宏基因组学概述.doc

《宏基因组学概述.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《宏基因组学概述.doc（8页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、宏基因组学概述王莹,马伊鸣(北京交通大学 土木建筑工程学院 环境1402班)摘 要:随着分子生物学技术得快速发展及其在微生物生态学与环境微生物学研究中得广泛应用,促进了以环境中未培养微生物为研究对象得新兴学科微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学,英文名Metagenomics)得产生与快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物得DNA,构建宏基因组文库,利用基因组学得研究策略研究环境样品所包含得全部微生物得遗传组成及其群落功能.在短短几年内,宏基因组学研究已渗透到各个领域,包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术,农业、生物

2、防御及伦理学等各方面显示了重要得价值。本文对宏基因组学得主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述关键词:宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库得构建Macro summary of MetagenomicsWang Ying, Ma YiMing (BeijingJiaotongUniversity, Institute of civil engineering,)Key words: Metagenome; Metagenomics; The environmental genomics宏基因组学(Metagenomics)又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部

3、微生物得DNA,构建宏基因组文库,利用基因组学得研究策略研究环境样品所包含得全部微生物得遗传组成及其群落功能。它就是在微生物基因组学得基础上发展起来得一种研究微生物多样性、开发新得生理活性物质(或获得新基因)得新理念与新方法。其主要含义就是:对特定环境中全部微生物得总DNA(也称宏基因组,metagenomic)进行克隆,并通过构建宏基因组文库与筛选等手段获得新得生理活性物质;或者根据rDNA数据库设计引物,通过系统学分析获得该环境中微生物得遗传多样性与分子生态学信息。1、起源宏基因组学这一概念最早就是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门得Jo Handelsman等提出得,就是源于将来自

4、环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析得想法,而宏得英文就是meta,具有更高层组织结构与动态变化得含义。后来伯克利分校得研究人员Kevin Chen与Lior Pachter将宏基因组定义为应用现代基因组学得技术直接研究自然状态下得微生物得有机群落,而不需要在实验室中分离单一得菌株得科学。2 研究对象宏基因组学(Metagenomics)就是将环境中全部微生物得遗传信息瞧作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间得关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养得困难, 而且还可以结合生物信息学得方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用得规律, 大大拓展了微生物学得

5、研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物得生态特征与功能开辟了新得途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究得热点与前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目得重要成果。3 研究方法宏基因组学得研究过程一般包括样品与基因(组)得富集;提取特定环境中得基因组 DNA;构建宏基因组 DNA 文库;筛选目得基因;目得基因活性产物表达(图 1)五个步骤。 图1 环境微生物宏基因组学研究过程Fig、 1 General process of metagenomic strategie3、1 环境样品及目得基因组富集在宏

6、基因组文库筛选过程中目得基因仅占总 DNA 得一小部分, 对环境样品得预富集可以大大提高目得基因得检出几率。目前预富集技术主要分为细胞水平富集与基因组水平富集。其中细胞水平富集主要就是通过利用选择培养基对目得微生物进行富集培养, 最常用得方法就是底物选择, 此外还包括营养选择及物理化学指标选择。但就是由于富集培养选择性地富集了具有快速生长特性得菌群, 因此导致大部分物种多样性信息丢失。目前可以通过先在严格胁迫条件下短期处理, 然后改为较温与得处理条件, 可以从一定程度上克服这种方法得局限性。基因组水平富集常用得技术为稳定同位素探针技术(SIP), 原理就是采用稳定同位素标记底物, 其中得“重”

7、原子掺入到具有代谢活性得微生物核酸中, 采用密度梯度离心得方法将“重”得 DNA 与“轻”组分分离, 被标记得“重”核酸可以作为 PCR 得模板, 用来构建宏基因组文库。例如采用 C 标记得甲醇研究森林土壤宏基因组 DNA, 结果鉴定出变形细菌 亚纲中所有已知得嗜甲基菌, 并在一种嗜酸菌中发现了新得甲醇还原酶基因。此外, 还有报道利用抑制性消减杂交技术、差异显示技术、噬菌体展示技术、亲与捕获技术及 DNA 微阵技术等技术来富集目得基因。 3、2宏基因组 DNA 得提取获得高浓度、大片段、无偏好得环境样品总 DNA 就是宏基因组文库构建得难点之一。近年已有多种宏基因组DNA得提取纯化方法陆续建立

8、起来, 大体可分为两类: 一类就是直接提取法, 又称原位提取法。这类方法不经过样品中微生物得培养与分离, 通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中得微生物细胞而使 DNA 得以释放, 并对 DNA 进行纯化。其中以 Zhou 法与 Tsai法最为常用。该法操作简便、省时、成本低, 所获得 DNA 具有较好得完整性, 并能够代表某一生境得微生物群落多样性。但该发放常会出现细胞裂解不完全或 DNA 与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题, 所以一般需要进一步得DNA纯化处理, 同时所提取获得得 DNA 片段较小(1 kb50 kb), 主要适用于小片段文库得构建; 另一类就是间接提取法,

9、即异位提取法, 就是利用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来, 再按处理纯培养细胞得方法裂解微生物细胞提取 DNA。该法获得得宏基因组 DNA 受到胞外杂质污染干扰较少, 纯度较高、DNA 完整性好(20 kb500 kb), 适合构建大片段得宏基因组文库。但该法操作较繁琐、费时、成本高、偏差大、DNA 得率较低, 其产率只就是直接裂解法得 1%10%且获得得 DNA 往往不能完全代表样品所在生境得生态学多样性。本实验室对温泉淤泥、纸厂污泥、红树林淤泥、沼泽淤泥等 12 个环境样品得总 DNA 提取方法进行了摸索, 研究工作表明,直接提取法提取效率较高, 不容易丢失物种信息

10、, 能够获得 23 kb 左右得 DNA 片段。并首次加入漆酶来有效去处腐殖酸类物质, 比聚乙烯吡咯烷酮 (PVPP)处理效果更好, DNA 得率更高。而间接提取法 DNA 提取效率较低, 容易丢失物种信息。因此, 建议采用直接提取法获得环境样品得总 DNA, 以便分析环境样品微生物群落多样性信息。3、3 宏基因组文库得构建3、3、1 载体得选择载体选择在宏基因组技术中占有十分重要得地位。载体系统得选择主要依赖于DNA 提取质量、插入片段、质粒拷贝数、宿主菌及筛选方法。根据克隆载体得不同宏基因组文库可分为质粒文库、细菌/酵母人工染色体文库、噬菌体类载体文库。早期宏基因组文库主要以质粒载体与大肠

11、杆菌宿主细胞构建而成得小片段(15 kb)文库。该文库操作简便、拷贝数高、对 DNA 质量要求不高, 适合纯度低或剪切较严重得 DNA 模版。但插入片段小, 筛选量大, 活性比率低, 对大基因簇无能为力, 主要适用于分析新得基因序列信息及筛选编码代谢相关得单一基因或小操纵子。然而, 很多微生物活性物质就是其次生代谢产物, 代谢途径由多基因簇调控, 因此尽量插入大片段DNA以获得完整得代谢途径多基因簇就是很有必要得, 目前已有报道能容纳15 kb40 kb外源DNA得 Fosmid 文库与Cosmid 文库, 同时已经成功构建了容量高达 200 kb350 kb 外源 DNA 得细菌人工染色体文

12、库与酵母人工染色体文库。该文库不仅拥有巨大得插入片段载量, 而且稳定性好、筛选效率高、克隆表达能力强, 可获得基因簇表达活性物质。主要用于分析某一生境中微生物群落多样性及筛选由基因簇或多个基因控制表达得活性物质。但其操作较复杂繁琐、对 DNA 纯度要求较高, 且拷贝数低, 扩增较困难。此外, 噬菌体与其她病毒也可以作为构建宏基因组克隆文库得载体。噬菌体展示库就是一种十分有效得高通量筛选技术, 该技术通过对表面展示表达产物得亲与选择分离相应得 DNA 序列,能够从宏基因组中富集稀有 DNA 序列,但其局限性在于只能表达分子量小于50kD蛋白。3、3、2宿主细胞得选择不同得微生物种类所产生得活性物

13、质类型有明显差异。宿主菌株得选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞中得稳定性、宏基因得表达、目标性状(如抗菌)缺陷型等因素。其中 E、 coli就是最为常用得宿主细胞,其优点就是操作简单、繁殖迅速、培养代谢易于控制。但就是由于环境样品得总 DNA 有很大一部分为真核基因组 DNA, 其在细菌宿主中往往不能表达, 大大限制了这部分基因得筛选。最近已有报道利用链霉菌、假单胞菌等真菌作为受体来鉴定有关新抗生素生物合成得基因。但就是最近得生物信息学研究表明, 对于一个插入子(10 kb)得文库, 为寻找一个目得基因需要筛选 105106 个克隆, 这表明从复杂得宏基因组中筛选目得基因在技术上还存在着

14、其特殊得困难。因此, 宿主系统得进一步探索就是更有效得开发宏基因组资源得关键技术之一。3、4宏基因组文库筛选由于宏基因组文库容量较大, 目标克隆子得筛选一直就是宏基因组学技术中得瓶颈。近年来, 各种宏基因组文库筛选方法相继建立起来, 根据筛选原理大体分为两大类: 序列依赖性筛选法与非序列依赖性筛选法。 1)序列依赖性筛选法, 就是根据文库中得已知序列或保守序列来设计杂交探针或 PCR 引物, 从宏基因组文库中筛选目标序列。该法克服了功能筛选法中必须依赖表达后得活性产物进行检测, 效率较高。其中已知功能基因 PCR 扩增技术就是最为常用得序列依赖性筛选法。此外, DNA 微阵技术与整合子系统技术

15、也可以作为序列依赖性筛选法。例如 Wagner 等应用 DNA 微阵列技术对活性污泥中微生物得群落结构进行了研究, 获得了大量新得信息, Stokes 等利用整合子系统技术成功筛选到与 DNA 糖苷酶、磷酸转移酶与甲基转移酶同源得新基因。但就是该筛选法存在 2 个主要得缺陷: (1) 引物得设计依赖于已有得序列信息, 共同进化得 2 个功能相似得基因难于用“族特异性”引物区分开来, 因此很难发现新得功能基因; (2) 通过 PCR扩增功能基因, 一般只能获得结构基因得一个片段, 而不能获得完整得功能基因。 2)非序列依赖性筛选法, 其不依赖于任何已知序列信息, 仅根据文库克隆子产生得活性物质进

16、行筛选。其中以功能筛选法最为常用, 原理就是直接对目得克隆表达得性状在选择培养基上进行筛选, 已有报道成功筛选出产生木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶及抗菌活性得克隆子。该法筛选能够发现全新得活性物质或全长基因, 但工作量大、效率低, 生物转化得产物仅在少数情况下具有可见性状, 酶活性得检测受到研究方法得限制。此外, 由于受到酶活检测方法得限制, 大多数宝贵得酶资源不能通过上述基于活性得方法发掘出来, 近期基因陷阱技术筛选法倍受研究学者们得关注。其中, (1) 利用目得基因缺失得突变体宿主菌株, 转化后在选择性培养基上进行功能互补得生长特征来筛选。例如 Majernik 等通过缺陷型大肠杆菌为宿主菌构

17、建土壤宏基因组文库, 筛选出了与 Na+/H+反向转运通道相关新基因; (2) 将宏基因组 DNA 随机克隆到无启动子得绿色荧光蛋白基因(GFP)前面, 然后通过荧光激活细胞分离(FACS)技术, 在添加特定底物得条件下对表达库进行富集, 就能够选择出对该底物具有代谢活性得克隆。如 Uchiyama 等利用底物诱导基因表达法从环境宏基因组文库中筛选到新得生物代谢相关基因; Williamson 等利用底物诱导基因表达法从泛洪区土壤宏基因组文库中筛选到新得生物小分子物质。该法优点在于它为高通量筛选提供了保障, 而且不需要对底物进行修饰, 尤其适合于工业生产上得应用。但也存在一些问题: (1) 无

18、法利用不能进入细胞质得底物; (2) 荧光激活细胞分离仪(FACS)对进样设备得要求也比较高; (3) 建立高度耐受“超相容性”表达系统, 以表达任意来源得编码蛋白与酶具有一定难度。4 应用采用宏基因组技术及基因组测序等手段,来发现难培养或不可培养微生物中得天然产物以及处于沉默状态得天然产物。宏基因组不依赖于微生物得分离与培养,因而减少了由此带来得瓶颈问题。随着新一代测序技术得迅猛发展,研究宏基因组得方法也已经发生了翻天覆地得变化:传统得方法就是测定微生物基因组上得16S rRNA基因,这些基因得长度通常在1500个碱基左右,广泛分布于原核生物,既能提供足够得信息,而且具有相对缓慢得进化过程;

19、其保守性与特异性并存,通过保守区与特异区来区别微生物得种属。基于这些特性,科学家们通过选择这些基因区域,方便地研究环境中物种得组成多样性,但就是还不能全面分析环境中得基因功能。而现在,新一代高通量低成本测序技术得广泛应用,科学家们可以对环境中得全基因组进行测序,在获得海量得数据后,全面地分析微生物群落结构以及基因功能组成等。短短几年来,宏基因组学得研究已经渗透到各个领域,从海洋到陆地,再到空气,从白蚁到小鼠,再到人体,从发酵工艺到生物能源,再到环境治理等。4、 1在生态学方面得应用 当今微生物生态学研究得主要目得之一就是将微生物与其所在环境中得代谢过程相联系。在研究得早期 ,科学家利用宏基因组

20、研究探索海洋中未培养得以浮游生物为食得原核微生物,发现古菌螺旋状 RNA 与谷氨酸半醛转氨酶,并首次揭示了基因组织形态,这些信息都显示了非培养系统得生物潜能。随着微生物治理得深入发展,研究者越来越趋向于应用菌群对废水进行生物治理。宏基因组在生态方面得研究方法主要有宏基因组快照测序法、随机鸟枪测序法与荧光原位杂交法等。宏基因组在生态学上得应用主要就是土壤与水体。目前宏基因组学在土壤微生物研究中得应用主要包括两方面:一就是进行土壤微生物及其资源得挖掘,目前得研究工作已经得到大批新基因 ,特别就是在一些极端环境中得微生物宏基因组得研究中得到了一些具有特殊应用价值得功能酶基因;另一方面就是揭示土壤微生

21、物得多样性及其与环境之间得关系。海洋蕴涵着非常丰富得微生物资源,目前已应用宏基因组技术研究了多种海洋次生代谢产物合成途径,其中最为经典得就是研究海洋聚酮类与非核糖体肽类得生物合成基因簇。宏基因组技术在分析环境微生物复杂群落结构领域得到广泛应用。如 Martn 等构建地中海深层水体微生物宏基因组文库, 通过序列分析与 16S rRNA 系统发育比对, 发现该水体得微生物种群与太平洋阿罗哈水域中层水体得微生物种群具有一定得相似性, 并提出在无光得条件下, 温度就是影响微生物种群在水体中分布得主要因素。Zhang 等构建红树林淤泥宏基因组文库, 通过 PCR 扩增及变性梯度凝胶电泳(DGGE) 对该

22、区域固氮菌得多样性进行分析, 结果揭示红树林地区固氮菌得生物多样性特征, 其结果表明多数为变形菌, 也含少数得固氮菌属、除硫单胞菌属、德克斯氏菌属与根瘤菌等。张薇等采用宏基因组技术对西北黄土高原柠条种植区土壤微生物多样性进行分析, 发现变形杆菌纲就是根表土壤区系中得有优势微生物菌群(70、3%), 尤其存在大量能够诱导植物形成根瘤得根瘤菌与对植物有促生长作用得 Proteobacteria 类微生物, 说明了植物根系与土壤环境微生物菌群具有相互选择性; 2008 年肖凯等以宏基因组 DNA 为模板, 采用不同得 PCR 引物对温泉得高温水底沉积物微生物多样性进行分析, 发现了一株新得菌株 JS

23、X2 与在美国黄石公园温泉发现得未培养细菌有 95%得相似性, 并且与嗜热蓝细菌聚球藻有 89%得相似性。近年来宏基因组技术在环境病毒及噬菌体得多样性分析方面也被广泛应用。例如 Fierer 等通过构建牧场、沙漠、雨林土壤宏基因组文库对环境中细菌、古生菌、真菌及病毒多样性进行了研究, 并揭示了土壤环境中包含着大量不可培养得新病毒种类, 其基因型特征与常规培养获得得病毒具有很大得差异性; Kim 等通过构建稻田土壤宏基因组文库, 利用多重置换扩增 (MDA)技术对土壤样品中病毒基因多样性进行了研究, 结果表明扩增得到得病毒基因序列与目前报道得病毒序列具有很大得差异性, 进一步说明了土壤环境中包含

24、着大量不可培养得病毒种类; Sabet 等通过构建宏基因组文库对美国莫诺湖水体中噬菌体得多样性进行了研究, 研究发现不可培养得噬菌体才就是该特殊生境中得优势群体, 揭示了海洋就是一个巨大得未知 RNA 病毒库60; Breitbart 等通过构建海水及海底沉积物宏基因组文库对该地区不可培养病毒得多样性进行分析, 结果发现扩增得到得病毒基因型中 65%为新得基因型, 其中包含一类海藻病毒, 多数病毒具有新得基因型, 与节肢动物与高等植物病毒存在很大得序列差异性61; 2003 年 Breitbart 等首次通过构建宏基因组文库对人体排泄物中得未培养病毒多样性进行研究, 经过扩增及鸟枪测序鉴定,

25、结果表明获得得病毒大约有 1200 种基因型, 其基因序列与先前报道得病毒序列具有很大得差异性, 多为新得基因型病毒, 并揭示存在人体中得新病毒与人类疾病可能具有一定得相互性; 2005年 Cann等通过构建宏基因组文库对马排泄物中得未培养病毒多样性进行研究, 经过测序鉴定, 获得 233 种不同基因型得病毒, 其中 52%为长尾噬菌体科, 26%为未分类得噬菌体, 17%为肌病毒科; 4%为短尾病毒科; 2%为脊椎动物正痘病毒。总得来说, 宏基因组技术为微生物多样性研究提供了巨大得平台。4、 2在新型生物催化剂中得应用 宏基因组学技术最引人注目得贡献主要集中在新型生物酶制剂得探索与开发领域。

26、近年来研究者们已成功构建了土壤、海底淤泥、温泉淤泥、油厂污泥、动物瘤胃内容物、动物粪便等宏基因组文库, 并筛选到脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、乙醇氧化酶、木聚糖酶、纤维素酶及脱羧酶等酶制剂, 并且在此基础上获得新酶得许多特征信息(表 1)。所采用得载体种类十分广泛, 包括 Fosmid、Cosmid、BAC、 噬菌体以及各种穿梭载体, 所采用得宿主系统为常用得大肠杆菌、链霉菌与假单胞菌等。 通过宏基因文库筛选得到得生物分子大多数与已知得基因产物相似性差或者完全就是新得分子, 这些新得生物分子主要来源于环境未培养微生物得基因与其多样得代谢物。环境样品 DNA 得克隆与筛选只就是所有环境遗传信息多样性得

27、一小部分, 环境微生物与宏基因组得多样性仍旧就是发现新得天然活性产物得丰富广阔资源, 为研究者们探索开发新得生物催化剂提供了巨大得资源空间。新型催化剂主要就是酶。传统得新型酶得筛选方法限制了筛选得广泛性与有效性。宏基因组学则克服了这一限制,有效地提高了新酶得筛选效率,现已发现了抗生素及维生素生物合成相关基因簇得克隆 ,以及水解酶类与氧化还原酶类编码得基因。 宏基因组技术通过对环境得直接克隆,为研究与利用占微生物 99%以上得非培养微生物提供了新得途径,为微生物得研究与发展提供了全新得策略。但此技术得开发利用还有许多亟待解决得问题:如上面提及得两种 DNA得提取方法各有其缺陷,使获得得 DNA不

28、能完全代表样品DNA组成,这就需要进一步优化样品 DNA得提取方法。另外,应根据筛选目得选用合适得载体与宿主菌。再者,文库得筛选方法有待进一步完善,对于序列筛选法来说主要就是测序得速度与费用问题,功能筛选法则需克服从几万到几十万个克隆中只能筛选到几个有活性得基因得状况,应建立更为敏感得高通量筛选方法。宏基因组学技术克服了传统新型酶得筛选方法在筛选得广泛性与有效性不足这一缺点,在新型生物酶制剂得开发应用上有着长 足得进步。目前已经从构建得宏基因组文库(如海底淤泥、温泉淤泥、动物粪便、动物瘤胃内容物等)成功筛选到蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、 木聚糖酶、纤维素酶、水解酶类与氧化还原酶类等酶制剂。4、3

29、宏基因组学在医学上得应用 宏基因组技术得出现为新药物得探索与发现提供了可能得技术支持, 并扩大了微生物代谢产物及分子活性物质筛选平台。例如早在 2000 年, Wang 等构建土壤宏基因组文库 , 通过文库筛选获得 TerragineA 及其相关成分, 目前已广泛应用于医学治疗领域, 证明了自然环境中得丰富微生物代谢产物可以通过宏基因组技术为人们所利用; 同年 Brady 等从土壤宏基因组文库中筛选发现一种长链 N酰氨基酸抗生素物质; 并在 2004 年构建凤梨科植物树茎流出液宏基因组文库, 筛选鉴定获得了抗菌物质 PalmitoylPutrescine。2001 年 Macneil 等构建了

30、土壤宏基因组 BAC 文库, 通过序列分析筛选获得 5 个能产生抗菌小分子物质靛玉红并对其相关成分进行研究; 2002 年 Gillespie 等构建土壤宏基因组文库筛选获得两种抗菌物质 Turbomycin A 与 B, 并且发现 Turbomycin A 与 B 对革兰氏阴性与革兰氏阳性菌具有广谱抗菌活性; 2003 年 DiazTorres 等通过构建人唾液宏基因组文库, 筛选获得一种新得四环素抗性基因 Tet(37), 该活性物质对四环素具有很好得抗性; 2008 年 Mori 等通过活性污泥宏基因组文库筛选获得两种不同得博来霉素抗性基因, 经过比对发现于来源放射菌类基因差异较大, 可

31、能为新得博来霉素抗性基因。国内在利用宏基因组技术获取新型药物得研究较少, 尚处于萌芽阶段, 赵晶等从南极中山站排污口采集污泥, 构建宏基因组文库, 并通过差异性 DNA 修复实验 (DDRT)筛选得到具有抗肿瘤效应得物质。同时利用宏基因组技术研究探讨人类肠道中不可培养微生物多样性也有了很大进展。如 Kurokawa 等利用宏基因组技术对 13 个处于不同年龄层得健康人体粪便微生物种群进行了研究,结果分析表明未断奶婴儿得肠道微生物种群在系统发育与基因组成上具有较大个体差异性,而在成人及已断奶儿童则呈现出高度得功能一致性,并对成人及婴儿肠道内编码该生境微生物主要功能得基因家族得特性进行分析,发现了

32、一个新得人类肠道微生物基因家族与一个共扼转座子。2003 年 Breitbart 等通过构建宏基因组文库对人体排放物中得未培养病毒多样性进行研究,经过鸟枪测序法鉴定, 获得得病毒大约有 1200 种基因型,结果比对表明其基因序列与先前报道得病毒具有很大得差异性,大多数为新病毒, 并证明这些病毒极有可能与人类得疾病有着密切得关系。2008 年 Finkbeiner 等通过构建 12 个腹泻小孩肠道内容物宏基因组文库,来观察病人肠道中病毒得生物多样性,发现扩增得到得病毒序列与 GenBank 病毒库中得已知序列同源性很低, 并推断这些病毒极有可能与人类得腹泻疾病有着密切得关系。随着宏基因组技术得成

33、熟,必将加快宏基因组技术在医学中得应用。在人体微生物抗药性得研究, 人体与不可培养病原菌得相互关系得探索等方面将做出重大贡献。宏基因组技术突破了大量微生物无法通过纯培养方法而进行研究得束缚,为新药得开发与利用提供了技术支持,相信随着宏基因组技术得成熟,该技术在发现新基因、研究人体微生物抗药性以及与不可培养病原微生物得相互关系方面做出重大贡献。4、4宏基因组学在气候变化中得应用 由人类活动引起得全球气候变化问题一直备受关注。其中, 温室气体特别就是CO2浓度得上升引起得全球变暖问题尤其受到关注。气候变暖将对地球碳氮等物质循环、陆地及海洋生态系统功能等产生重大影响。同时, 地球化学物质循环(如碳、

34、氮、磷、硫等)也就是生态系统响应气候变化得关键过程, 而微生物就是该循环过程得主要驱动力。近年来, 宏基因组学得运用为微生物对气候变化响应与反馈得研究提供了全新得视角, 并取得了相当大得进展。例如, Danovaro等得研究表明, 海洋中病毒得结构、功能以及病毒与宿主得相互作用都受到全球气候变化得影响, 并反作用于全球气候变化与物质循环。另外, Simister等研究了珊瑚礁微生物群落对升温得响应, 发现处于生长状态得珊瑚礁上得微生物群落不受温度升高得影响, 而坏死珊瑚礁上得微生物得群落结构与组成发生了改变。上述研究结果都说明微生物群落得复杂性, 不同得种群有不同得反应机制, 因此微生物群落得

35、结构与功能需要进一步深入探讨。 Zhou等基于功能基因芯片得长期增温实验表明, 土壤微生物群落结构在增温条件下发生了显著改变, 分解易降解碳得基因变得活跃, 而分解难降解碳得基因并没有显著改变, 保证了土壤碳存储得相对稳定。通过构建微生物得分子生态学网络, Deng等发现不同气温条件下, 微生物基因在网络中扮演得角色以及相互作用规律发生了明显改变。另外, 功能基因芯片也被用于研究CO2浓度升高得效应。CO2浓度升高刺激了调节重要物质循环过程基因得活性, 其中碳固定基因、易降解碳基因以及氮循环基因得数量明显增多。另一方面, He(2012)基于系统发育芯片得实验发现, CO2浓度升高导致微生物可

36、操作分类单元operational taxonomic unit,OTU)得丰度显著增加。将上述两种芯片分别进行网络构建后发现微生物基因间得相互作用受到CO2浓度得显著影响, 且不同CO2浓度下发挥关键作用得特征基因与模块得核心基因均不同。4、5宏基因组学在水处理工程系统中得应用对水处理工程系统得微生物群落组成与功能研究, 尤其就是对活性污泥中微生物得研究, 不仅有助于深入了解反应器处理污染物得作用机理, 更可以指示反应器得性能, 为系统运行提供预警与管理措施。Ye等基于Illumina高通量测序得研究揭示了不同反应器中微生物整体新陈代谢路径相似, 但参与特定糖类代谢与膜运输得基因显著不同。在

37、不同污水处理反应器与不同采样时间条件下, 微生物得降解基因丰度与多样性有显著差异, 这一结果为监测与评估活性污泥降解有机污染物与净化废水能力提供了重要依据。此外, Illumina技术得应用还包括对饮用水氯消毒得微生物研究。研究发现, 微生物群落结构显著受到氯消毒得影响, 抗性微生物与微生物得抗性基因都得到浓缩, 其中变形菌(Proteobacteria)就是优势抗性微生物。Ye与Zhang利用罗氏454测序技术也有效揭示了活性污泥中微生物得优势种群为研究活性污泥中得微生物群落结构组成提供了重要信息。4、6宏基因组学在石油污染中得应用如果原油或其她石油制品在开采、炼制、贮运与使用过程中进入环境

38、, 则容易造成环境污染, 严重影响土壤与水得生态环境与质量, 甚至危害人类健康。目前, 利用微生物降解对石油污染进行生物修复越来越受到关注, 其主要思路就是通过调控土壤或水体得微生物生态环境, 改变微生物群落结构, 以提高微生物降解石油得活性与能力。对此学者已开展了对石油污染得土壤或水体中微生物群落特征得研究, 希望能够找到在降解污染过程中起作用得关键微生物或功能基因。 Kostka等利用高通量测序技术研究了2010年墨西哥湾石油污染事件对沿海沙滩得影响, 发现石油污染对微生物群落得丰度与组成有明显得扰动, 而变形菌(Gammaproteobacteria)中得食碱菌属(Alcanivorax

39、)、海杆菌属(Marinobacter)与变形菌(Alphaproteobacteria)中得红杆菌科(Rhodobacteraceae)中得微生物对自然清除石油污染起了关键作用。这一成果被Dos Santos使用454测序得工作所部分证实, 海细菌属(Marinobacterium), 海杆菌属(Marinobacter)与解环菌属(Cycloclasticus)微生物种群在石油污染得土壤中丰度增加, 因此这些微生物可以用来作为表征石油污染得关键指示类群。5 目前遇到得问题样品得提取方法还有待改进,生物信息分析依赖于样品得复杂度。6 结论鉴于99% 以上得微生物无法通过培养来获得,而这些微生

40、物中又蕴含了大量得有价值得活性物质,所以宏基因组技术得利用就显得尤为重要。所幸得就是到目前为止已经利用宏基因组技术获得了许多全新得功能基因与活性物质,在药学与生物技术方面都有着重 要得应用。同时我们也应该瞧到,作为一种新兴得技术,宏基因组技术才刚刚起步,在整个技术流程中还有许多问题需要解决。这些问题主要集中在两个方面,一个就是载体系统得选择,一个就是宿主系统得选择。目前得载体系统多以质粒与BAC为主,由于质粒所承载得克隆能力较小,无法满足大片段目得基因得携带,而BAC载体虽然能插入较大得基因片段,但其拷贝数较少,产生得活性物质较少。目前得宿主系统多以细菌为主,选用真核生物作为宿主系统得较少。由

41、于真核微生物相比较细菌来说具有更加复杂得基因转录表达体系,最终导致许多真核微生物基因无法在细菌中表达,因此研究利用真核微生物作为宿主系统就显得尤为迫切与重要。另外,DNA得提取方法、文库得筛选方法等都需要进一步得完善与改进。需要说明得就是,由于宏基因组技术中涉及海量序列得筛选与比对,这就从另一侧面反映宏基因组技术要与生物信息学紧密结合才能取得预期得效果。幸好现代芯片技术得发展已经可以用来分析宏 基因组文库中得海量数据。宏基因组技术也为生物信息学得发展作出了贡献。总得来说,宏基因组技术作为一个新兴得技术,凭借其再分析未知微生物方面得优势,未来必将为我们带来更多更惊喜得发现。参考文献: 1. 李凤,李艳萍,张小蒙、 宏基因组学得研究方法进展及应用概述J、 生命科学与实验研究、2. 贺纪正,张丽梅,沈菊培,朱永官、 宏基因组学(Metagenomics)得研究现状与发展趋势M、环境科学学报。:200712、043、 彭昌文,颜梅、 宏基因组学研究方法及应用概述、 生物学教学、 2009年(第34卷)第9期4、 黄循柳,黄仕杰,郭丽琼,林俊芳、 宏基因组学研究进展、 微生物学通报、2009、7、20 5、 孙欣,高莹,杨云锋、 环境微生物得宏基因组学研究新进展、 生物多样性、 2013, 21 (4): 11