教学课件第二节蛋白质一级结构的测定方法.ppt

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1、第二节第二节 蛋白质一级结构蛋白质一级结构 的测定的测定 一、蛋白质一级结构定义一、蛋白质一级结构定义(primary structure)(primary structure)在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进行排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们行排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们称为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。称为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。核心：蛋白质中共价连接的核心：蛋白质中共价连接的氨基酸氨基酸残基的排列顺序残基的排列顺序,包包括二硫键的位置。括二硫键的位置。意义：是理解蛋白质结构、作用机制

2、以及与其同源蛋意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋白质生理功能的必要基础白质生理功能的必要基础。蛋白质序列测定的基本战略和步骤蛋白质序列测定的基本战略和步骤l l一一一一 蛋白质序列测序的基本战略蛋白质序列测序的基本战略蛋白质序列测序的基本战略蛋白质序列测序的基本战略l l11、直接法（测蛋白质的序列）、直接法（测蛋白质的序列）、直接法（测蛋白质的序列）、直接法（测蛋白质的序列）l对于一个纯蛋白质，理想方法是从对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至端直接测至C端，端，但目前只能测但目前只能测60个个N端氨基酸。端氨基酸。l2 2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）、间接法（测核酸

3、序列推断氨基酸序列）、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）l蛋白质化学家收集的一个蛋白质资料库（蛋白质化学家收集的一个蛋白质资料库（databaseordatabank）可以在）可以在AltasofProteinSequenceandStructure(.1972-1978,Vols1-5,Washington,DC:NationalBiomedicalResearshFoundation)中找到。然而现在大多数蛋白质序列中找到。然而现在大多数蛋白质序列信息都信息都是从基因核苷酸序列（经过密码子）翻译成氨基酸序列的。是从基因核苷酸序列（经过密码子）翻译成氨基酸

4、序列的。l由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、更有效、信息更多，因此有不少电子数据库问世，更有效、信息更多，因此有不少电子数据库问世，储存的序列资料以惊人的速度不断扩充，并且个储存的序列资料以惊人的速度不断扩充，并且个人电脑可以方便利用。如果现在需要确定一个新人电脑可以方便利用。如果现在需要确定一个新蛋白质的序列，研究者所做的第一件事就是将新蛋白质的序列，研究者所做的第一件事就是将新蛋白质的序列与数据库中的其它已知序列进行比蛋白质的序列与数据库中的其它已知序列进行比较，确定其中是否存在同源性。这些数据库中比较，确定其中是否存在同源性。这些数据库中比较

5、有名的就是美国较有名的就是美国NationalBiomedicalResearshFoundation（国家生物医学研究基金（国家生物医学研究基金会）主持的会）主持的PIR（ProteinInformationResource，蛋白质信息库或，蛋白质信息库或ProteinIdentificationResouece蛋白质鉴定库）蛋白质鉴定库）,美国美国政府支持的政府支持的GeneBankGeneSequenceDataBank（基因序列数据库）（基因序列数据库），还有欧洲的，还有欧洲的EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratory,欧洲分子生物学实验室数据库）。

6、欧洲分子生物学实验室数据库）。llPDB(ProteinDataBank):蛋白质结构数据库蛋白质结构数据库lPDB原来有由美国原来有由美国Brookhaven国家实验室负国家实验室负责维护和管理，为适应结构基因组和生物信息学责维护和管理，为适应结构基因组和生物信息学研究的需要，研究的需要，1998年由美国国家科学基金委员会、年由美国国家科学基金委员会、能源部和卫生研究院资助，成立结构生物学合作能源部和卫生研究院资助，成立结构生物学合作研究协会（研究协会（ResearchCollaboratoryforStructureBioinformatics,RCSB）PDB由由RCSB管理。管理。lP

7、DB是目前最主要的蛋白质分子结构数据库是目前最主要的蛋白质分子结构数据库二、蛋白质一级结构的测定方法二、蛋白质一级结构的测定方法l研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元结构从结构从氨基酸氨基酸算起，已有算起，已有150150年的悠久历史，直到年的悠久历史，直到19551955年，年，SangerSanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序，为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。这在序，为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。分子生物学的发展进程中是一个重要突破。l目前关于核酸的一级结构研究，

8、由于目前关于核酸的一级结构研究，由于SangerSanger等发等发明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。对比明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。对比之下，关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸之下，关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸迅速。迅速。l但随着但随着EdmanEdman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱、质谱以及气相色谱、质谱(GC(GCMS)MS)等方法的相继出现。等方法的相继出现。使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少，蛋白质的一级结构分析。

9、目前不仅样品用量减少，而且工作人员也大大减少。而且工作人员也大大减少。l当年当年SangerSanger分析胰岛素用了整整十年的时间，今天分析胰岛素用了整整十年的时间，今天运用自动化仪器，分析一个分子量在运用自动化仪器，分析一个分子量在1010万左右的蛋万左右的蛋白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的综发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的综述及专著文献较多。述及专著文献较多。三三 测定前的准备工作测定前的准备工作测序前的准备工作测序前的准备工作测序前的准备工作测序前的准备工作：蛋白质的纯度鉴定蛋白

10、质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定要求：要求：纯度纯度纯度纯度97%97%97%97%以上，均一。以上，均一。以上，均一。以上，均一。鉴定方法：鉴定方法：聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳(PAGE)(PAGE)(PAGE)(PAGE)要求一条带，双向电泳。要求一条带，双向电泳。要求一条带，双向电泳。要求一条带，双向电泳。DNSClDNSClDNSClDNSCl（二二二二甲甲甲甲氨氨氨氨基基基基萘萘萘萘磺酰氯）法测磺酰氯）法测磺酰氯）法测磺酰氯）法测N N N N端氨基酸。端氨基酸。端氨基酸。端氨基酸。(3)(3)(3)(3)亲和层析亲和层析亲和

11、层析亲和层析 (4)western (4)western (4)western (4)western 印迹法等印迹法等印迹法等印迹法等测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量估算氨基酸残基数，确定肽估算氨基酸残基数，确定肽链数链数 方法：方法：SDS-PAGE SDS-PAGE，凝胶过，凝胶过滤法，沉降系数法滤法，沉降系数法及测定的一般步骤及测定的一般步骤蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以及及SS定位等。定位等。l l蛋白质测序的一般步骤

12、蛋白质测序的一般步骤蛋白质测序的一般步骤蛋白质测序的一般步骤l（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。l（2）拆分蛋白质分子中的多肽链。拆分蛋白质分子中的多肽链。l（3）断裂链内二硫键。断裂链内二硫键。l（4）分析多肽链的分析多肽链的N末端和末端和C末端。末端。l（5）测定多肽链的氨基酸组成。测定多肽链的氨基酸组成。l（6）多肽链部分裂解成肽段。多肽链部分裂解成肽段。l（7）测定各个肽段的氨基酸顺序测定各个肽段的氨基酸顺序l（8）确定肽段在多肽链中的顺序。确定肽段在多肽链中的顺序。l（9）确定多肽链中二硫键的位置。确定多肽链中二硫键的位置。一级结构的测定方法一级结构的

13、测定方法1.多肽链的分离多肽链的分离1）肽链的拆开）肽链的拆开蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多连接的多肽链，采用的化学处理方法有：肽链，采用的化学处理方法有：过甲酸氧化过甲酸氧化 巯基乙醇还原巯基乙醇还原 Clelands试剂的还原作用试剂的还原作用 稳定稳定SH基的方法：基的方法：（A）烷基化试剂使烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物基转变为稳定的硫醚衍生物稳定稳定SH基的方法：基的方法：（B）氨乙基化）氨乙基化l非共价结合非共价结合l尿素，尿素，SDS-PAGE，盐

14、酸胍，盐酸胍，高高浓度的盐浓度的盐2）末端分析）末端分析（1）N-末端测定末端测定A.二硝基氟苯法二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)（1）N-末端测定末端测定 B.氰酸盐法氰酸盐法异硫氰酸苯酯（异硫氰酸苯酯（PTC或或PITC）与）与N末端的末端的氨基发生的反应，生成氨基发生的反应，生成PTC钛钛,在弱酸在弱酸中自发环化转变成中自发环化转变成PTH衍生物。该试剂衍生物。该试剂称为称为Edman试剂。试剂。由于由于PTH衍生物从多肽链上脱落下来衍生物从多肽链上脱落下来对其余部分没有影响，所以常用来测定蛋对其余部分没有影响，所以常用来测定蛋白质的一级结构。白质的一级结构。（1）N-末端测定末端测定

15、 C.二甲基氨基萘磺酰氯法二甲基氨基萘磺酰氯法 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯氯DNS-Cl）可以与）可以与N-端氨基酸的游离氨基端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰作用，得到丹磺酰-肽。肽。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到性质，检测灵敏度可以达到1 10-9mol。氨肽酶法氨肽酶法l氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和时间测出酶水解所释放出

16、的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残末端残基顺序。基顺序。l最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。2）末端分析）末端分析（2）C-末端分析末端分析A.肼解法肼解法 无水肼无水肼NHNH2 2NHNH2 2 100 5-10h 100 5-10h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C C端游离氨基酸端游离氨基酸留在上清中。留在上清中。GlnGln（谷氨酰胺）、（谷氨酰

17、胺）、AsnAsn（天冬酰胺）、（天冬酰胺）、CysCys（半胱氨酸）、（半胱氨酸）、ArgArg（精氨酸）不能产（精氨酸）不能产生游离的羧基末端生游离的羧基末端aaaa。（2）C-末端分析末端分析B.羧肽酶水解法羧肽酶水解法 羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和和C。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是出的氨基酸主要是C

18、末端氨基酸。末端氨基酸。羧肽酶羧肽酶法测法测C C 末端末端羧肽酶法羧肽酶法羧肽酶法羧肽酶法羧肽酶羧肽酶A A：除除ProPro、ArgArg（精氨酸）、（精氨酸）、LysLys（赖氨酸）外的所有（赖氨酸）外的所有C C端氨基端氨基酸酸羧肽酶羧肽酶B B：只水解：只水解ArgArg、LysLysC-C-末端分析末端分析C.C-C.C-端氨基酸选择性氚标记法：端氨基酸选择性氚标记法：使用氚标记是测定使用氚标记是测定C-C-端氨基酸最好的办法，专端氨基酸最好的办法，专一性强，灵敏度高，但是这种方法不能用于一性强，灵敏度高，但是这种方法不能用于C-C-端端脯氨酸（脯氨酸（ProPro）和天冬氨酸（）

19、和天冬氨酸（AspAsp）还原法：利用硼氢化锂将还原法：利用硼氢化锂将C-C-端氨基酸还原成端氨基酸还原成氨基醇。然后碱多肽水解，用色谱法鉴定氨基醇。然后碱多肽水解，用色谱法鉴定氨基醇的类别。氨基醇的类别。酸水解酸水解酸水解酸水解 常用常用6 mol/L6 mol/L的盐酸或的盐酸或4 mol/L4 mol/L的硫酸（磺酸）在的硫酸（磺酸）在105-110105-110条件下进行水解，反应时间约条件下进行水解，反应时间约2020小时。近年来小时。近年来用用4 mol/L4 mol/L的甲基磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应的甲基磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应用。用。此法的优点是不容易引起水

20、解产物的消旋化。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是缺点是色氨酸色氨酸被沸酸完全破坏，被沸酸完全破坏，含有羟基的氨基酸如丝氨含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；酸或苏氨酸有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺天门冬酰胺和谷氨酰胺侧侧链的酰胺基被水解成了羧基。链的酰胺基被水解成了羧基。-COO+3）氨基酸组成分析）氨基酸组成分析碱水解碱水解碱水解碱水解 一般用一般用5 mol/L5 mol/L氢氧化钠于真空或充氮条件氢氧化钠于真空或充氮条件下进行，下进行，1101100 0C C煮沸煮沸10-2010-20小时。小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的由于水解过程中

21、许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化产物发生消旋化。该法的优点是该法的优点是色氨酸色氨酸在水解中不受破坏。在水解中不受破坏。酶法裂解酶法裂解酶法裂解酶法裂解胰蛋白酶胰蛋白酶 （赖氨酸）（赖氨酸）LysX LysX （精氨酸）（精氨酸）Arg X(X Pro)Arg X(X Pro)胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 （糜蛋白酶）（糜蛋白酶）（酪氨酸）（酪氨酸）TyrX TyrX（色氨酸）（色氨酸）TrpX TrpX （苯丙氨酸）（苯丙氨酸）PheX(X Pro)PheX(X Pro)嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶 X-Leu X-Leu（亮氨酸）（亮氨酸

22、）,Ile,Ile（异亮氨酸）（异亮氨酸）,Phe,Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）,TrpTrp（色氨酸），（色氨酸），ValVal（缬氨酸）（缬氨酸）,Tyr,Tyr（酪氨酸），（酪氨酸），MetMet（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）胃蛋白酶胃蛋白酶 Phe Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸），TrpTrp（色氨酸）（色氨酸）Tyr Tyr（酪氨酸），（酪氨酸），Leu Leu（亮氨酸）（亮氨酸）X X 不能水解不能水解ProPro羧基参与形成的肽键。羧基参与形成的肽键。GluGlu蛋白酶蛋白酶GluGlu（谷氨酸）（谷氨酸）XXArgArg蛋白酶蛋白酶 Arg Arg（精氨酸）（精氨酸）XXLysLy

23、s蛋白酶蛋白酶 XLys XLys（赖氨酸）（赖氨酸）ProPro蛋白酶蛋白酶 ProX ProX 氨基酸的分离和含量测定氨基酸的分离和含量测定氨基酸的颜色反应：紫色在570nm比色茚三酮与Pro生成黄色产物，在440nm比色层析层析l基于不同物质在流动相和固定相之间的分基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相流动相(液体或气体液体或气体)流经固定相流经固定相(多孔的固多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用分沿固定相移动的速度不同而分离。能用

24、于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。氨基酸的分离l色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。终达到分离的效果。l色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不间的分配会

25、不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。根据物质的分离机制，又在固定相上相互分离。根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。凝胶色谱、亲和色谱等类别。l 薄膜层析薄膜层析 将多肽链完全酸水解成游离氨基酸，然将多肽链完全酸水解成游离氨基酸，然后进行后进行Dansyl标记，聚酰胺薄膜层析，此标记，聚酰胺薄膜层析，此方法在蛋白质结构分析中是一种超微量的方法在蛋白质结构分析中是一种超微量的分析术，但此方法用于定量分析尚

26、不够准分析术，但此方法用于定量分析尚不够准确。确。氨基酸自动分析仪就是利用氨基酸自动分析仪就是利用离子交换离子交换的的方法方法l离子交换色谱法：利用离子交换原理和液离子交换色谱法：利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法，利用被分离阴离子的一种分离分析方法，利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应地应

27、用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。蛋白质等的分离。氨基酸自动分析仪就是利用氨基酸自动分析仪就是利用离子交换离子交换的方法的方法 若要测定某蛋白质样品的氨基酸组成，事先若要测定某蛋白质样品的氨基酸组成，事先把样品经酸水解，调节水解液的把样品经酸水解，调节水解液的pHpH为为3 3，使所有的，使所有的氨基酸都带负电荷，由于各种氨基酸侧链基团的氨基酸都带负电荷，由于各种氨基酸侧链基团的复杂性，各种复杂性，各种氨基酸所带的电荷强度差异比较大氨基酸所带的电荷强度差异比较大，pH3pH3时时,对于酸性氨基酸来说虽然也带正

28、电荷，但对于酸性氨基酸来说虽然也带正电荷，但由于谷氨酸由于谷氨酸-羧基和天冬氨酸的羧基和天冬氨酸的-羧基，都有羧基，都有不同程度的离解，导致整个分子偏中性，对于碱不同程度的离解，导致整个分子偏中性，对于碱性氨基酸来说，本来结合质子的能力就很强，此性氨基酸来说，本来结合质子的能力就很强，此时，它所带的正点荷强度就更大。时，它所带的正点荷强度就更大。酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺转变为相应的谷氨酸和天冬氨酸。为了分离效果转变为相应的谷氨酸和天冬氨酸。为了分离效果好，在洗脱过程中，使用不同好，在洗脱过程中，使用不同pHpH和离子强度的洗和离子强度的洗脱液

29、。经氨基酸自动分析仪洗脱下来的氨基酸，脱液。经氨基酸自动分析仪洗脱下来的氨基酸，按顺序进行染色，由记录仪自动描绘出各种氨基按顺序进行染色，由记录仪自动描绘出各种氨基酸的光吸收图谱。酸的光吸收图谱。3）氨基酸组成分析）氨基酸组成分析离子交换层析法离子交换层析法 l离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离

30、子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。的运动而运动，最终实现分离。各种氨基酸侧链基团的性质对于氨基酸与离子各种氨基酸侧链基团的性质对于氨基酸与离子交换树脂，结合的情况有相当复杂的影响。在氨基酸交换树脂，结合的情况有相当复杂的影响。在氨基酸自动分析仪的记录上可以看出：天冬氨

31、酸（自动分析仪的记录上可以看出：天冬氨酸（pIpI为为2.982.98）最先随洗脱液下来，赖氨酸（）最先随洗脱液下来，赖氨酸（pIpI为为9.749.74）最后）最后下来，三个中性氨基酸如下来，三个中性氨基酸如:甘氨酸（甘氨酸（pIpI为为5.975.97）、苏）、苏氨酸（氨酸（pIpI为为6.536.53）和亮氨酸（）和亮氨酸（pIpI为为5.985.98）洗脱的顺序）洗脱的顺序又如何呢又如何呢?苏氨酸应当带有较多的正电荷，与树脂结苏氨酸应当带有较多的正电荷，与树脂结合比较紧，不易被洗脱下来，但是由于羟基具有极性，合比较紧，不易被洗脱下来，但是由于羟基具有极性，减弱了树脂对氨基酸的吸引力。所

32、以反而比甘氨酸和减弱了树脂对氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸亮氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸侧链疏水性强，与树脂结合紧，后甘氨酸被洗脱下来。侧链疏水性强，与树脂结合紧，后甘氨酸被洗脱下来。综上所述：影响离子交换树脂分离氨基酸的因综上所述：影响离子交换树脂分离氨基酸的因素：素：（1 1）氨基酸分子所带的电荷；）氨基酸分子所带的电荷；（2 2）氨基酸分子的极性；）氨基酸分子的极性；（3 3）氨基酸分子的形状和大小。）氨基酸分子的形状和大小。3 3 特殊氨基酸的测定特殊氨基酸的测定 巯基：巯基：SH ,Cys SH ,Cys（半胱氨酸）（

33、半胱氨酸）特性：弱酸性特性：弱酸性 pKa=10.28 pKa=10.28；具有极强的还原性，两个；具有极强的还原性，两个半胱氨酸的巯基靠近脱氢形成二硫键。半胱氨酸的巯基靠近脱氢形成二硫键。pKa(电离程度电离程度)反应：反应：与卤代烃，如：苄氧、碘乙酰胺，反应生成稳与卤代烃，如：苄氧、碘乙酰胺，反应生成稳定的烃基衍生物。该反应常用于对巯基的保护。定的烃基衍生物。该反应常用于对巯基的保护。与各种金属形成稳定性不同的络合物，该反应与各种金属形成稳定性不同的络合物，该反应在研究蛋白质结构，制备蛋白质晶体过程中具有重要作用。在研究蛋白质结构，制备蛋白质晶体过程中具有重要作用。与某些重金属生成不溶性的

34、硫酸盐，导致蛋白与某些重金属生成不溶性的硫酸盐，导致蛋白质失活。质失活。与硝基苯甲酸二硫化合物（与硝基苯甲酸二硫化合物（DTNBDTNB）反应，生成）反应，生成的产物在的产物在412 nm412 nm处有强烈的光吸收，应用该反应可以用比色处有强烈的光吸收，应用该反应可以用比色法测定半胱氨酸的含量。法测定半胱氨酸的含量。在强氧化剂，如过氧甲酸的作用下，半胱氨酸在强氧化剂，如过氧甲酸的作用下，半胱氨酸的巯基和胱氨酸的二硫键都可被氧化生成磺基丙氨酸。的巯基和胱氨酸的二硫键都可被氧化生成磺基丙氨酸。羟基：羟基：SerSer（丝氨酸），（丝氨酸），ThrThr（苏氨酸），（苏氨酸），OHOH 特性：在一

35、般条件下，丝氨酸和苏氨酸分子中的羟基特性：在一般条件下，丝氨酸和苏氨酸分子中的羟基都不解离。都不解离。反应：反应：与酸作用生成酯，如丝氨酸磷酯，蛋白质的与酸作用生成酯，如丝氨酸磷酯，蛋白质的磷酸化绝大多数都发生在丝氨酸残基上。磷酸化绝大多数都发生在丝氨酸残基上。许多种酰化剂能够与酶活性中心的丝氨酸羟许多种酰化剂能够与酶活性中心的丝氨酸羟基作用，导致酶失活。基作用，导致酶失活。酪氨酸的酚基可与酪氨酸的酚基可与FolinFolin反应的基础，可作反应的基础，可作为蛋白质定量。为为蛋白质定量。为MillonMillon反应的基础。反应的基础。咪唑基：咪唑基：HisHis（组氨酸）（组氨酸）,特性：在

36、生理条件（特性：在生理条件（pH 7pH 7）下，组氨酸的咪唑基具有）下，组氨酸的咪唑基具有缓冲作用。这是因为咪唑基一侧的去质子化和另一侧的质子缓冲作用。这是因为咪唑基一侧的去质子化和另一侧的质子化作用同步进行。化作用同步进行。pH 6 pH 6 时，时，50 50质子化，质子化，pH 7 pH 7时，时，9090去去质子化。也就是说，在生理条件（质子化。也就是说，在生理条件（pH 7pH 7）下，组氨酸的咪唑）下，组氨酸的咪唑基既可以作为质子的受体，也可以作为质子的供体。因此组基既可以作为质子的受体，也可以作为质子的供体。因此组氨酸在酶催化作用中，起非常重要的作用。氨酸在酶催化作用中，起非常

37、重要的作用。反应：反应：Pauly反应（反应（对氨基苯磺酸的重氮盐对氨基苯磺酸的重氮盐，红色产物）胍基：胍基：ArgArg（精氨酸）（精氨酸）特性特性:具有很强的碱性。具有很强的碱性。反应：与板口试剂（萘酚、次溴酸盐）反应生成红色，反应：与板口试剂（萘酚、次溴酸盐）反应生成红色，该反应是鉴定精氨酸存在的定性反应。也可用于定量测定该反应是鉴定精氨酸存在的定性反应。也可用于定量测定甲硫基：甲硫基：Met Met（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）,S SCHCH3 3 特性：甲硫氨基酸侧链上的甲硫基是一个强的亲核中心，特性：甲硫氨基酸侧链上的甲硫基是一个强的亲核中心，容易与卤代烷发生亲核反应，生成烷基化产物。

38、该种产物容易与卤代烷发生亲核反应，生成烷基化产物。该种产物用巯基试剂处理可以除去烷基和原有的甲基，因此与带有用巯基试剂处理可以除去烷基和原有的甲基，因此与带有1414C C标记的碘甲烷反应，再用巯基试剂处理能够得到含有同标记的碘甲烷反应，再用巯基试剂处理能够得到含有同位素位素1414C C标记的甲硫氨酸。标记的甲硫氨酸。2.多肽链的降解多肽链的降解1）化学法）化学法l溴化氢法 溴化氰溴化氰lMet（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）X 溴化氢化学降解法其优点：溴化氢化学降解法其优点：一般蛋白质含甲硫氨酸较少，由此可获得大片段一般蛋白质含甲硫氨酸较少，由此可获得大片段专一性强专一性强产率高达产率高达80%以

39、上以上作用条件温和，在室温中用几到十几小时即可作用条件温和，在室温中用几到十几小时即可1）化学法）化学法羟胺法 这种方法近十年来开始受人注意，羟胺能专一性地裂这种方法近十年来开始受人注意，羟胺能专一性地裂解解Asn（天冬酰胺）（天冬酰胺）-Glu（谷氨酸）的肽键，酸性条件下（谷氨酸）的肽键，酸性条件下裂解裂解Asn-Pro肽键。已用于某些蛋白质的分析。肽键。已用于某些蛋白质的分析。lAsn（天冬酰胺）（天冬酰胺）Leu（亮氨酸）（亮氨酸）Asn（天冬酰胺）（天冬酰胺）Ala（丙氨酸）（丙氨酸）N-溴代琥珀酰亚胺法溴代琥珀酰亚胺法主要裂解主要裂解Tyr（酪氨酸）处的肽键，五十年代研究较（酪氨酸）

40、处的肽键，五十年代研究较多。但由于它也能断裂多。但由于它也能断裂Tyr（酪氨酸）（酪氨酸）His(组氨酸组氨酸)肽肽键，因此应用不广。键，因此应用不广。lNTCB（2-硝基硝基-5-硫氰苯甲酸）硫氰苯甲酸）lXCys（半胱氨酸）（半胱氨酸）XCys（半胱氨酸）键的裂解：（半胱氨酸）键的裂解：l2硝基硝基5硫氰苯甲酸（硫氰苯甲酸（NTCB）和）和2甲基甲基N1苯磺酰苯磺酰N4（溴乙酰）（溴乙酰）醌二亚酰胺（也称醌二亚酰胺（也称Cyssor，专切半胱氨酸），专切半胱氨酸）l亚碘酰基苯甲酸亚碘酰基苯甲酸Trp（色氨酸）（色氨酸）X产率产率70-100%1）化学法）化学法（2）部分酸水解法）部分酸水解

41、法Sanger在分析胰岛素的一级结构中采用了此在分析胰岛素的一级结构中采用了此法，即用法，即用0.1N盐酸在盐酸在110或用或用6N盐酸在盐酸在37水水解。这种部分酸水解的方法特异性不强，因此对解。这种部分酸水解的方法特异性不强，因此对大片段的蛋白质和肽均不合适。大片段的蛋白质和肽均不合适。优点：优点：专一性高，降解后的多肽容易纯化，产率高，副作用小专一性高，降解后的多肽容易纯化，产率高，副作用小。注意事项：注意事项：适合酶作用的温度和酸碱度（适合酶作用的温度和酸碱度（pHpH），反应时间。），反应时间。酶的用量，待裂解蛋白质的物理状态。缓冲溶液的离子酶的用量，待裂解蛋白质的物理状态。缓冲溶液

42、的离子强度等强度等酶裂解前需要作预备实验，掌握好各种条件。酶裂解前需要作预备实验，掌握好各种条件。2.多肽链的降解多肽链的降解 2）酶解法）酶解法胰胰蛋蛋白白酶酶Trypsin ：R1=R1=赖氨酸赖氨酸LysLys和精氨和精氨酸酸ArgArg侧链（专一性较强，水解侧链（专一性较强，水解速度快）。速度快）。糜糜蛋蛋白白酶酶或或胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶Chymotrypsin：（：（糜蛋糜蛋白酶白酶）对疏水性氨基酸水解速对疏水性氨基酸水解速度比较快。度比较快。R R1 1=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色氨色氨酸酸Trp,Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr;Tyr;亮氨亮氨酸酸LeuLeu，蛋氨酸，蛋

43、氨酸MetMet和组氨和组氨酸酸HisHis水解稍慢。水解稍慢。胃胃蛋蛋白白酶酶 水解专一性比较广。水解专一性比较广。Pepsin：R R1 1和和/或或R R2 2=苯苯丙氨酸丙氨酸Phe,Phe,色氨酸色氨酸Trp,Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr;Tyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu以及其它疏水性氨基酸以及其它疏水性氨基酸水解速度较快水解速度较快嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶 中性金属酶它的专一性取决于氨基参与形成的中性金属酶它的专一性取决于氨基参与形成的肽键。肽键。thermolysin：R R2 2=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色氨酸色氨酸Trp,Trp,酪氨酪氨酸酸Tyr;Tyr;亮氨酸亮氨酸

44、LeuLeu，异亮氨酸，异亮氨酸Ileu,Ileu,甲硫氨酸甲硫氨酸MetMet以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。l金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌Glu蛋白酶蛋白酶lGluXl谷氨酸羧基端参与形成的肽键。谷氨酸羧基端参与形成的肽键。l梭菌梭菌Arg蛋白酶蛋白酶(clostripain)lArgXl精氨酸羧基端参与形成的肽键。精氨酸羧基端参与形成的肽键。lLys蛋白酶蛋白酶lXLysl赖氨酸氨基端参与形成的肽键。赖氨酸氨基端参与形成的肽键。l小羊肾小羊肾Pro蛋白酶蛋白酶ProX胰蛋白酶胰蛋白酶（赖氨酸）（赖氨酸）LysX，（精氨酸），（精氨酸）ArgX(

45、XPro)胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）（糜蛋白酶）（酪氨酸）（酪氨酸）TyrX，（色氨酸），（色氨酸）TrpX（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）PheX(XPro)嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶X-Leu（亮氨酸）（亮氨酸）,Ile（异亮氨酸）（异亮氨酸）,Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）,Trp（色氨酸），（色氨酸），Val（缬氨酸）（缬氨酸）,Tyr（酪氨酸），（酪氨酸），Met（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）2）酶解法）酶解法酶法裂解酶法裂解酶法裂解酶法裂解胃蛋白酶胃蛋白酶 Phe Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸），TrpTrp（色氨酸）（色氨酸）Tyr Tyr（酪氨酸），（酪氨酸），Leu Leu（亮氨酸

46、）（亮氨酸）X X 不能水不能水解解ProPro羧基参与形成的肽键。羧基参与形成的肽键。GluGlu蛋白酶蛋白酶GluGlu（谷氨酸）（谷氨酸）XXArgArg蛋白酶蛋白酶 Arg Arg（精氨酸）（精氨酸）XXLysLys蛋白酶蛋白酶 XLys XLys（赖氨酸）（赖氨酸）ProPro蛋白酶蛋白酶 ProX ProX氨基酸的修饰与保护氨基酸的修饰与保护（1）赖氨酸的修饰）赖氨酸的修饰胰蛋白酶胰蛋白酶2）酶解法）酶解法（1）赖氨酸的修饰）赖氨酸的修饰蛋白质中的赖氨酸，经顺丁烯酰化作用后，被胰蛋白质中的赖氨酸，经顺丁烯酰化作用后，被胰蛋白酶水解蛋白酶水解 2）氨基酸的修饰与保护氨基酸的修饰与保护

47、（2）精氨酸的修饰胰蛋白酶胰蛋白酶2）酶解法）酶解法（3）半胱氨酸的修饰 l肽链的裂解和重组大致有三种情况：一种肽链的裂解和重组大致有三种情况：一种是非特异性裂解，如酸水解。由于裂解的是非特异性裂解，如酸水解。由于裂解的片段较小，造成分离的困难。因此这种非片段较小，造成分离的困难。因此这种非特异性裂解对大分子肽链是不适用的。第特异性裂解对大分子肽链是不适用的。第二种是特异性裂解，采用两种以上的专一二种是特异性裂解，采用两种以上的专一裂解，然后进行组合，这种方法一般也适裂解，然后进行组合，这种方法一般也适用于分子量小于用于分子量小于5万的蛋白质。第三种是逐万的蛋白质。第三种是逐步的专一裂解，首先

48、将某种氨基酸进行化步的专一裂解，首先将某种氨基酸进行化学修饰，使水解酶专一断裂某一种氨基酸，学修饰，使水解酶专一断裂某一种氨基酸，分成若干片段，然后解除化学封闭，再用分成若干片段，然后解除化学封闭，再用此酶裂解，使曾被封闭过的氨基酸断裂。此酶裂解，使曾被封闭过的氨基酸断裂。目前倾向于采用这种裂解方式。目前倾向于采用这种裂解方式。大部分肽段的分离主要通过大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法凝胶过滤法，由于大分子，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。单用凝胶过滤法分离肽段一般纯度不高，常需辅以溶解。单用凝胶过滤法分离肽段

49、一般纯度不高，常需辅以离子交换层析法离子交换层析法，大片段肽可用离子交换葡聚糖作载体，大片段肽可用离子交换葡聚糖作载体，小肽则多用小肽则多用Dowex-50等树脂。等树脂。小肽分离还常采用高压电泳与层析相结合的指纹图谱法，得小肽分离还常采用高压电泳与层析相结合的指纹图谱法，得到纯净肽到纯净肽 3 3 肽段的分离和纯度鉴定肽段的分离和纯度鉴定凝胶过滤法凝胶过滤法l凝胶过滤法又称分子排阻法，凝胶过滤法又称分子排阻法，这是一种高效分离这是一种高效分离纯化蛋白质的方法。原理是不同的蛋白质分子对纯化蛋白质的方法。原理是不同的蛋白质分子对固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结固定化在载体上的特殊配基具

50、有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价链接。将这种有配基的载体装入层析柱中，体共价链接。将这种有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其他蛋白质则流出柱外。被特异性结合在上，而其他蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体