

14、匀, 避免冰晶增大而产生致死性的机械损伤。植物抗冻蛋白同时具有抗冻、抗病双重功能。D um an 从欧白英S oln um d u lcam a ra 的冬季枝条中分离得到 的富含甘氨酸分子量为67 kD a 的抗冻糖蛋白, 用2半乳糖酶处理后其抗冻活性消失, 这表明半乳糖是该蛋白抗 冻活性的关键组成部分4 。G r iff ith 等人发现, 冬黑麦S eca le ce rea le 中有3 种A F P s 的N 2端序列与3 种抗真菌蛋 白 (内切几丁质酶、内切21, 3 葡聚糖酶和T h aum a t in 2lik e 蛋白) 具有同源性, 免疫检测结果呈阳性, 这说明冬黑 麦中

15、的抗冻和抗病反应有着共同的或相似的反应体系。江勇等人从沙冬青A m m op ip ta n th u s m on g ol icu s 叶片中 分离得到热稳定的A F P , 其中一种A F GP 的N 端 20 个氨基酸残基为SDDL SF IFN K FV PCQ TD IL F , 他们发现, 该序列与植物凝集素有较高的同源性, 但需要进一步的研究5 。1998 年, 英国 Yo rk 大学的D aw n W o r ra ll 等人 发现, 胡萝卜的抗冻蛋白由富含亮氨酸的重复序列组成, 其序列编码与多聚半乳糖酸酶抑制蛋白有很高的同源 性, 且他们首次得到了植物抗冻蛋白的编码序列6

16、。1999 年,M ich ae 等人从桃树P ru n u s p e rs ica 的树皮中提取 到了一种脱水蛋白 PCA 60, 其由 472 个氨基酸组成, 富含赖氨酸、甘氨酸, 分子量为 50 kD a , 具有较强的修饰冰 晶的能力, 这是首次发现的具有脱水素蛋白特性的抗冻蛋白7 。 2000 年, Yo rk 大学的科学家们又在低温诱导 的黑麦草L ol ium p e ren n e 中发现了具有热稳定性的A F P s, 其由118 个氨基酸组成, 分子量为11. 77 kD a , 其热滞 值 ( 0. 10 0. 45 ) 远远低于鱼类和昆虫, 但其对冰晶重晶化的抑制效应

17、是大洋条鳕的抗冻蛋白 ( T yp e l ) 的200 倍, 在100 时仍稳定存在8 。2002 年, N e lly 等人从bo reo gadu ssa ida 中分离纯化得到了一种N 端被甲基化 的A F GP。他们在以核磁共振和傅立叶变换红外光谱仪研究其动力学构象原中发现, 该A F GP 无论在什么条件 1994-2013 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserv第 2 期樊绍刚等: 抗冻蛋白和冰核蛋白对植物抗冻性能的作用机制127下基本上都保持着一种相似的三维折叠结构, 其水化作用

18、和相对稳定的主链构象在抑制冰晶生长中发挥着重要作用。 H u an g 等人从冬季欧白英中克隆得到了一种热滞蛋白基因 ST H P 264, 并得到了全长的热滞蛋白 ST H P 264。 该蛋白与W R K Y 蛋白极为相似, W R K Y 蛋白是植物体内调节病原菌相关蛋白 (p a tho gen re la ted p ro te in ) 翻译的重要因子, 由此推测, A F P s 和抗病蛋白可能存在着某种联系。K um b le 通过对黑麦草 E ST 文库 的筛选发现了 5 条编码具有重结晶抑制活性蛋白的基因, 并将其定义为冰活性蛋白 IC P s ( ice2ac t ive

19、 s p ro te in s) 基因, 每个编码蛋白N 端都富含亲水性氨基酸且存在着信号肽, 其中的 4 条有与植物蛋白激酶受体相似的亮氨酸富集区, 其C 端则存在着XXN XV X G 的重复结构, 这一结构参与形成了 IC P s 高级结构的冰晶结合位点的 2 卷曲9 。S im en 等人10 从黑麦草、小麦、大麦中鉴定了 15 条冰重结晶抑制蛋白 IR I 基因并进行了分子遗传发育 分析, 结果发现, 其 IR I 家族基因大约发生在36 百万年前; 黑麦草与胡萝卜的编码基因均不含内含子, 且均与拟 南芥的L R R 转膜蛋白激酶同源, 其研究结果还表明, IR I 蛋白由 IR I

20、 结构域复制增加进化而来, 但两者分别采取了不同的分子进化机制。上述各项研究结果都表明, 植物抗冻蛋白与抗菌蛋白具有相似的生化结构, 也就是说, 植物的抗冻和抗病 反应有着共同或类似的反应体系。 这些低温诱导病原的相关蛋白可能起着改变植物体液的结冰特性或冰晶结合位点的作用, 在低温和受到病原入侵时, 植物的细胞壁都会发生一些生理变化以避免细胞内环境受到破坏。1. 3 植物抗冻蛋白的作用机制一般情况下, 相对大多数蛋白质而言, 缓慢生长的冰晶能把蛋白质从冰的前面推开, 从而阻止蛋白质与冰晶相结合, 这导致与冰结合的蛋白质的含量低于溶液中的 10% , 而A F P s 与之相反, 其中的 89%

21、 结合于冰上。A F P s 与冰之间的相互作用非常稳定。R aym o n d 的“吸附抑制”模型理论11 认为, A F P s 通过自身吸附到冰晶表面从而抑制冰晶的生长, 而不是通过把水与冰隔离开来才使得水不再结冰的; 在这一理论基础上, 1983 年, D eV ile s 提出了“晶格匹配”模型, 该模型也被称为“氢键匹配”模型; 1988 年, Y an g 等人提出了“偶极子偶极子”模型; 1993 年, K n igh t 等人12 提出了“品格占有”模型。这4 个模型虽然侧重点各不相同, 但是它们有着一个共同之处, 即A F P s 与冰晶之间通过氢键进行结合, 只是氢键的数

22、量币形成的方式不同而已。因而, 将此 4 个 模型归为“氢键结合”模型这一大类13 。目前, 解释抗冻蛋白机理较好的理论是“表面互补”模型理论14 , 其核心内容是A F P s 的冰晶结合位点所形 成的表面能与冰晶的表面形成互补。该模型理论认为, A F P s 与冰晶之间所形成的表面互补与多种相互作用力 有关, 主要是疏水作用和范德华力, 氢键起着次要的作用。 较强的表面作用力使得A F P s 与冰晶结合是不可逆 的, 这种不可逆性阻止了冰晶的生长。 该模型还成功地解释了, 目前已经发现具有极大差异性的A F P s 能与不同形状的冰晶表面结合, 另一个原因是冰晶含有许多个不同的表面,

23、每个表面的拓扑结构和氧原子间距都不相同, A F P s 在与任何一个冰晶表面结合后都将阻止冰晶的生长。 冰晶就像配体一样, 通过表面互补选择性地与 不同受体的A F P s 结合, 这种表面互补方式可适用于所有的A F P s。不同植物的A F P s 的DN A 和氨基酸序列之间几乎没有同源性15 , 但它们拥有相似的高级结构, 冰晶结合 位点也有一定的相似性。 当前研究较多的黑麦草抗冻蛋白L pA F P , 其理论上的三维结构为一个由个圆环组成 的非常有规律的右手 螺旋, 螺旋上的每个圆环含有 14 15 个氨基酸残基, 由此形成了两个保守的重复单元“XXN XV X G”, 推测这个

24、重复单元包含有L pA F P 的冰晶结合位点, 但还没有确定的具体氨基酸。 在重复单元 “XXN XV X G”中, N 和V 及V 与G 之间主要是T h r 残基, 即“TV T ”残基簇, 这与黄粉虫和云杉A F P 的冰晶结合 位点“T X T ”十分相似, 很有可能是L pA F P 的冰晶结合位点, L pA F P 的冰晶结合表面可以和冰晶棱面形成紧密的表面互补。从中国胡萝卜栽培品种中克隆的D cA F P 的理论三维结构为一个非常有规律的右手 螺旋, 螺旋的每个 环由L R R 基序的24 个氨基酸残基组成, 其结构特征主要为由保守的L (包括 I) 组成的疏水核心和保守的P

25、 和G 组成的转角13 。在24aa 基序中的保守N 的两侧为亲水性很强的氨基酸密集区, 形成一个高度亲水性表面, 这 一表面与冰晶表面刚好形成不完全的互补。D cA F P 的L R R 基序中的高度保守的N 端对于维持这个冰晶结合 表面具有决定性的作用。冰核蛋白1974 年, L. R. M ak i 等人从赤杨树的腐烂树叶中分离出丁香假单胞菌 P seu d om onA s sy rn g a e, 他们发现细 1994-2013 China Academic Journal Electronic P2冰核蛋白。2. 1冰核蛋白的结构特性根据冰核活性细菌 ( Ice n u c lea

26、 t io n ac t ive) 所具有的冰核活性的最高温度, 将其产生的冰核活性蛋白分为三 种类型: I 型冰核活性蛋白 (A 型或 T yp e I) , 在- 5 - 2 就有冰核活性; II 型冰核活性蛋白 (B 型或 T yp e II) ,在- 7 -5 条件下有冰核活性; l 型冰核活性蛋白 (C 型或 T yp e III) , 在- 10 - 7 条件下有活性。细 菌冰核蛋白 IN P s 由冰核基因 ( In a 基因) 单独编码。陆续克隆得到的in a 基因有in a Z、in a W 、in a C、in a E、in a A 、in a X、in a U 、in a

27、 V 等基因, 这些基因都是一些从 3 600 bp 到 4 000 bp 左右的开放读码框16 。 基因序列分析结果表明, 冰核蛋白基因序列同源性为77% 17 。冰核细菌的冰核活性蛋白具有相似的一级结构, 由三个完 全独立的结构域组成: N 2端单一序列结构域, 占整个序列的 15% , 该结构是相对疏水的; C 2端单一序列结构域,占整个序列的 4% , 因富含酸性和碱性氨基酸残基而高度亲水; 中间重复序列R 2结构域, 占 81% , 由冰核基因中间部分的相对保守的不完整的 24 bp 周期性重复的DN A 序列 GCC GGT TA T G2GCA GCA C T GA CC 编码成

28、相 对应的重复的八肽A la G ly T y rG ly S e rT h rL eu T h r 18 , 再由八肽序列构成高度重复的四十八肽,四十八肽中特别富含A la、G ly 、T h r 和S e r。冰核蛋白的二级结构是由氢键连接而形成的 2片层结构, 其重复的 单位具有亲水性, 因此具有显著的亲水性。 冰核活性细菌正是以这种重复序列作为结晶模板的, 将水分子排列成细腻的冰核, 含有冰核细菌的植物在- 2 - 5 的条件下可使植物细胞水结冰。 中心重复区域在结构上表 现出高保真性, 是冰核活性的重要模板。 陈庆森等人19 采用差速离心法分离出有活性的冰核活性蛋白组分,SD S2聚

29、丙烯酰胺凝胶电泳结果表明, 冰核活性蛋白是由一种高保真的 48 肽的单体形式装配而成的多聚体。这一结果与W a tab e 和A ra il 所得结论是一致的, 表现冰核活性的最小结构单位是 240 肽, 分子量约为 26 kD a。G reen 等人对来自于P. sy rin g a e S 203 的 in aZ 冰核基因进行重排后发现, 冰核基因中间重复区的肽段对冰核的形成作用是独立的, 对冰核活性的表达起着重要作用。W a tan ab e K 的研究结果18证实了冰核蛋白基因中间重复序列R 2结构域是表现冰核蛋白活性差异的主要片段。K e iko 等人对冰核活性基因在N 2结构域进行

30、缺失研究后发现, N 2结构域与 IN P 的活性相关, 控制了I 型 IN P 的活性, 但对II 、l 型的 IN P 产生了影响, 这也验证了 R 2结构域是 IN P 的活性作用位点。1995 年,M ich igam i20 用rw in ia u re d ov ora 的 In aU 作突变分析, 结果发现, C 2 末端的12 个氨基酸残基并不是必需的, 但是, 如把包括M e t29 在内的C 2末端的13 个氨基酸全部剔除, 将会导致 冰核活性几乎完全丧失, 且逐步缺失C 2端序列会造成各种类型冰核的完全丧失。对 IN P 基因的分析结果表明,冰核活性基因具有高度的同源性,

31、 中间重复区域是冰核蛋白的活性位点, 基因的完整性是保障冰核活性的前提, 是表达 I 型冰核活性蛋白的基础。T u rn e r 和 Ko zllo ff 于 1991 年研究发现, 冰核蛋白在本质上是冰核蛋白复合物, 且冰核蛋白是通过 P I 而锚 定于细胞膜上的。 冰核细菌表达的强冰核活性物质仅仅依靠细菌的冰核蛋白成分是不够的, 磷脂酰肌醇、磷脂是冰核蛋白复合物的主要成分, 而且是必要成分。Ko zlo ff 和w e staw ay 等人研究发现, a seu d om on a s 和 E rw in ia两种冰核细菌具有磷脂酰肌醇合成酶活性。T u rn e r 和A re llan

32、o 采用二种对P I (p ho sp h a t idy l ino sito l, 磷脂酰肌 醇) 具有不同水解活性的酶对生物活性冰核进行处理, 高度纯化的磷酸脂酶C II 对A 型冰核活性的选择性破坏及冰核蛋白在脱离细胞膜之后冰核活性的大大降低, 证明了 P I 参与了A 型冰核结构的形成, 而且证明了冰核蛋白是一种 P I 锚定蛋白; 磷脂酰基醇和磷脂还增强了细胞膜的强度, 避免了在细胞脱水收缩或再次吸水膨胀 时细胞膜的破裂。2. 2 冰核蛋白的作用机制目前关于冰核蛋白是如何结合到细胞膜相应位点上, 并如何聚合成冰核蛋白复合物及如何表现出冰核活性等问题仍在进一步的探索之中。N的定位有关

33、。端单一序列结构域含有几个较疏水片段, 可能与冰核蛋白在细胞外膜上3抗冻蛋白与冰核蛋白的协作机制植物要抵抗冰冻的危害, 需要具备两个最基本的要素: 一是避免细胞内结冰; 二是细胞膜结构及核酸蛋白质等生命物质应具有低温稳定性。大量研究结果表明, 细胞外结冰和细胞液的过冷却是植物避免细胞内结冰伤第 2 期樊绍刚等: 抗冻蛋白和冰核蛋白对植物抗冻性能的作用机制129害的最主要和最普遍的两种适应机制21 。 植物体内含有大量的水分, 尤其在幼苗、枝叶、嫩芽等组分中水分含量较高, 而水的过冷却特性使得机体有过冷却的特点。但与昆虫和鱼类不同, 植物体直接暴露在低温空气中, 生 存环境不能保温, 因此面对的

34、低温环境更为严峻。植物体内水相体积较大, 没有鱼和昆虫的腔室结构, 过冷却能力较低。 由于可能同时受到植物生理胁迫、机械伤害和环境生物危害等因素的影响, 植物冻害仍成为困扰农业生产的重大问题。长期以来, 抗冻蛋白和冰核蛋白的研究和应用都只局限于促进结冰或抗冻特性单一方面, 而抗冻蛋白在器 官移植、低温保藏等领域的研究取得了很大的成功。 利用抗冻蛋白的多样性, 可适当地将抗冻蛋白应用于生物样品的低温冻存之中, 如富含甘氨酸的雪蚤抗冻蛋白可较大幅度地降低冰点温度 ( 6 左右) , 且在较高温度条 件下抗冻蛋白分解并失去其结构, 从而减少有害抗体形成的可能性; 还能显著提高细胞的存活率, 甚至使原

35、先 不能存活的样品冻存成功, 从而延长人体器官的体外寿命, 以便于运输。在实际使用时浓度不宜太高, 浓度过高 时, 虽然能阻止溶液重冰晶, 但膜表面却会生成大量的冰晶。 冰核蛋白则应用于促冻杀虫、人工降雪、食品冷冻 浓缩、人工调节天气、细菌细胞表面展示、报告基因等领域。 根据两者的特性, 从生物化学和生物动力学的角度研究其在低温环境下的相互关系, 是探究生物抗冻机理的新思路, 能为农林业生产上的防寒防冻和基因改良提 供指导。3. 1 冰核蛋白与抗冻蛋白的拮抗作用对于不能忍受冰害的植物, 首先要除去其冰核蛋白的生物活性。 细菌的冰核蛋白, 通常是经由细菌的入侵 伤害而引发植物冻害的发生的, 而抗

36、冻蛋白同时具备了抗病抗逆的双重功能, 迄今为止, 研究者已经发现了很多的植物体内不同抗冻蛋白的各种抗病性, 如植物凝集素、W R K Y 蛋白、脱水素等。研究中还发现, 外界因素如 重金属离子、硫制剂、脲素、巯基试剂、2G 2、蛋白酶、植物外源凝集素等化学试剂和紫外线、钴的照射等物理作用均可对冰核细菌的冰核活性产生一定的影响。这使得我们相信, 生物体内有可能存在抑制冰核细菌及冰核蛋白活性的基因及编码蛋白 (如抗菌素等)。我们也可以寻找生物体内抑制冰核蛋白活性的物质, 如为避免结冰昆 虫体内也含有 IN P s, 通过封闭其冰核活性从而阻止冰晶的生成。深入研究昆虫的生理变化情况, 有助于冰核蛋

37、白抑制剂的发现。利用基因工程手段, 在抗冻蛋白序列中插入抗菌素编码序列或编码磷脂酞肌醇酶和磷脂酶的 基因、合成磷脂酞肌醇酶等, 从而破坏冰核蛋白复合物的结构, 都可作为植物抗冻基因工程的策略。3. 2 冰核蛋白与抗冻蛋白的协同作用昆虫忍耐结冰的生理机制为植物抗冻研究提供了新的思路。在忍耐结冰昆虫的血淋巴中存在 IN P , 可以诱 导胞外在较高的亚低温 (- 10) 条件下结冰, 使细胞内和细胞外溶液与细胞外冰晶水蒸气气压缓慢达到平衡,降低了细胞内冰点和过冷却点, 同时, 细胞膜阻挡冰晶过膜, 降低细胞内及各个细胞器结冰的可能性22 。 这种 结冰机制只是发生在细胞外的血液循环系统和组织周围的

38、体液中, 而不会发生在细胞内。这样能有效防止像避 免结冰昆虫体内的单一由抗冻蛋白作用降低过冷却点而在遭遇气温突变时导致的致死性的发生。 因为当温度 低于过冷却点时, 诱发低温下细胞外结冰, 使细胞周围的血淋巴所含溶质排除在冰晶外, 增加细胞外溶液的渗透压, 引起细胞内的水分向细胞外流动, 细胞缩水且胞外冰晶增大, 造成对虫体的伤害22 。 对于耐受结冰植物来说, 抗冻蛋白和冰核蛋白通过抑制细胞外冰晶重结晶和控制冰晶形态, 同时相当于形成一层屏障, 阻止增长 的冰晶侵入叶表皮和细胞内, 避免了细胞内冰晶的形成。P ih ak a sk i 等人认为, 抗冻植物形成了一种特殊的控制 胞外冰晶形成的

39、机制, 即抗冻蛋白和冰核形成诱导物质的协同作用。前者降低冰点, 减缓冰晶形成的速度; 后者 促进冰晶的形成。 在冰冻温度下, 通过两种物质的协同作用调控胞外水结冰的速度和冰晶的形态, 从而减缓或 避免因结冰而造成的对细胞的机械损伤及渗透胁迫23 。 有些高山植物也能产生冰核, 使胞间水在冰点附近发 生结冰, 把胞内水吸到细胞间以防止胞内结冰, 冰核蛋白复合物中的磷脂酰基醇和磷脂加强了对细胞膜的保护 作用, 防止了收缩膨大时膜的破裂。 对于不能忍受胞内结冰的植物, 施加生物冰核, 应该能够减轻冻害的程 度24 。这就为低热滞活性植物抗冻蛋白和强冰核活性冰核蛋白的配合使用提供了理论依据。可以把细菌

40、的冰 核基因导入植物, 冰核序列具有高保真性, 它有效表达后会产生生物冰核, 这样能大大提高胞间水发生结冰的 温度, 增强抗寒力。冰核蛋白和抗冻蛋白都结合在细胞表面上, 抗冻蛋白结合到细胞表面后大部分与水分子结合, 高度重叠的 冰核蛋白氨基酸序列则为冰核的形成提供了一种必要的晶格序列。 常规的冷冻结构是冰晶无序形成和全向生长, 产生海面状的各向同质结构, 使解冻后的物质具有各向同质的机械特性。 冰核细菌活性可导致各向非同质参考文献:1234G r iff ith M A P , Yang D S C. A n t if reeze p ro te in p ro duced endo geno

41、 u sly in w in te r rye leave sJ . P lan t P hy sio l, 1992, 100 (2) : 593- 596. L D A. A n t if reeze g lycop ep t ide s and p ep t ide s: in te rac t io n w ith ice and w a te r J . M e tho d s Enzym o l, 1986, 127: 293- 303.H o n W C , M lyna rz A. A n t if reeze p ro te in s in w in te r rye a r

42、e sim ila r to p a tho gene sis2 re la ted p ro te in sJ . P lan t P hy sio l, 1995, 109 (3) : 879- 889.G D J. P u r if ica t io n and cha rac te r iza t io n o f a the rm a l hy ste re sis p ro te in f rom a p lan t, the b it te r sw ee t n igh t shade (So lnum du lcam a ra). B io ch im B iop hy s

43、A c ta,1994, 1206 (1) : 129- 135.567魏令波, 江勇, 费云标. 沙冬青叶片热稳定抗冻蛋白特性分析 J . 植物学报, 1999, 41 (8) : 837- 841.W o r ra l D. A ca r ro t L euc ine2r ich 2rep ea t p ro te in tha t inh ib it s ice rec ry sta lliza t io n J . Sc ience, 1998, 202: 115- 117.M ichae l W R W , R o n B. P u r if ica t io n, imm uno

44、lo ca t io n, c ryop ro tec t ive, and an t if reeze ac t iv ity o f PCA 60: A de2 hyd r in f rom p each ( P runu s p e r sica ) J . P hy sio lo g ia P lan ta rum , 1999, 105: 600- 608.C h r is S idebo t tom , D aw n W o r ra ll, R o d H ubba rd, e t a l. H ea t2stab le an t if reeze p ro te in f ro

45、m g ra ssJ . na tu re, 2000, 406.Kum b le K D. C ha rac te r iza t io n o f a fam ily o f ice2ac t ive p ro te in s f rom the R yeg ra ss, L o lium p e renne. C ryo b io lo gy, 2008, 57 (3) : 263- 268.S im en R S. T rack ing the evo lu t io n o f a co ld st re ss a sso c ia ted gene fam ily in co ld

46、 to le ran t g ra sse s. BM C Evo lu t io na ry B io lo gy, 2008, (8) : 245. D av ie s P L , Syke s B D. A n t if reeze p ro te in sJ . C u r rO p in S t ruc t B io l, 1997, 7 (6) : 828- 834.鲍丽丽, 华泽钊, 任禾盛. 抗冻蛋白及其对冰晶生长的影响 J . 华东工业大学学报, 1995, 17 (2) : 51- 59.王金发, 张党权.“表面互补”模型 抗冻蛋白通用的分子机理J . 中山大学学报 (自然

47、科学版) , 2004, 43 (6) : 17- 22.张党权, 谭晓风, 乌云塔娜, 等. 植物抗冻蛋白及其高级结构研究进展 J . 中南林学院学报, 2005, 25 (4) : 110- 114.Ku ip e r M J , D P L W a V K. A theo re t ica l m o de l o f a p lan t an t if reeze p ro te in f rom L o lium p e renne J . B iop hy s, 2001, 81: 3560- 3565.H , S. S. , B ac te r ia in the L eaf Eco sy stem w ith Em p ha sis o n P seudom o na s sy r ingae a P a tho gen, Ice N uc leu s, and Ep ip hy te. M ic ro b